Reconocemos al personal del Centro de Referencia Mundial para Virus Emergentes y Arbovirus (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzmán, Dr. Kenneth Plante, Dra. Jessica Plante, Dionna Scharton y Divya Mirchandani, por su incansable trabajo en la curaduría y provisión de muchas de las cepas virales utilizadas para nuestros experimentos de competencia vectorial y de otros grupos. El trabajo presentado fue financiado por el McLaughlin Fellowship Fund (SRA) y las subvenciones de los NIH AI120942 y AI121452.

Todos los procedimientos realizados en estos protocolos se realizaron en pleno cumplimiento de los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Rama Médica de la Universidad de Texas en Galveston.
1. Amplificar ZIKV en células Vero
<ol><li>Cultivar células Vero (CCL-81 o VeroE6) en la modificación de Dulbecco del medio esencial mínimo (DMEM) de Eagle suplementado con 10% v/v de suero fetal bovino inactivado térmicamente (FBS) y 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina (100 U/mL y 100 μg/mL, respectivamente) en una incubadora humidificada de 37 °C con 5% de CO2 a entre 80-90% de confluencia en un matraz de cultivo tisular de 150 cm2.</li>
	<li>En un gabinete de bioseguridad (BSC), retire el medio y deséchelo en lejía al 10% o en una dilución de trabajo de amonio cuaternario dual(Tabla de materiales). Inocular inmediatamente la monocapa con 1 ml de material viral, con el objetivo de 0,1-1 partículas virales infecciosas por célula. Agitar el matraz inmediatamente de tal manera que el inóculo entre en contacto con la monocapa en su totalidad.</li>
	<li>Rellene el medio a un volumen de 5 ml usando DMEM suplementado con 2% v / v FBS inactivado por calor y 1% (v / v) penicilina-estreptomicina. A continuación, mueva el matraz a la incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO2 durante 60 min.</li>
	<li>Retire el matraz de la incubadora y llévelo a un BSC. Agregue un medio adicional a un volumen total de 15 ml usando DMEM suplementado con FBS inactivado por calor al 2% v / v y 1% (v / v) penicilina-estreptomicina. Mueva el matraz a una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO2.</li>
	<li>Examine el matraz diariamente bajo microscopía de contraste de fase para detectar evidencia de efectos citopáticos (CPE). Proceda a la cosecha viral (paso 1.7) cuando solo aproximadamente el 40-50% de las células permanecen en la monocapa, generalmente 3-5 días después de la infección, dependiendo de la cepa de ZIKV que se utilice.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante y colóquelo en un vial cónico de 50 ml. Clarificar el sobrenadante de residuos celulares por centrifugación (3.500 x g durante 20 min). NOTA: Si varios matraces se infectaron de manera idéntica, los sobrenadantes de múltiples matraces se pueden combinar en tubos cónicos de 50 ml.</li>
	<li>Retire el sobrenadante del tubo cónico de 50 ml a uno nuevo, teniendo cuidado de no interrumpir el pellet. Complemente el sobrenadante con FBS inactivado por calor a una concentración final del 30% (v / v). Alícuota esta mezcla en tubos de tapón de rosca individuales y congele a -80 °C hasta su uso.</li>
</ol>2. Preparación de harinas de sangre artificiales
<ol><li>El día en que los mosquitos deben exponerse a las harinas de sangre infecciosas, encienda la fuente de energía (Tabla de Materiales) en una instalación de contención de artrópodos de tal manera que las unidades de alimentación (Tabla de Materiales) estén precalentadas para el momento en que los mosquitos estén preparados para la exposición.</li>
	<li>Prepare harinas de sangre artificiales utilizando uno de los métodos que se describen a continuación.<ol>
<li>Método 1: Combinar sangre humana recién cosechada (en el plazo de una semana) citrada o heparinizada comprada comercialmente 1:1 v/v con material viral (preparado como se describe en la sección 1). NOTA: Este método depende de la ausencia de anticuerpos contra la familia virus/virus presentes en la sangre.</li>
		<li>Si no se puede confirmar la ausencia de anticuerpos o se sabe que la fuente de sangre tiene una exposición previa al flavivirus, lave y empaque manualmente los eritrocitos.<ol>
<li>En un BSC, agregue 30 ml de sangre humana entera a un tubo cónico de 50 ml y rellene hasta 50 ml con solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
			<li>Centrifugadora a 3.500 x g durante 20 min.</li>
			<li>Aspire el sobrenadante, ya sea vertiendo suavemente en una bandeja que contenga lejía al 10% o diluyendo de amonio cuaternario dual, teniendo cuidado de no desechar el gránulo de eritrocitos.</li>
			<li>Agregue 10 ml de PBS y golpee suavemente la parte inferior del tubo cónico contra la parte inferior del BSC de modo que el gránulo de eritrocitos se haya reconstituido. Lleve el volumen de la suspensión hasta 50 ml con PBS. Mezclar por inversión suave.</li>
			<li>Repita los pasos 2.2.2.1−2.2.2.4 un total de 4−6x. Confirme que el sobrenadante es transparente o solo ligeramente rosado y ya no es opaco. Retire todo el sobrenadante con una pipeta serológica. Resuspend el pellet de eritrocitos en 1−2 mL de PBS.</li>
			<li>Ensamblar la harina de sangre: 350 μL de eritrocitos empaquetados, 100 μL de sacarosa al 10%, 200 μL de FBS inactivado por calor, 900 μM de ATP recombinante y 2 ml de stock de virus adecuadamente diluido utilizando DMEM suplementado con FBS inactivado por calor al 2% v / v y 1% (v / v) penicilina-estreptomicina.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Superponga una unidad de reservorio estándar de 3 ml(Tabla de materiales)con la piel de un ratón no infectado (otras opciones incluyen película de parafina, membranas colágenas o envoltura de salchicha).</li>
