Este protocolo describe un ensayo colorimétrico de alto rendimiento en las tres etapas del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi para identificar nuevos candidatos a fármacos para la enfermedad de Chagas. Esto se puede utilizar para identificar compuestos tripanocidas de una manera fácil, rápida y reproducible. La demostración del procedimiento estará a cargo de Romina Manarin, técnica de cultivo celular de laboratorio del laboratorio de Pamela crib.
Comience cultivando beta galactosidasa que expresa trypanosoma cruzi epimastigotes en un matraz de cultivo de tejido T-25 e incube a 28 grados centígrados para cultivarlos axénicamente. Usando una cámara de Neubauer, cuantifique el crecimiento del parásito antes de subcultivar. Para mantener los cultivos en una fase logarítmica, subcultivo cada 48 a 72 horas en cinco mililitros de medio LIT suplementado con 10% FCS y genética en sulfato a una concentración final de 200 microgramos por mililitros.
Luego cierre firmemente la tapa antes de incubar a 28 grados centígrados en posición vertical. A partir del cultivo en fase logarítmica, realizar una suspensión de epimastigote en medio LIT suplementado con geneticina y sulfato a la concentración final de 200.000 células por epimastigoto mililitro por mililitro. Después de dispensar 100 microlitros de suspensión por pozo de una placa de 96 pocillos, maquillar el volumen final del pozo 200 microlitros con medio.
Hacer la suspensión de células Vero en DMEM suplementada con 2% FCS a la concentración final de 100, 000 células por mililitro. Sembra 100 microlitros de la suspensión por pozo en una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos. Incubar las células durante la noche para la adherencia y al día siguiente, observar las células bajo el microscopio.
Al día siguiente, enjuague la monocapa de células Vero tres veces con 100 microlitros de PBS estéril. Añadir tripomastigotes metacíclicos obtenidos previamente. Agregue una multiplicidad de infección o MOI de 10-1 en 100 microlitros de DMEM suplementados con 2% FCS por pozo e incube durante seis horas como se demostró anteriormente.
Al final de la incubación, lave la placa dos veces con PBS y agregue 100 microlitros de DMEM sin rojo fenol suplementado con 2% FCS. Después de hacer la suspensión de células Vero en DMEM agregue la concentración final de 1 millón de células por mililitro. Sembrar 800, 000 células en cinco mililitros del medio en matraces T-25 e incubar durante la noche para la adherencia celular.
Una vez que el matraz esté enjuagado con PBS, agregue tripomastigotes, agregue un MOI de 10-1 en cinco mililitros de DMEM suplementado con 2% FCS e incube durante la noche como se demostró anteriormente. Al final de la incubación, lave el matraz dos veces con PBS. Añadir cinco mililitros de DMEM fresco suplementado con 2% FCS e incubar durante cuatro días.
Al final de la incubación, después de observar la presencia del sobrenadante para tripomastigotes bajo un microscopio óptico. Cuantificar los tripomastigotos utilizando una cámara de Neubauer. Recoger el sobrenadante en un tubo de 15 mililitros y centrifugar a 7.000 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en DMEM sin rojo fenol suplementado con 2%FCS para obtener una concentración de 1 millón de tripomastigotes por mililitro. Sembra 100 microlitros de la suspensión de tripomastigote por pozo en una placa de 96 pocillos. Agregue la solución de benznidazol a los epimastigotes, células Vero con amastigotes o tripomastigotes como se describe en el manuscrito de texto.
Luego incubar los epimastigotes, establecer 28 grados Celsius durante 72 horas y los tripomastigotes o células Vero infectadas con amastigotes durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Para el ensayo colormétrico, configure los pozos en blanco agregando 100 microlitros de PBS o el medio correspondiente. A continuación, añadir 40 microlitros de solución de sustrato CPRG y 10 microlitros de la solución detergente a cada pocillo para obtener una concentración final de 200 micromolares CPRG y 0,1% de detergente en un volumen final de 250 microlitros en cada pozo.
Después de la incubación, a 37 grados Celsius durante dos horas, mida la absorbancia a 595 nanómetros utilizando un espectrofotómetro de microplacas. En el software, cree un nuevo protocolo seleccionando absorbancia como método de detección y punto final como tipo de lectura y, a continuación, haga clic en Aceptar. A continuación, agregue un paso de lectura.
Escriba la longitud de onda seleccionada y haga clic en Aceptar. En la sección de diseño de la placa, marque los pozos que se leerán, haga clic en Aceptar y haga clic en la placa de lectura, espere a que los valores aparezcan en la pantalla y expórtelos a una hoja de cálculo para analizar los resultados y calcular los valores de absorbancia utilizando la resta como se describe en el manuscrito. En el software de análisis estadístico, grafique la concentración de BZN versus la absorbancia a 595 nanómetros en la tabla XY.
Transforme las concentraciones de BZN en valores logarítmicos haciendo clic en analizar, seleccionando la opción de transformación y haciendo clic en Aceptar. Para obtener los valores de IC50, haga clic en analizar y, en la lista de análisis XY, seleccione ajuste de curva de regresión no lineal y, a continuación, haga clic en Aceptar. A continuación, vaya a la ventana de parámetros, en la pestaña del modelo, vaya al grupo de inhibición de la dosis respuesta de las ecuaciones incorporadas, seleccione el inhibidor de registro frente a la pendiente variable de respuesta para los parámetros como el método de respuesta a la dosis deje todas las demás pestañas en los valores predeterminados y luego haga clic en, de acuerdo.
Haga clic en la sección de resultados para encontrar el valor IC50, la SD y la bondad del ajuste. Haga clic en la sección del gráfico para encontrar el gráfico XY de la concentración logarítmica del fármaco frente a los valores de absorbancia y asegúrese de que el ajuste de la curva también se grafique en un color diferente. En el presente estudio, el valor de IC50 obtenido para los epimastigotes fue de aproximadamente 20 micromolares, similar a estudios anteriores.
Además, los resultados indicaron la actividad de la beta galactosidasa de los epimastigotes a lo largo del tiempo. Es muy importante realizar al menos réplicas de cada condición probada y minimizar los errores en la administración de volúmenes.
