Las ventajas más importantes de esta técnica son la reversibilidad, la reducción del coste de los animales y el mantenimiento, y un período de embarazo más corto. Además, la mortalidad animal se reduce porque no hay necesidad de histerectomía. Y hay oportunidades más amplias para el trabajo genético.
Esta técnica se puede utilizar para investigar la fisiopatología de la hernia diafragmática congénita. También se puede aplicar a la comprensión de otras enfermedades en el pulmón, como vacas e hipoplasia pulmonar. Comience permitiendo que los ratones se apareen en la misma jaula de 6:00 PM a 9:00 AM al día siguiente.
Para determinar E0, observe el tapón vaginal que tiene una zona exterior homogénea unida a la pared vaginal y una zona interna que es fibrosa e incluya algunos espermatozoides que forman masas entrelazadas mezcladas con las fibras del material del enchufe. Registre el peso de los ratones en el momento del apareamiento y en E10 para asegurar el embarazo continuo y realizar la cirugía en E16.5. Esterilizar los instrumentos que se van a utilizar durante la cirugía.
Precaliente la plataforma de cirugía a 24 grados Centígrados y prepare salina caliente antes de la cirugía. Crea un ambiente cálido para la recuperación y deja comida húmeda dentro de la jaula para la alimentación temprana. Limpie la superficie abdominal con alcohol y yodo povidona y mantenga condiciones estériles durante toda la operación.
Realice una incisión vertical para la laparotomía de las presas embarazadas y corte todas las capas por separado. Identifique los cuernos uterinos de cada lado y determine los fetos candidatos para la cirugía. Operar en dos fetos en cada cuerno uterino si hay un número par de fetos a cada lado.
Y en un feto en cada cuerno uterino si hay un número impar. Usando gafas de ampliación 2X para la visualización, coloque el cuerno uterino de una manera transversal. Coloque a los cachorros mirando hacia arriba entre dos dedos usando los ojos y la cola como guía.
Aplique presión suave en la cabeza del cachorro para permitir la extensión de la cabeza y la visualización del cuello. Realizar oclusión traqueal o TO utilizando una aguja atraumática y una sutura de polipropileno de 6 por 0. Mantenga la placenta en el lado y lejos de los puntos de entrada y salida de la aguja.
Inserte la aguja transversalmente a través del lado del útero, lejos de la placenta a través de la parte anterior de un tercio del cuello. A continuación, mueva la aguja suavemente a la línea media del cuello. Dirigirlo a la parte anterior.
A continuación, salga del cuello entre la tráquea y frente a la esquela carótida y el útero. Anudar la sutura, teniendo cuidado de mantener la integridad de las membranas y la pared uterina. Reemplace el cuerno uterino en el abdomen e inyecte dos mililitros de solución salina estéril caliente en la cavidad peritoneal antes del cierre.
Coloque una sutura de poliglactina de 5 por 0 para cerrar la pared abdominal. Y cierra la piel con una sutura de seda no running. Aplicar 0,1 microgramos por kilogramo de buprenorfina por vía intraperitoneally para la analgesia y permitir que la presa se recupere en una incubadora caliente.
Observe que el animal operado puede alimentarse y mantenerlo solo en su jaula individual. Cosecha todos los fetos por E18.5 por cesárea y comprueba su viabilidad observando sus movimientos. Pesa todos los fetos.
Realice una incisión vertical en el tórax para una toracotomía para diseccionar los pulmones. Y pesarlos para calcular la relación peso total pulmón-cuerpo. Enganche el tejido en nitrógeno líquido, compuesto de temperatura de corte óptimo y hielo seco.
Corta las muestras en secciones de 10 micrómetros usando un criostato y colócalos en toboganes recubiertos de poli lisina. Hornea los toboganes durante la noche a 60 grados Centígrados y mancha los toboganes horneados con hematoxilina y eosina. Imagen de las diapositivas a una ampliación de 10 a 20X, utilizando un microscopio de campo ancho.
Para análisis de proteínas y ADN, enganche el tejido y homogeneizarlo en 300 microlitros de amortiguador de ensayo de radioinmunoprecipitación. Centrífuga a 18.000 x g y 4 grados Celsius durante cinco minutos. A continuación, extraiga y cuantifique proteínas, ADN y ARN.
El peso corporal medio, el peso pulmonar y el LBWR eran más altos en el grupo TO que en el grupo de control. Las cantidades de ADN pulmonar y la relación ADN/proteína fueron más altas en el grupo TO. No se observó ninguna diferencia en el ARN pulmonar, y las cantidades de proteínas fueron más bajas en el grupo TO que en el grupo de control.
Los análisis histológicos de los pulmones de control E18.5 mostraron la etapa saccular tardía o temprana del desarrollo pulmonar con espacios aéreos en desarrollo e intersticios engrosado entre superficies epiteliales. Los pulmones del grupo TO habían dilatado los espacios aéreos centrales y distales con un número subjetivamente mayor de núcleos. Al intentar este protocolo, fijamos las suturas de una manera que los ojos del feto son visibles y el cuello se extiende para que la aguja no interrumpa las estructuras ajustadas.
La eliminación de las estructuras al renacimiento del feto en el ventilador de nitrilo y los modelos knockout de CDH serán las futuras aplicaciones de esta técnica.