	<li>Coloque el depósito cubierto sobre toallas de papel blanco. Agregue ~ 2 ml de harina de sangre infecciosa al reservorio 1 ml a la vez. Inspeccione la toalla debajo del comedero en busca de cualquier evidencia de fuga. Si hay fugas, recupere la harina de sangre de los comederos y deseche las cubiertas. Selle los alimentadores con tapones. Una vez más confirme que no hay fugas presentes.</li>
</ol>3. Backtitración de harinas de sangre/ensayo de placa
<ol><li>Usando el volumen restante de la harina de sangre preparada, realice una serie de dilución en serie de 10x (es decir, 6 diluciones, que van desde diluidas de 10x a 1,000,000x) usando DMEM suplementado con 2% v / v FBS inactivado por calor y 1% (v / v) penicilina-estreptomicina.</li>
	<li>Alícuota 100 μL de las diluciones en los pocillos de 24 o 12 placas de pocillos desde las más diluidas hasta las más concentradas.</li>
	<li>Incubar durante 1 h en una incubadora de 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Al final del período de incubación de 1 h, devuelva las placas al BSC y agregue 1 ml o 2 ml de superposición de metilcelulosa a las placas de 24 pocillos o 12 pocillos, correspondientemente.</li>
	<li>Coloque las placas superpuestas en una incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incube durante 3-7 días (dependiente de la cepa del virus).</li>
	<li>Después de la incubación, retire las placas de la incubadora y llévelas al BSC. Deseche la superposición de metilcelulosa en una bandeja que contenga lejía al 10% o desinfectante de amonio cuaternario dual.</li>
	<li>Lave cada pozo 2 veces con PBS, desechando el lavado en una bandeja que contenga 10% de lejía o amonio cuaternario dual.</li>
	<li>Agregue ~ 1 ml de metanol: acetona (1: 1 v: v) y permita que las células se fijen en la placa durante al menos 30 minutos en el BSC a temperatura ambiente (RT). Desechar metanol:acetona según la política institucional sobre residuos orgánicos.</li>
	<li>Visualice ZIKV utilizando uno de los dos métodos que se describen a continuación.<ol>
<li>Después de la eliminación de metanol: acetona, manche inmediatamente con una solución violeta cristalina (0.25% p/v en metanol al 30%) durante 5 min. Enjuague 2 veces en agua del grifo y deje secar, luego visualice directamente a ojo para detectar evidencia de placas o destrucción de monocapa.</li>
		<li>Alternativamente, realice un ensayo de formación de enfoque.<ol>
<li>Deje que las placas se sequen al aire hasta que no quede ningún fijador orgánico. NOTA: Esto debería tomar ~ 2-3 h fuera del BSC, pero puede acelerarse mediante el secado al aire en un BSC o una campana de humos químicos.</li>
			<li>Lave cada pozo 3x durante 15 min cada uno en PBS no estéril (Mg2+ y Ca2+ libres) en un balancín de placa orbital. Retire PBS y agregue 1 ml de solución de bloqueo (PBS + 3% FBS) a cada pozo y roca durante 15 minutos en RT.</li>
			<li>Añadir 100 μL por pocillo de α-ZIKV o anticuerpo primario contra el α-flavivirus (por ejemplo, hibridoma del grupo flavivirus D1-4G2-4-15 [4G2]) a una dilución de 1:2.000 en solución de bloqueo. Incubar con balanceo durante un mínimo de 4 h (preferiblemente durante la noche, no superior a 18 h) en RT.</li>
			<li>Retire el anticuerpo primario y lave 3 veces durante 15 minutos cada una con PBS (Mg2+ y Ca2+ libres) en un balancín de placa orbitaria.</li>
			<li>Añadir 100 μL por pocillo del anticuerpo secundario (marcado con HRP de cabra α ratón) diluido 1:2.000 en tampón de bloqueo. Incubar con balanceo durante 1 h en RT.</li>
			<li>Lave 3x durante 15 min cada uno con PBS (Mg2+ y Ca2+ libres) en un balancín de placa orbital.</li>
			<li>Alícuota 100 μL de reactivo de desarrollo de sustrato (Tabla de Materiales) por pozo. Placas de roca en RT durante 15 min.</li>
			<li>Detenga la reacción al desarrollo de focos / placas eliminando el sustrato y enjuagando las placas 2x con agua del grifo. Vierta el agua del grifo y deje que las placas se sequen al aire antes de cuantificar.</li>
			<li>Contar los focos virales para determinar el número de FFU presentes en la muestra dada.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Administración de harinas de sangre
<ol><li>Use mosquitos Ae. aegypti 2-4 días después de la eclosión. Clasifique los mosquitos hembra en cartones de cartón de 0,5 L con tapas mosquitectadas y privarlos de azúcar (generalmente 36-48 h antes de la harina de sangre infecciosa). Proporcione agua ad libitum a través de bolas de algodón saturadas de agua.</li>
	<li>Retire las bolas de algodón saturadas de agua en la mañana en que los mosquitos estarán expuestos a la harina de sangre infecciosa.</li>
	<li>Conecte los depósitos que contienen harinas de sangre artificiales a los cables de la unidad de alimentación dentro de una guantera de plástico transparente.</li>
	<li>Dentro de la guantera, coloque un cartón de cartón de 0.5 L con una tapa apantallada, que contenga 50-100 mosquitos Ae. aegypti hambrientos, debajo de la unidad de alimentación conectada al reservorio. NOTA: Los mosquitos hambrientos apropiadamente generalmente se alimentarán dentro de los 20 minutos. La alimentación puede prolongarse según sea necesario para aumentar el tamaño de la muestra en poblaciones más lentas, aunque esto no debe extenderse más allá de 60 min, porque el título viral (ZIKV) puede disminuir dentro del alimentador después de ~ 60 min.</li>
	<li>Al finalizar la alimentación, retire el reservorio y sumérjalo en lejía al 10% recién hecha.</li>
