Este protocolo es la puerta de entrada a la matriz extracelular. Su complejidad y su estructura hasta una escala submicrométrica. Por lo tanto, la ventaja clave de este método es que permite obtener una matriz extracelular que conserva su integridad estructural, abriendo así el camino para el análisis bioquímico y anatómico.
Demostrando el procedimiento estarán, Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten y Maria Rafaeva, actualmente en mi laboratorio y Chris Madsen y quien estuvo en mi laboratorio y continuó el trabajo en la Universidad de Lund. Comience afeitando el tórax, el abdomen y la parte posterior del ratón sacrificado con un cortapelos. Desinfectar la zona con etanol al 70%.
Luego fije el ratón a una bandeja de poliestireno, extendiendo sus extremidades traseras de cuatro extremos, así como su cabeza y cola. Colóquelo debajo del microscopio de microcirugía. Usando unas tijeras de patrón recto de Mayo, haga una incisión cutánea que se extienda desde la región submandibular hasta la parte inferior del abdomen y diseccione por vía subcutánea para exponer la pared torácica y el peritoneo.
Luego use tijeras microquirúrgicas para cortar los músculos pectoral mayor y pectoral menor a lo largo del sexto espacio intercostal a ambos lados de la pared torácica. Corte el esternón a lo largo de las incisiones anteriores con tijeras de patrón recto. Luego complete una esternotomía cortando el esternón a lo largo de su eje largo.
Elevar y fijar, ambos lados de la pared torácica para exponer el complejo cardiopulmonar. Use micro pinzas de punta redonda para extirpar el timo y el tejido adiposo circundante sacándolos delicadamente de sus accesorios. Y cortar el esófago con micro tijeras.
Separe las venas braquiocefálicas y la arteria braquiocefálica con micro pinzas afiladas. Luego separe las arterias carótida común izquierda y subclavia izquierda del tejido subyacente para facilitar la ligadura y cauterización. Use un soporte para microagujas y micro pinzas afiladas y una sutura de nueve oh para colocar puntos de sutura por encima de la aparición de la carótida común izquierda braquiocefálica y las arterias subclavias izquierdas, cauterice las venas braquiocefálicas.
Usando micro tijeras, abra una entrada seccionando el ligamento. Introduzca un catéter de calibre 27 en la tráquea y empuje delicadamente hasta que la tráquea se ramifique en los bronquios, teniendo cuidado de no interrumpir los bronquios. Usando una sutura de seis O, coloque tres puntos de sutura alrededor de la tráquea para asegurar el catéter.
Secciona el ratón a la altura de la 12ª vértebra torácica, la aorta descendente corre hacia arriba de la columna vertebral y debe seccionarse aquí junto con la columna vertebral. Cateterice retrógradamente la aorta y empuje el catéter hasta que llegue al arco aórtico. Usando una sutura, coloque cuatro puntos alrededor de la aorta, comenzando cinco milímetros por debajo de la punta del catéter.
Conecte el ratón a un sistema de bomba mediante tubos de silicona y conectores inferiores. Perfundir con agua desionizada a 200 microlitros por minuto durante 15 minutos. Luego cambie el agente de perfusión a 0.5% DOC, diluido en agua desionizada y perfunda durante la noche.
Al día siguiente, cambie el agente de perfusión a 0.1% SDS diluido en agua desionizada y perfunda durante ocho horas. Luego perfunda con agua desionizada durante 24 horas para lavar el SDS y el DOC. Reseque el corazón y los pulmones descelularizados seccionando sus uniones al tórax.
Almacene el tejido en un tubo criogénico estéril en agua desionizada con estreptomicina de penicilina al 1% y azida de sodio micromolar a cuatro grados centígrados. Para realizar la inmunomantación, bloquee la muestra incubándola en un tubo criogénico que contenga 6% de suero de burro y 3% de BSA durante la noche. Luego incubar con anticuerpo primario en suero de burro al 3% en PBS durante 24 horas.
Después de la incubación, lave la muestra cinco veces en PBST durante una hora por lavado. Incubar la muestra con anticuerpos secundarios conjugados fluorescentemente en suero de burro al 3% en PBS durante 24 horas. Luego repita los lavados en PBST.
Agregue el agua ionizada y almacene la muestra a cuatro grados centígrados de distancia de la luz directa. Para obtener una imagen de la muestra, colóquela en un plato con fondo de vidrio y humidifíquela con dos gotas de solución de almacenamiento. Establezca el objetivo e inspeccione la muestra con luz de fluorescencia.
Cambie al control por computadora, encienda los láseres y ajuste la intensidad del láser, la apertura estenopeica, la longitud de onda de los detectores, la ganancia, la resolución y el zoom. Establezca el número y el tamaño del paso para la pila Z y, a continuación, comience la adquisición. Extirpe un lóbulo pulmonar de un ratón sacrificado y colóquelo en un molde criogénico de 10 por 10 por cinco milímetros.
Cúbralo con aproximadamente 500 millas de microlitros de compuesto OCT y congélelo en hielo seco. Mantenga la muestra a esa temperatura. Extirpe un lóbulo pulmonar descelularizado de un ratón procesado, colóquelo en un molde criogénico con la mayor superficie hacia abajo y cúbralo con el compuesto OCT.
Congele la muestra en hielo seco y manténgala a esa temperatura hasta que sea necesario. La muestra se puede almacenar durante al menos 12 semanas. Use un criostato para seccionar bloques de tejido congelado en secciones de cinco micrómetros a menos 20 grados centígrados.
Y coloque las secciones en portaobjetos de vidrio adhesivo. Transfiera los portaobjetos a temperatura ambiente hasta que se sequen al aire. Sumerja brevemente las diapositivas en PBS, seguido de 4% de paraformaldehído en PBS durante 15 minutos.
Lavar una vez en PBS, luego dos veces en agua destilada durante cinco minutos por lavado. Sumerja los portaobjetos en la solución de hematoxilina de Myer durante 10 minutos. A continuación, lave los portaobjetos en un frasco copeland con agua destilada durante 10 minutos y sumérjalos en solución de eosina durante siete minutos.
Sumerja en xileno varias veces. Aplique unas gotas de medio de montaje DPX y coloque un resbalón de cubierta de vidrio. Deje que las diapositivas se sequen durante la noche debajo de una capucha química y luego escanéelas en un escáner de diapositivas.
Después de completar con éxito el protocolo, el corazón y los pulmones y el tejido NX estarán libres de células. La descelularización se puede validar mediante la tinción de eosina de hematoxilina de los andamios ecm. Los andamios conservan las dimensiones de los órganos frescos y su estructura ECM insoliable está intacta.
Los andamios ECM mostraron una mayor permeabilidad y penetrabilidad de la luz. El uso de este protocolo con una etapa de microscopio motorizado permite obtener imágenes tridimensionales en mosaico de muestras de montaje completo a una resolución submicrométrica. Es esencial evitar el flujo hacia los órganos de interés para lograr una descelurización uniforme completa.
La disección microquirúrgica y la ligadura de vasos deben ser efectivas. Y al mismo tiempo respetar los tejidos diana para mantener la estructura nativa de VCM. Después de este procedimiento, los andamios se enriquecerán para proteínas ECM estructurales y se pueden utilizar para espectrometría de masas o ingeniería de tejidos.
Esta técnica allana el camino hacia el mapeo de alta resolución de la matriz extracelular.
