Esta técnica proporcionó una imagen más completa y 3D de órganos transparentes completos y fue útil para la cuantificación, no solo de la replicación, sino también de las células latentes del parásito y del factor inmune. Esta técnica nos permite determinar la asociación especial de parásitos, células inmunes y el daño tisular resultante de la infección. La inmunotinción de epítopos y el etiquetado de ADN también fueron comparables con esta técnica.
Este protocolo se utilizó eficazmente para evaluar los resultados del tratamiento en modelos de ratón de la enfermedad de Chagas. Un tratamiento de dosis individuales más altas, administradas con menos frecuencia durante un período de tratamiento prolongado, elimina tanto los parásitos replicantes como los latentes. Demostrando el procedimiento estará Caleb Hawkins, un técnico de investigación del laboratorio de Rick Tarleton.
Después de sacrificar, diseccionar y fijar los órganos de un ratón infectado como se describe en el manuscrito, sumerja los órganos individuales en 10 mililitros de CUBIC-L diluido en agua al 50%, con una agitación suave a temperatura ambiente en tubos cónicos de 50 mililitros durante la noche protegidos de la luz. Al día siguiente, reemplace 50% CUBIC-L con 10 mililitros de 100% CUBIC-L, e incube durante seis días a 37 grados centígrados, mientras mantiene el tubo plano en la incubadora del agitador. Al final de este período de incubación, los tejidos deben ser casi completamente transparentes.
Lave los órganos transparentes dos veces con PBS durante dos horas a 37 grados centígrados, con una agitación suave. Con cada lavado, transfiera los tejidos a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros para eliminar Triton X-100. Para la tinción de ADN, diluya el colorante de ácido nucleico disponible comercialmente en cinco mililitros de tampón de tinción a 1:2, 500.
Luego, sumerja el tejido en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga solución de tinte nuclear e incube a 37 grados centígrados, con una rotación suave durante cinco días en posición de pie. Lave el pañuelo tres veces con 15 mililitros de tampón de lavado de tinción nuclear 3D durante dos horas a temperatura ambiente, con una agitación suave. Calcular la cantidad requerida de anticuerpos primarios y secundarios.
Mezcle los anticuerpos primarios y secundarios en un tubo ámbar de dos mililitros e incube a 37 grados centígrados durante 1,5 horas. Para el intercambio de tampón, mezcle 7.5 mililitros de tampón de inmunotinción 2x HV1 3D con 7.5 mililitros de agua doble destilada. Sumerja la muestra de tejido en el tampón e incube durante 1,5 horas a 32 grados centígrados, con una agitación suave en un tubo cónico de 15 mililitros en posición horizontal.
Recoja la muestra de tejido del medio de intercambio de tampón y sumérjala en la solución de tinción de anticuerpos. Incubar los tejidos individualmente durante una semana a 32 grados centígrados, agitando suavemente los tubos en posición de pie lejos de la luz. Mueva las muestras de tejido a cuatro grados centígrados e incube de pie.
Después de enfriar el tampón de lavado de inmunotinción HV1 3D a cuatro grados centígrados, lave la muestra con 15 mililitros de tampón dos veces a cuatro grados centígrados durante 30 minutos, cada uno con agitación suave en posición horizontal. Diluir la formalina al 1% en el tampón de lavado de inmunotinción HV1 3D y sumergir la muestra en ocho mililitros de la solución durante 24 horas a cuatro grados centígrados, con una agitación suave. Ahora, incube la muestra en una solución fresca de formalina al 1% durante una hora a 37 grados centígrados y lave en 15 mililitros de PBS durante dos horas a 25 grados centígrados.
Sumerja los órganos transparentes en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga cinco mililitros de solución CUBIC-R+ diluida en agua al 50% a temperatura ambiente, con una agitación suave. Reemplácelo por cinco mililitros 100%CUBIC-R+ e incubar con agitación suave durante dos días. Seque los tejidos con Kimwipes, y luego, transfiéralos a cinco mililitros de solución de montaje en una placa de cultivo de seis pocillos e incubarlos a temperatura ambiente.
Adhiera los tejidos al soporte de la muestra del microscopio con pegamento de gel super. Sumerja las muestras en la cubeta de cuarzo del microscopio llena con 120 mililitros de solución de montaje. Imagínelos transversalmente a su eje longitudinal, y adhiera el corazón, con el ápice y la aorta alineados horizontalmente.
El corazón infectado por Trypanosoma cruzi reconstruido en 3D mostró una mayor proporción de células infectadas en la aurícula, en comparación con los ventrículos. Los parásitos latentes se pueden identificar en el corazón, como se muestra en los recuadros ampliados en 3D. Las células T que expresan ZsGreen1, así como las células infectadas con Trypanosoma cruzi, se visualizaron en el músculo esquelético de un ratón reportero CD8 infectado con Trypanosoma cruzi.
Los zooms 3D de la imagen reconstruida en 3D identificaron células T en la región de una célula infectada. La interfaz de las células T en las células infectadas por el huésped se visualizó mediante microscopía confocal. En el corazón de un ratón inmunodeficiente, se detectaron células huésped infectadas con dos cepas diferentes de Trypanosoma cruzi, y el corte a través de los tejidos mostró abundantes células infectadas por parásitos en las aurículas del corazón a varias profundidades de tejido.
La inmunodetección de vasculatura en el corazón infectado y despejado por Trypanosoma cruzi revela la intrincada vasculatura del corazón. Se podían observar células infectadas con parásitos en las aurículas del corazón. La tinción nuclear del músculo esquelético mostró una acumulación de núcleos en áreas con pocos o indetectables parásitos tdTomato.
El aumento de los marcadores reporteros de parásitos tdTomato y GFP con anticuerpos contra RFP y GFP, y todo el músculo esquelético aclarado dio como resultado una fuerte fluorescencia. Por lo tanto, los puntos críticos son el tiempo de incubación en el tampón cúbico, el tiempo de dilución e incubación en el colorante de ADN, el tiempo de incubación en los anticuerpos y el tiempo de incubación en la solución refractada de coincidencia de índices. El uso de tinción adicional, con colorante de anticuerpos específicos y reacción rápida, podría aumentar significativamente el potencial de esta técnica, permitiendo la detección de múltiples células, procesos y estructura en órganos intactos.
Ahora tenemos una forma mejor y más completa de explorar las células inmunes responsables de matar a los parásitos, los tejidos donde los parásitos persisten crónicamente y la distribución de los medicamentos específicos en los tejidos.