	<li>Anestesiar en frío a los mosquitos mediante incubación durante 30 s a -20 °C o durante 5 min en un refrigerador.</li>
	<li>Dentro de la guantera, vierta los mosquitos en una placa de Petri sobre hielo. Cuente y clasifique las hembras congestionadas de mosquitos no comprometidos. Deseche los mosquitos no comprometidos por inmersión en un tubo cónico de 50 ml lleno de etanol al 70%. Mientras los mosquitos todavía están anestesiados, viértalos de nuevo en el cartón de cartón de 0,5 L y cúbralos rápidamente con la pantalla y la tapa. Recorte el exceso de malla de la pantalla de la caja de cartón y asegure la malla con cinta adhesiva.</li>
	<li>Agregue una bola de algodón saturada con sacarosa acuosa estéril filtrada al 10% a la pantalla de cada caja. Coloque todos los cartones de mosquitos en un recipiente secundario de plástico grande con una esponja húmeda para mantener la humedad.</li>
	<li>Coloque el recipiente secundario que contenga cajas de mosquitos en una incubadora con una temperatura de 27 ± 1 ° C (o según corresponda para simular condiciones en la región de interés) con un 80% de ± 10% de humedad relativa y un ciclo de luz: oscuridad de 16: 8). Mantenga los mosquitos con acceso ad libitum al 10% de sacarosa hasta la finalización de los experimentos.</li>
</ol>5. Adquisición y procesamiento de muestras
<ol><li>En los días específicos posteriores a la alimentación, aspire un número predeterminado de mosquitos de los cartones apropiados utilizando un aspirador mecánico dentro de una guantera. Cubra el tubo de recolección con una ronda de algodón después de adquirir el número requerido de mosquitos.</li>
	<li>Anestesiar en frío a los mosquitos mediante incubación durante 30 segundos a -20 °C o durante 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Dentro de la guantera, vierta los mosquitos en una placa de Petri sobre hielo. Usando dos pares de fórceps, retire las seis patas de cada mosquito y colóquelas en un tubo de microcentrífuga de fondo redondo preetiquetado de 2 ml que contenga un rodamiento de bolas de acero inoxidable esterilizado (7/32") y 500 μL de medios de recolección de mosquitos (MCM) compuestos de DMEM, FBS al 2%, penicilina-estreptomicina al 1% y anfotericina de 2.5 μg / ml.</li>
	<li>Coloque suavemente el mosquito sobre una gota de aceite mineral para contenerlo, teniendo cuidado de no permitir ningún contacto entre el aceite y la cabeza y la probóscide del mosquito.</li>
	<li>Inserte la probóscide del mosquito en una punta de pipeta de 10 μL llena de 10 μL de FBS inactivado por calor. NOTA: Alternativamente, la pipeta se puede llenar con sacarosa, sangre o aceite mineral. El aceite permite la visualización directa de las burbujas de saliva a través de la microscopía de luz.</li>
	<li>Deje que el mosquito saliva durante 30 minutos. Expulse la punta de la micropipeta que contiene FBS + saliva en un tubo de microcentrífuga que contiene 100 μL de MCM, luego coloque la carcasa en un tubo de microcentrífuga inferior redondo separado de 2 ml que contenga un rodamiento de bolas de acero esterilizado y 500 μL de MCM. Asegúrese de que los tubos utilizados para los cuerpos, las piernas y la saliva estén etiquetados para que quede claro que las tres muestras se originaron en el mismo mosquito.</li>
	<li>Mientras los mosquitos están salivando, realice los pasos 5.3-5.5 en los mosquitos restantes.</li>
	<li>Transportar los tubos que contienen los cuerpos y las patas a un dispositivo de homogeneización de tejido de fresado de cuentas contenido dentro de un BSC. Triturar todas las muestras de cuerpo y piernas a 26 Hz durante 5 minutos para liberar partículas virales en el sobrenadante. Clarificar todas las muestras por centrifugación a 200 x g durante 5 min para granular los residuos celulares. NOTA: En este punto, las muestras se pueden congelar a -80 ° C o ensayarse inmediatamente.</li>
</ol>6. Detección de ZIKV por ensayo infeccioso
<ol><li>En un BSC, prepare 24 placas de cultivo de tejido de pozo con células Vero (105 células por pozo) 24 h antes del inicio del ensayo infeccioso. Etiquete cada pozo con la identidad de un solo mosquito/muestra.</li>
	<li>Si las muestras se congelaron a -80 °C, deje que se descongelen.</li>
	<li>Retire los medios de las placas celulares Vero antes de la inoculación con muestras de una placa a la vez.</li>
	<li>Para muestras que contengan cuerpos o patas, alícuota cuidadosamente 100 μL de sobrenadante clarificado en cada pozo, teniendo cuidado de no molestar los restos de células de mosquitos del pellet. NOTA: Las muestras de saliva se pueden diluir 1: 1 (v / v) con MCM antes de la inoculación en las células para conservar las muestras para su posterior titulación, si es necesario.</li>
	<li>Mueva las placas a una incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incube durante 1 h.</li>
	<li>Devuelva las placas al BSC y agregue ~ 1 ml de superposición de metilcelulosa a cada pozo. Coloque las placas superpuestas de nuevo en una incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incube durante 3-7 días (dependiente del virus/ cepa).</li>
	<li>Realice la fijación y la visualización como se describe en los pasos 3.6 a 3.9.</li>
	<li>Con respecto a la puntuación a través de un ensayo de formación de enfoque, cuantifique los pozos positivos mediante un examen bajo un microscopio de luz. La detección de tinción intracitoplasmática de células en un pozo indica la presencia del virus. Las muestras se puntúan únicamente como foco positivo o negativo.</li>
</ol>

