Este protocolo puede determinar si los intestinos y las glándulas tiroides dificultan la propagación viral y puede ayudar en las evaluaciones de riesgo de los virus transmitidos por mosquitos transmitidos por Aedes aegypti. Nuestro protocolo incluía dos métodos de infección, la alimentación oral y la inyección intratorácica, que podrían evaluar eficazmente la competencia vectorial del arbovirus. Este protocolo podría aplicarse a infecciones adicionales por arbovirus en una variedad de mosquitos vectores, como el virus del dengue y la infección por el virus Zika en Aedes, y podría resultar un procedimiento practicable.
Demostrando el procedimiento estará Fei Wang, un asistente de investigación de mi laboratorio. Para realizar la alimentación artificial utilizando el sistema de alimentación artificial de mosquitos, corte las membranas de colágeno al tamaño adecuado y asegúrelas a los reservorios con las juntas tóricas. Agregue tres mililitros de la mezcla de virus y sangre a los depósitos y selle los depósitos con tapones de plástico para evitar fugas.
Coloque los vasos de plástico que contienen mosquitos en la guantera. Atornille los depósitos sellados en el alimentador FU1 y coloque un depósito en una taza. Encienda la unidad de alimentación y alimente a los mosquitos durante una hora.
Después de alimentarse, anestesie a los mosquitos con hielo durante varios segundos hasta que se desmayen. Vierta los mosquitos anestesiados en una placa de Petri colocada sobre hielo y cubra la tapa rápidamente. Escoja mosquitos hembra hinchados con fórceps y transfiéralos a nuevos vasos de plástico a 50 mosquitos hembra por taza.
Envuelva la taza con una malla de mosquitero cortada y cúbrala con una tapa con un agujero en el medio. Corte la esponja en trozos pequeños y colóquelos en las tazas. Agregue una solución de glucosa al 8% en la esponja con un gotero desechable de plástico.
Coloque las tazas que contienen mosquitos hembra en la incubadora a 27 grados centígrados al 80% de humedad durante 10 días. Reemplace una nueva esponja saturada de glucosa cada 72 horas. Para la inoculación intratorácica, prepare mosquitos hembra como se describe en el texto manuscrito.
Para preparar la dilución del virus infeccioso, retire las existencias de virus del congelador de 80 grados centígrados y descongélelas en hielo. Stock de virus diluido en una dilución de virus de 100 nanolitros que contiene de 100 a 500 unidades formadoras de placa de virus con medio RPMI 1640 que contiene 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Coloque la dilución del virus en hielo.
A continuación, prepare las agujas de microinyección utilizando un Puller 1000 con los parámetros del programa de extracción de agujas establecidos como índice de calor en 450, fuerza en g a 110, distancia en milímetros a uno y retraso en segundos a cero. Corte la punta de una aguja tirada con pinzas bajo un microscopio de disección con un aumento de 16x. Rellene la aguja con aceite mineral a través de una jeringa estéril desechable.
Coloque la aguja en el inyector siguiendo las instrucciones de la máquina. Inserte la aguja cuidadosamente en un tubo que contenga una dilución de virus infecciosos. Luego, presione el botón Rellenar para llenar aproximadamente cuatro microlitros de dilución de virus en la aguja.
Una vez que la aguja esté llena, no la toque ni la dañe. Escoja aproximadamente 50 mosquitos hembras anestesiados con pinzas y colóquelos en una placa de hielo. Coloque la placa debajo del inyector e inserte la aguja en la cavidad torácica del mosquito bajo un microscopio de disección.
Ajuste el volumen de inyección a 100 nanolitros y la velocidad a 50 nanolitros por segundo. Presione el botón Inyectar para permitir que la solución del virus fluya hacia el mosquito. Tras una inyección exitosa, el abdomen sobresale ligeramente.
Coloque el mosquito infectado en un nuevo vaso de plástico colocado en hielo. Cuando el número de mosquitos infectados sea suficiente, envuelva la taza con una malla de mosquitero cortada y cúbrala con la tapa. Para recolectar saliva de los mosquitos hembra infectados, vierta los mosquitos anestesiados en una placa de Petri colocada en hielo y cierre la tapa rápidamente.
Coloque las puntas de pipeta de 10 microlitros llenas de aceite de inmersión una al lado de la otra sobre el barro de goma. Elija los mosquitos hembra con pinzas y colóquelos en una placa de hielo. Quítale las patas y las alas con unas pinzas.
Coloque la parte bucal de un mosquito en cada punta de pipeta para recoger la saliva secretada en el aceite por los mosquitos a temperatura ambiente. Después de 45 a 60 minutos, coloque las puntas de la pipeta en tubos de 1,5 mililitros que contengan 200 microlitros de medio diluyente de virus. Centrifugar los tubos a 5.000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para expulsar la saliva en los tubos.
Almacene los tubos que contienen saliva a 80 grados centígrados para la posterior determinación de las velocidades de transmisión. Después de la recolección de saliva, disecciona los mosquitos hembra infectados. Usando pinzas, corte las cabezas de los mosquitos y coloque cada cabeza en un tubo individual que contenga 200 microlitros de RPMI 1640 medio.
Agarra el tórax con una pinza. Luego, agarre el penúltimo segmento del abdomen con otra pinza y saque la tripa. Limpie el intestino en busca de tejidos y órganos perdidos.
Lave el intestino con PBS y coloque cada intestino en un tubo individual que contenga 200 microlitros de RPMI 1640 medio. Almacene estos tubos a 80 grados centígrados para la posterior determinación de la propagación del virus y la tasa de infección. En este análisis representativo, se determinaron los ARN virales en el intestino, la cabeza y la saliva de los mosquitos hembra a los 10 días posteriores a la infección.
El título del virus del lago Ebinur en las entrañas, la cabeza y la saliva de los mosquitos inoculados intratorácicamente fue mayor que en los mosquitos infectados oralmente. La tasa de infección y diseminación para los mosquitos inoculados intratorácicamente fue del 100% y para los mosquitos infectados oralmente fue del 70% y 38,1%, respectivamente. La tasa de transmisión para los mosquitos inoculados intratorácica alcanzó hasta el 90%, pero para los mosquitos infectados oralmente fue solo del 4,8%Los mosquitos hembra hinchados fueron elegidos para mantener la consistencia, ya que la cantidad de alimentación afecta el contenido viral.
