Этот протокол является шлюзом к внеклеточному матриксу. Это сложность и его структура вплоть до субмикронного масштаба. Таким образом, ключевым преимуществом этого метода является то, что он позволяет получить внеклеточный матрикс, который сохраняет свою структурную целостность, тем самым открывая путь для биохимического и анатомического анализа.
Продемонстрировать процедуру будут Алехандро Майорка Гилани, Рафаэль Ройтен и Мария Рафаева, которые в настоящее время находятся в моей лаборатории, и Крис Мэдсен, который был в моей лаборатории и продолжил работу в Лундском университете. Начните с бритья грудной клетки, брюшка и спины усыпленной мыши с помощью машинки для стрижки волос. Продезинфицируйте участок 70% этанолом.
Затем прикрепите мышь к полистирольному лотку, вытянув ее четыре конца задних конечностей, а также голову и хвост. Поместите его под микроскоп микрохирургии. Используя ножницы с прямым рисунком Майо, сделайте кожный разрез, идущий от подчелюстной области до нижней части живота и рассекните подкожно, чтобы обнажить грудную стенку и брюшину.
Затем используйте микрохирургические ножницы, чтобы разрезать большую грудную клетку и грудную клетку минорных мышц вдоль шестого межреберного пространства по обеим сторонам грудной стенки. Вырежьте грудину вдоль предыдущих разрезов ножницами с прямым рисунком. Затем завершите стернотомию, разрезав грудину вдоль ее длинной оси.
Приподнимите и закрепите обе стороны грудной стенки, чтобы обнажить сердечно-легочный комплекс. Используйте микрощипцы с круглым наконечником, чтобы иссечь тимус и окружающие его жировые ткани, деликатно стягивая их с прикреплений. И разрезать пищевод микроножными ножницами.
Отделите брахиоцефальные вены и брахиоцефальную артерию острыми микрощипцами. Затем отделите левую общую сонную и левую подключичную артерии от подлежащей ткани, чтобы облегчить перевязку и прижигание. Используйте держатель микроигл и острые микрощипцы и девятишовный шов, чтобы наложить швы над появлением брахиоцефальной левой общей сонной и левой подключичной артерий, прижечь брахиоцефальные вены.
С помощью микроножек откройте вход, разрезав связку. Введите катетер 27 калибра в трахею и деликатно протолкните до тех пор, пока трахея не разветвится в бронхи, заботясь о том, чтобы не нарушить работу бронхов. Используя шов шесть O, наложите три шва вокруг трахеи, чтобы закрепить катетер.
Сечение мыши на высоте 12-го грудного позвонка, нисходящая аорта проходит спереди к позвоночнику и должна быть разделена здесь вместе с позвоночником. Ретроградно катетеризирует аорту и толкает катетер до тех пор, пока он не достигнет дуги аорты. Используя шов, наложите четыре шва вокруг аорты, начиная с пяти миллиметров ниже кончика катетера.
Подключите мышь к насосной системе с помощью силиконовых трубок и нижних разъемов. Настаивайте на деионизированной воде со скоростью 200 микролитров в минуту в течение 15 минут. Затем замените перфузионное средство на 0,5% DOC, разведенное в деионизированной воде и перфьцирующее на ночь.
На следующий день замените перфузионное средство на 0,1% SDS, разведенное в деионизированной воде, и перфьюируйте в течение восьми часов. Затем перфузируйте деионизированной водой в течение 24 часов, чтобы смыть SDS и DOC. Резекция децеллюляризированного сердца и легких путем разрезания его прикреплений к грудной клетке.
Храните ткань в стерильной криотрубке в деионизированной воде с 1% пенициллина стрептомицина и 0,3 микромолярного азида натрия при четырех градусах Цельсия. Чтобы выполнить иммуноокрасление, заблокируйте образец, инкубируя его в криотрубке, содержащей 6% ослиной сыворотки и 3% BSA на ночь. Затем инкубируют с первичным антителом в 3% ослиной сыворотке в PBS в течение 24 часов.
После инкубации промыть образец пять раз в ПБСТ в течение одного часа за одну промывку. Инкубируйте образец с флуоресцентно конъюгированным вторичным антителом в 3%-ной ослиной сыворотке в PBS в течение 24 часов. Затем повторите промывку в PBST.
Добавьте ионизированную воду и храните образец при четырех градусах Цельсия вдали от прямого света. Чтобы получить изображение образца, поместите его в стеклянную нижнюю посуду и увлажните двумя каплями раствора для хранения. Установите цель и осмотрите образец с помощью флуоресцентного света.
Переключитесь на компьютерное управление, включите лазеры и отрегулируйте интенсивность лазера, диафрагму точечных отверстий, длину волны детекторов, коэффициент усиления, разрешение и масштабирование. Задайте число и размер шага для стека Z, а затем начните сбор. Вырежьте одну долю легкого из усыпленной мыши и поместите ее в криоформу размером 10 на 10 на пять миллиметров.
Накройте его примерно 500-мильными микролитрами соединения OCT и заморозьте на сухом льду. Поддерживайте образец при этой температуре. Иссейте одну децеллюляризированную долю легкого из обработанной мыши, поместите ее в криоформу с наибольшей площадью поверхности вниз и покройте ее соединением OCT.
Заморозьте образец на сухом льду и поддерживайте его при этой температуре до тех пор, пока не потребуется иное. Образец может храниться не менее 12 недель. Используйте криостат для разрезания замороженных тканевых блоков на пять микрометровых секций при минус 20 градусах Цельсия.
И разместите секции на слайдах из клейкого стекла. Переведите слайды к комнатной температуре до высыхания на воздухе. Кратко опустите слайды в PBS, а затем 4% параформальдегида в PBS в течение 15 минут.
Мойте один раз в PBS, затем два раза в дистиллированной воде в течение пяти минут за одну стирку. Погрузите слайды в раствор гематоксилина Майера на 10 минут. Затем промыть горки в банке Коупленда под проточной дистиллированной водой на 10 минут и погрузить в раствор эозина на семь минут.
Обмакните в ксилол несколько раз. Нанесите несколько капель монтажного носителя DPX и поместите стеклянную крышку. Оставьте слайды сушиться на ночь под химическим капотом, а затем отсканируйте их в слайд-сканере.
После успешного завершения протокола сердце, легкие и ткань NX будут свободны от клеток. Децеллюляризация может быть подтверждена окрашиванием гематоксилиновым эозином каркасов ECM. Каркасы сохраняют размеры свежих органов, а его неустойчивая структура ECM неповреждена.
Эшафоты ECM показали повышенную проницаемость и светопроницаемость. Использование этого протокола с моторизованной ступенью микроскопа позволяет получать трехмерную мозаичную визуализацию целых образцов с разрешением ниже микрона. Важно избегать потока к интересующим органам для достижения полной равномерной децеллюризации.
Микрохирургическое рассечение и перевязка сосудов должны быть эффективными. И в то же время уважать ткани-мишени для поддержания нативной структуры VCM. После этой процедуры каркасы будут обогащены структурными белками ECM и могут быть использованы для масс-спектрометрии или тканевой инженерии.
Этот метод прокладывает путь к картированию внеклеточного матрикса с высоким разрешением.