<ol>
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X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island,+China.">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li><li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains.">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li><li>Mayilsamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+Long+Viability+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+Eggs+Stored+Under+Normal+Room+Condition.">Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition.</a> Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).</li><li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas.">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).</li><li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fever+from+the+forest:+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health.">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li><li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge.">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos descritos aquí proporcionan un flujo de trabajo generalizado para realizar análisis de competencia vectorial. Como marco general, muchas de estas metodologías se conservan a lo largo de la literatura. Sin embargo, hay un espacio sustancial para las modificaciones (revisado en Azar y Weaver1). Se sabe que el virus (por ejemplo, el linaje viral, el almacenamiento del virus de desafío, la historia del paso viral), la entomología (por ejemplo, la colonización de laboratorio de las poblaciones de mosquitos, la inmunidad innata, el microbioma / viroma del mosquito) y las variables experimentales (por ejemplo, la composición de la harina de sangre, la alimentación secuencial de la sangre y la temperatura de incubación) afectan la competencia del vector. La variabilidad metodológica en los estudios de competencia ha demostrado ser problemática en el contexto del brote de ZIKV porque ha impedido los metanálisis formales1,33.
Dentro de esta metodología general, no se puede exagerar la importancia de la inanición apropiada de mosquitos y la composición de la harina de sangre. Se sabe que la deshidratación impulsa el comportamiento de alimentación sanguínea de los mosquitos en los paradigmas de laboratorio34,lo que subraya el valor de la inanición de azúcar y agua antes de ofrecer una harina de sangre infecciosa. Si bien la privación de azúcar durante 36-48 h y agua durante 2-4 h antes de la exposición a la harina de sangre es bien tolerada por Ae. aegypti,vale la pena señalar que estos mosquitos son notoriamente fáciles de trabajar en condiciones de laboratorio2. Tales regímenes agresivos de inanición pueden no ser tan bien tolerados por otras especies de mosquitos, lo que requiere cierto grado de optimización interna. Del mismo modo, el contenido de harina de sangre puede ser informado por la preferencia del huésped. Por ejemplo, el uso de sangre humana para preparar una harina de sangre para mosquitos antropófilos como Ae. aegypti es completamente apropiado, pero las harinas de sangre humanas hechas para especies ornifílicas como Culex quinquefasciatus pueden resultar menos efectivas35. Además, con respecto al ensamblaje de harina de sangre, el uso de productos sanguíneos relativamente frescos es muy recomendable para minimizar la hemólisis de los eritrocitos.
Una de las mayores limitaciones de la evaluación de la competencia vectorial en su conjunto y de los procedimientos descritos en este documento es que estos estudios se limitan en gran medida a investigar virus utilizando mosquitos que pueden mantenerse en condiciones de laboratorio. Ae. aegypti,si bien es un vector muy relevante para multitud de patógenos de importancia clínica, también pasa por ser uno de los mosquitos más fáciles de criar y mantener en colonias de laboratorio1,31,36,37. Como era de esperar, la competencia de las poblaciones de Ae. aegypti es a menudo la mejor caracterizada entre los mosquitos vectores comunes2. Esto es particularmente problemático en el contexto de los arbovirus que mantienen ciclos de transmisión enzoótica y urbana38,39,40, ya que la competencia vectorial generalmente solo se lleva a cabo en el contexto de los mosquitos urbanos más manejables.

