Es difícil utilizar la etapa de infección del huésped de T.cruzi en experimentos porque amastigote es un parásito intracelular obligatorio. Nuestra técnica de cultivo permite que el amastigo se replique temporalmente fuera de la célula huésped, por lo que podemos realizar experimentos directamente en esta etapa clínicamente relevante del parásito. Demostrando el procedimiento estará Yukie Akutsu, un técnico de nuestro instituto.
Mantener una co-cultura del parásito huésped de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Cuando el parásito que expresa Cas9 esté listo para la diferenciación, recoja el sobrenadante en un tubo cónico y compruebe la calidad de la muestra bajo un microscopio. Si hay un número significativo de amastigotes extracelulares, realice un procedimiento de natación para aislar los trippomastigotes.
Girar hacia abajo la mezcla de trypomastigotes y amastigotes durante quince minutos como 2, 100 veces G.Then desechar la mayor parte del sobrenadante, dejando 0.5 a 1 mililitro de medio en el tubo. Tapar el tubo, e incubar el pellet a 37 grados Celsius durante una a dos horas, lo que permitirá que los trippomastigotes activos naden fuera del pellet. Después de la incubación, transfiera el sobrenadante con los trippomastigotes a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Girar hacia abajo, y resuspender el pellet con 5 mililitros de DMEM. Transfiera el parásito a un matraz de cultivo T-25 e incubar el matraz a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada. Alrededor del 95% de los parásitos se diferenciarán en amastigotes después de 24 horas.
Centrifugar el cultivo de amastigotes extracelulares durante 15 minutos a 2, 100 veces G, y desechar el sobrenadante. Resuspender el pellet con tampón de electroporación que contiene la solución de suplemento proporcionada a una densidad celular final de uno por 10 a las 8a células por mililitro. Aliquot 100 microlitros de los parásitos resuspendidos en tubos de microcentrífuga de 1,5 litros.
A continuación, agregue de cinco a 10 microgramos de ARN guía y mezcle suavemente en pipeteando. Transfiera la mezcla a una cubeta de electroporación de dos milímetros y aplique un pulso con el dispositivo de electroporación. A continuación, transfiera el contenido de la cubeta a un matraz T-25, que contenga cinco mililitros de medio LIT preadnciado, deje la tapa suelta e incuba el matraz a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono.
Controlar el crecimiento celular ya sea por la continuación del cultivo de haxéxnico o como amastigotes intracelulares después de la infección de la célula huésped. Si monitorea el crecimiento celular como amastigo axenic, agita suavemente el matraz para resuspender el amastigote extracelular en la solución, y mezcle 20 microlitros del cultivo con un microlitro de solución de yoduro de propio en un tubo de microcentrífuga. Es importante no dejar el matraz de cultivo fuera de la incubadora durante más tiempo del necesario porque la temperatura es uno de los factores que permite la proliferación haxénica de amastigote.
Aplique la muestra sobre un hemocicómetro y obsérrela bajo un microscopio de fluorescencia. A continuación, cuente el número de amastigotes viables que no están manchados por yoduro propidium. Para monitorear el crecimiento de las células noqueadoras como amastigoas intracelulares, las semillas alojan células 3T3 en una placa de 12 pozos con DMEM.
Un día después de la electroporación recoger el knockout amastigotes por centrifugación, desechar el sobrenadante, y resuspender los parásitos con dos mililitros de DMEM. Quite el medio del cultivo de la célula huésped y agregue los amastigotes resuspendidos. Incubar la placa a 37 grados centígrados por debajo del 5% de dióxido de carbono durante dos días, lo que permitirá a los amastigotes establecer una infección.
Después de los dos días, lave la acumulación extracelular fuera de las células huésped con DMEM, y agregue DMEM fresco. Continúe la incubación durante dos días adicionales, y luego visualice los núcleos de las células huésped y los amastigotes intracelulares. Se ha demostrado que T.Cruzi amastigotes trans infectados con ARN guía contra el gen esencial TcCGM1 muestran un defecto de crecimiento significativo en comparación con un grupo de control.
Al monitorear el crecimiento como amastigotes intracelulares, la fracción de núcleos anfitriones asociados con los núcleos T.Cruzi es significativamente menor en el grupo knockout TcCGM1 en comparación con el control. Por el contrario, la transfección del ARN Guía contra una de las proteínas de varilla paraflageladora TcPAR1 no afecta significativamente el crecimiento celular después de cuatro días de cultivo haxénico o inhibe el crecimiento de amastigotes intracelulares. Sin embargo, cinco días después de la infección, el número de trypomastigotes que emergen de la célula anfitriona es significativamente menor en la cocultura de TcPAR1 en comparación con el co-cultivo de control.
Además, los trypomastigotes diferenciados dentro de la célula anfitriona en el grupo de control parecían más activos que los del grupo knockout. Este método también se puede utilizar para estudiar los efectos de los genes exógenos en la etapa de amastigote en lugar de transfectando el ARN guía en amastigote que expresa Cas9, puede transfecar el plásmido en un amastigote de tipo salvaje para expresar un gen exógeno.