La competencia vectorial se define como la capacidad a nivel de especie, población, e incluso un individuo, de un artrópodo dado, como un mosquito, garrapata o flebotomina, para adquirir y transmitir un agente biológicamente con replicación o desarrollo en el artrópodo1,2. Con respecto a los mosquitos y los virus transmitidos por artrópodos (es decir, arbovirus), el agente es absorbido de un huésped virémico por un mosquito hembra. Después de la ingestión, el virus debe infectar productivamente a una de una pequeña población de células epiteliales del intestino medio3,superando diversos obstáculos fisiológicos como la degradación proteolítica por enzimas digestivas, la presencia de la microbiota (barrera de infección del intestino medio, o MIB) y la matriz peritrófica secretada. La infección del epitelio del intestino medio debe ser seguida por la replicación del virus y el eventual escape del intestino medio al sistema circulatorio abierto del mosquito, o hemolinfa, que representa el inicio de una infección diseminada que supera la barrera de escape del intestino medio (MEB). En este punto, el virus puede establecer infecciones de tejidos secundarios (por ejemplo, nervios, músculos y cuerpos grasos) y continuar replicándose, aunque dicha replicación secundaria puede no ser estrictamente necesaria para que el virus infecte las células acinares de las glándulas salivales (superando la barrera de infección de las glándulas salivales). La salida de las células acinares de la glándula salival en sus cavidades apicales y luego el movimiento hacia el conducto salival permite la inoculación del virus en huéspedes posteriores al morder, y completa el ciclo de transmisión1,2,4,5,6,7.
Dado este mecanismo de propagación bien caracterizado y generalmente conservado dentro de un mosquito vector, las evaluaciones de competencia de vector de laboratorio son a menudo metodológicamente similares, aunque existen diferencias en los protocolos1,2. En general, después de la exposición oral al virus, los mosquitos se diseccionan para que los tejidos individuales como el intestino medio, las piernas, los ovarios o las glándulas salivales puedan ser evaluados para detectar infección viral, infección diseminada, infección diseminada / transmisión transovarial potencial e infección diseminada / competencia de transmisión potencial, respectivamente8. La mera presencia de un virus en las glándulas salivales, sin embargo, no es evidencia definitiva de capacidad de transmisión, dada la evidencia de una barrera de escape/salida de glándulas salivales (SGEB) en algunas combinaciones vector/virus1,2,4,5,7,9. El método estándar para demostrar la competencia de transmisión sigue siendo la transmisión de mosquitos a un animal susceptible10,11,12. Sin embargo, dado que para muchos arbovirus esto requiere el uso de modelos murinos inmunocomprometidos13,14,15,16, este método es a menudo prohibitivo. Una alternativa de uso común es la recolección de la saliva del mosquito, que puede analizarse mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) o un ensayo infeccioso para demostrar la presencia del genoma viral o partículas infecciosas, respectivamente. Vale la pena señalar que tales métodos de recolección de saliva in vitro pueden sobreestimar12 o subestimar17 la cantidad de virus depositado durante la alimentación in vivo, lo que indica que dichos datos deben interpretarse con precaución. Sin embargo, el método in vitro es muy valioso cuando se analiza desde la perspectiva de la mera presencia de virus en la saliva, lo que indica un potencial de transmisión.
Existen dos enfoques principales para determinar el papel de los mosquitos vectores en los brotes de enfermedades arbovirales. El primer método implica la vigilancia de campo, en la que los mosquitos se recogen en el contexto de la transmisión activa18,19,20,21,22,23,24. Sin embargo, dado que las tasas de infección suelen ser bastante bajas (por ejemplo, la tasa de infección estimada del 0,061% de mosquitos en áreas de circulación activa del virus del Zika (ZIKV) en los Estados Unidos21), la incriminación de posibles especies de vectores puede estar muy sesgada por la metodología de captura25,26 y el azar aleatorio (por ejemplo, tomar muestras de un individuo infectado de 1,600 no infectados)21 . Teniendo esto en cuenta, un estudio dado puede no adquirir suficientes mosquitos tanto en números brutos como en diversidad de especies para muestrear con precisión los mosquitos involucrados en la transmisión. Por el contrario, los análisis de competencia vectorial se llevan a cabo en un entorno de laboratorio, lo que permite un control estricto de parámetros como la dosis oral. Aunque no son totalmente capaces de representar la verdadera complejidad de la infección por mosquitos y la capacidad de transmisión en un entorno de campo, estas evaluaciones de laboratorio siguen siendo herramientas poderosas en el campo de la arbovirología.
Basándonos en varios análisis de competencia vectorial con ZIKV en varias especies de mosquitos, poblaciones y métodos27,28,29,30, 31,32,así como una revisión reciente de las evaluaciones de competencia vectorial1,describimos aquí varios de los protocolos asociados con un flujo de trabajo típico de competencia vectorial. En estos experimentos, tres poblaciones de Ae. aegypti de las Américas (la ciudad de Salvador, Brasil; la República Dominicana; y el valle inferior del Río Grande, TX, EE. UU.) fueron expuestas a una sola cepa de ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) a dosis de 4, 5 o 6 log10 unidades formadoras de enfoque (FFU) / ml por medio de harinas de sangre artificiales. Posteriormente, se analizaron en busca de evidencia de infección, infección diseminada y competencia de transmisión después de varios tiempos de incubación extrínseca (2, 4, 7, 10 y 14 días) mediante disección y un ensayo infeccioso basado en cultivo celular. Aunque el flujo de trabajo / protocolos actuales están optimizados para ZIKV, muchos elementos son directamente traducibles a otros arbovirus transmitidos por mosquitos en los niveles de contención y bioseguridad de artrópodos 2 y 3 (ACL / BSL2 o ACL / BSL3).

<table><tbody><tr><td>3mL Standard Reservoir</td><td>R37P30</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>7/32&quot; Stainless Steel 440 Grade C Balls</td><td>4RJH9</td><td>Grainger</td><td>Grinding Media</td></tr><tr><td>Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case</td><td>A16-P4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture</td><td>A6419-1G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15</td><td>MAB10216</td><td>MilliporeSigma</td><td>Primary Antibody for focus forming assay</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle</td><td>5450-0011</td><td>KPL/Seracare</td><td>Secondary Antibody for focus forming assay</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>NC0427256</td><td>FisherScientific</td><td>Decontamination</td></tr><tr><td>Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50</td><td>10-126-34</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning</td><td>07-200-740</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning</td><td>07-200-91</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>C0775-100G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Stain</td></tr><tr><td>Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case</td><td>05-402-7</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-70C</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-49A</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-20</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case</td><td>13-675-15B</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-30</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-22</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td><td>08-772B</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL</td><td>S11150</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides</td><td>12-550-A3</td><td>FisherScientific</td><td>Immobilization of Mosquitos</td></tr><tr><td>FU1 Feeder</td><td>FU1-0</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; feeding units</td></tr><tr><td>Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles</td><td>140-040-182</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250&amp;mu;g/mL, 50mL/Bottle</td><td>15-290-026</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case</td><td>15-140-163</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles</td><td>25-200-114</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles</td><td>11-965-118</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit</td><td>7203706</td><td>Lampire</td><td>Bloodmeal preparation</td></tr><tr><td>InsectaVac Aspirator</td><td>2809B</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case</td><td>A412-4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 &amp;deg;C), 250g/Bottle</td><td>M0512-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Micro-chem Plus Disinfectant Detergent</td><td>C849T34</td><td>Thomas Scientific</td><td>Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium</td></tr><tr><td>Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology</td><td>M5904-5X5ML</td><td>MilliporeSigma</td><td>Immobilization of Mosquitos</td></tr><tr><td>O-rings</td><td>OR37-25</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Plastic Plugs</td><td>PP5-250</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>PS6 Power Unit (110-120V)</td><td>PS6120</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; power source</td></tr><tr><td>Rubis Forceps, Offset blades, superfine points</td><td>4525</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case</td><td>50-809-242</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Sucrose, BioUltra, for molecular biology</td><td>84097-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000&amp;mu;L Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case</td><td>21-402-487</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-486</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-484</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-482</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>85300</td><td>QIAGEN</td><td>Homogenization</td></tr><tr><td>TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL</td><td>5510-0030</td><td>Seracare</td><td>Developing solution for focus forming assay</td></tr><tr><td>Vero</td><td>CCL-81</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td></tr><tr><td>Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]</td><td>CRL-1586</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td></tr></tbody></table>

vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus

Los procedimientos presentados describen una metodología generalizada para infectar a los mosquitos Aedes aegypti con el virus del Zika en condiciones de laboratorio para determinar la tasa de infección, la infección diseminada y la posible transmisión del virus en la población de mosquitos en cuestión. Estos procedimientos se utilizan ampliamente con diversas modificaciones en las evaluaciones de competencias vectoriales a nivel mundial. Son importantes para determinar el papel potencial que un mosquito dado (es decir, especie, población, individuo) puede desempeñar en la transmisión de un agente determinado.

Tres poblaciones de Ae. aegypti de las Américas (Salvador, Brasil; República Dominicana; y el Valle del Río Grande, TX, EE.UU.) estuvieron expuestas a una cepa de brote de ZIKV de las Américas (ZIKV Mex 1-7, Estado de Chiapas, México, 2015) en un rango de títulos de harina de sangre (4, 5 y 6 log10 FFU / ml) presentados en una harina artificial de sangre a base de eritrocitos humanos lavados. En los días 2, 4, 7, 10 y 14 después de la infección, se procesaron subconjuntos de mosquitos para determinar las tasas de infección, diseminación y transmisión potencial.
En un título de harina de sangre de 4 log10 FFU/mL de ZIKV Mex 1−7, Ae. aegypti de Salvador, Brasil se infectaron a tasas de 12,5% y 11,1% después de 4 y 14 días de incubación extrínseca, respectivamente, sin evidencia de infección diseminada observada en las piernas ensayadas, y sin virus detectado en la saliva (Figura 1a). El aumento del título a 5 log10 FFU / ml resultó en un aumento marginal de la infectividad con tasas de 22.2%, 33.3% y 22.2% en los días 4, 10 y 14 después de la infección, respectivamente. Similar a lo observado en la cohorte expuesta a 4 log10 FFU/mL, no se observaron infecciones diseminadas ni competencia de transmisión en ningún punto temporal (Figura 1b). En el título examinado más alto (6 log10 FFU/mL) no se identificaron infecciones después de 2 días de incubación, pero se observaron infecciones en todos los demás puntos temporales, alcanzando un máximo del 88,9% a los 10 días de incubación extrínseca. El ZIKV se detectó en las patas de los mosquitos examinados a los 10 y 14 días después de la infección (22,2% y 66,7%, respectivamente), lo que indica que el ZIKV se había diseminado en el hemocoel, aunque se observó ZIKV infeccioso en la saliva en estos puntos de tiempo(Figura 1c).
La población de Ae. aegypti de la República Dominicana demostró ser la más susceptible a la infección por ZIKV y fue competente en la transmisión después de la exposición a todos los títulos de harina de sangre analizados. Se observó algún nivel de infección en todos los puntos temporales en las tres dosis probadas, con la tasa más baja observada 2 días después de la infección a 4 log10 FFU / ml (25%)(Figura 1d). Con títulos de harina de sangre de 5 log10 y 6 log10 FFU/mL condiciones tasas de infección alcanzó su punto máximo en 100%, con 100% de infección observada tan pronto como 4 días después de la infección en la población de mosquitos expuestos a 6 log10 FFU/mL ZIKV(Figura 1e,f). Los mosquitos alimentados con las tres dosis demostraron diseminación a los 7 días después de la infección, alcanzando un máximo de 44,4%(4 log 10 FFU/mL, 14 días después de la infección), 88,9%(5 log 10 FFU/mL, 1 y 14 días después de la infección) y 100% (6 log10 FFU/mL, 10 días después de la infección). Se observó competencia de transmisión después de las tres dosis (11,1%, 22,2% y 22,2% a 4, 5 y 6 log10 FFU/ml respectivamente), pero solo después de un período de incubación extrínseca (EIP) de 14 días(Figura 1d−f).
La población de Ae. aegypti del Valle del Río Grande, TX, demostró ser relativamente refractaria a la infección por ZIKV. Los mosquitos expuestos a títulos de harina de sangre de 4 log10 FFU/mL, se infectaron tan pronto como 4 días después de la infección, con tasas de infección entre 22.2% y 44.4%. Con estas condiciones de exposición, se observaron infecciones diseminadas a los 14 días después de la infección a una tasa del 11,1%, y no se observó competencia de transmisión(Figura 1g). Un aumento de diez veces en el título de harina de sangre produjo un resultado en gran medida similar, con infecciones observadas a partir de 4 días después de la exposición (33,3% y 44,4%), mientras que las infecciones diseminadas se encontraron después de 14 días de incubación extrínseca a una tasa del 22,2%(Figura 1h). Finalmente, en la cohorte expuesta a una harina de sangre de 6 log10 FFU/ml, se observó infección a partir del punto de tiempo posterior a la infección de 2 días (22,2%) y alcanzó picos a los 4, 10 y 14 días después de la infección (66,7%). Las infecciones diseminadas en esta condición comenzaron a observarse a los 7 días después de la infección (11,1%) y alcanzaron un máximo del 44,4% a los 14 días después de la infección. Solo se observó que un solo mosquito (11,1%) era capaz de transmitirse a los 10 días después de la infección(Figura 1i).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61112/61112fig01.jpg"> Figura 1: Datos representativos de competencia vectorial de varias poblaciones de Ae. aegypti para ZIKV Mex 1−7. (a−c) Competencia vectorial de Ae. aegypti de Salvador, Brasil (F2). (d−f) Competencia vectorial de Ae. aegypti de la República Dominicana (F6). (g−i) Competencia vectorial de Ae. aegypti del Valle del Río Grande, TX (F4). (a,d,g) Ae. aegypti expuesto a 4 log10 FFU/mL de ZIKV Mex 1-7. (b,e,h) Ae. aegypti expuesto a 5 log10 FFU/mL de ZIKV Mex 1-7. (c,f,i) Ae. aegypti expuesto a 6 log10 FFU/mL de ZIKV Mex 1-7. En cada punto temporal (2, 4, 7, 10 y 14 días después de la infección) se recolectó y tomó muestras de un subconjunto de mosquitos. Las tasas de infección, diseminación y transmisión se presentan como el número de muestras positivas de cadáveres/patas/saliva sobre el número de mosquitos ensayados en ese momento. Infección representada en azul, infecciones diseminadas representadas en verde y tasa de transmisión representada en rojo. Los datos de esta figura se modifican a partir de Roundy y Azar et al.32. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61112/61112fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

El protocolo presentado puede determinar la competencia vectorial de las poblaciones de mosquitos Aedes aegypti para un virus determinado, como el Zika, en un entorno de contención.

Análisis de competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

2.9K vistas.  University of Texas Medical Branch. El protocolo presentado puede determinar la competencia vectorial de las poblaciones de mosquitos Aedes aegypti para un virus determinado, como el Zika, en un entorno de contención.

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Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Investigación

Genética

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

Edición del genoma del mosquito Aedes aegypti de la fiebre amarilla mediante CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Virus Zika Sistema infecciosa cultivo celular y la<em&gt; In Vitro</em&gt; Profiláctica Efecto de los interferones

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Inmunología e Infección

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Rescate y Caracterización del Virus Recombinante de un Nuevo Mundo Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

Cuantificación de estimulación dependiente de los anticuerpos del Virus Zika en células humanas primarias

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Infección viral experimental en mosquitos adultos por alimentación oral y microinyección

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Mantener los mosquitos Aedes aegypti infectados con Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Biología

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus particles are transmitted during a blood meal via the saliva of an infected mosquito. Forced salivation assays allow determining the vector potential on the basis of single mosquitoes, avoiding the use of animal experiments. The method is suitable to analyze a large number of mosquitoes in one experiment within a short period of time. Forced salivation assays were used to analyze 856 individual mosquitoes trapped in Germany, including two different Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium as well as Aedes albopictus, which were experimentally infected with Zika virus (ZIKV) and incubated at 18 &#176;C or 27 &#176;C for two and three weeks. The results indicated the lack of vector competence of the different Culex taxa for ZIKV. In contrast, Aedes albopictus was susceptible to ZIKV, but only at 27 &#176;C, with transmission rates similar to an Aedes aegypti laboratory colony tested in parallel.

For efficient control of mosquito borne virus transmission, the knowledge of the vector potential of respective mosquitoes is of particular interest. We describe forced salivation as a method to analyze vector competence of Aedes albopictus and three different Culex taxa for the transmission of Zika virus.

Forzado de la salivación como un método para analizar la competencia de vectores de mosquitos

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for wild-type females and induce sterility in the target population. Hence, laboratory assessment of male mating competitiveness is essential for evaluating the release strain&#8217;s fitness before field release. Conventionally, such an assay is performed by determining the proportion of viable eggs produced by the females after being simultaneously exposed to two sets of males (wild-type and release strains) for copulation. However, this process is time-consuming and laborious due to the need to first blood-feed the females for egg production and then hatch and enumerate the hatched eggs to determine egg viability.&#160;
Moreover, this method cannot discern the degree of competitiveness between two sterile or Wolbachia-infected mosquito lines as wild-type female mosquitoes will only produce non-viable eggs upon mating with both. To circumvent these limitations, this paper describes a more direct method of measuring male mosquito mating competitiveness in laboratory settings using the fluorescent dye, rhodamine B (RhB), which can be used to mark males by feeding them in sucrose solution containing RhB. After the mating assay, the presence of fluorescing sperms in the spermathecae of a female can be used to determine her mating partner. This method is cost-effective, reduces the experimental time by 90% and allows comparison of mating fitness between two sterile or Wolbachia-infected lines.&#160;

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

Here, we present a protocol for studying mating competitiveness of male Aedes aegypti using fluorescent dye as a marker. Female mosquitoes are exposed to both marked and unmarked males for copulation. Post mating, their spermathecae are examined under a fluorescence microscope to determine their mating partner.

Uso del colorante fluorescente, rodamina B, para estudiar la competitividad del apareamiento en mosquitos machos Aedes aegypti

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for ...

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two main categories of these new mosquito-associated viruses are &#34;mosquito-borne viruses (MBVs)&#34; and &#34;mosquito-specific viruses (MSVs)&#34;. These novel viruses might be pathogenic to both vertebrates and mosquitoes, or they could just be symbiotic with mosquitoes. Entity viruses are essential to confirm the biological characters of these viruses. Thus, a detailed protocol has been described here for virus isolation and amplification from field-collected mosquitoes. First, the mosquito samples were prepared as supernatants of mosquito homogenates. After centrifugation twice, the supernatants were then inoculated into either mosquito cell line C6/36 or vertebrate cell line BHK-21 for virus amplification. After 7 days, the supernatants were collected as the P1 supernatants and stored at -80 &#176;C. Next, P1 supernatants were passaged twice more in C6/36 or BHK-21 cells while the cell status was being checked daily. When cytopathogenic effect (CPE) on the cells was discovered, these supernatants were collected and used to identify viruses. This protocol serves as the foundation for future research on mosquito-associated viruses, including MBVs and MSVs.

Numerous novel virus-like sequences have been found in mosquitoes due to the extensive use of sequencing technologies. We provide an effective procedure for isolating and amplifying viruses using vertebrate and mosquito cell lines, which might serve as the basis for future studies on mosquito-associated viruses, including mosquito-borne and mosquito-specific viruses.

Aislamiento de virus asociados a mosquitos de mosquitos recolectados en el campo

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...