Nos gustaría dar las gracias a Astha Maltare para la generación de los datos se arrastran larvas. Nos gustaría agradecer al Dr. Nicolás Lanson Jr. para dar sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Centro Robert Packard para la ELA en la Universidad Johns Hopkins (para UBP) y la Asociación de Esclerosis Lateral Amiotrófica (UBP), y R01MH083689 de los Institutos Nacionales de Salud Mental (CDN).

A. Ensayo de larvas Crawling 1. Las larvas Colección <ol><li> Establecer una botella de 8 onzas de moscas (machos + 10-15 10-15 hembras). </li><li> Que las moscas ponen sus huevos durante 24 horas, luego de botella clara de las moscas. (Transferencia de los adultos en una nueva botella y repita si es necesario). </li><li> Incubar la botella durante 3-4 días, o hasta que las larvas son visibles. </li><li> Agregar 50 a 100 ml de sacarosa al 20% de la botella con las larvas y deje reposar durante 20 minutos. Las larvas flotan en la parte superior. </li><li> Recoger las larvas con una pipeta serológica de 25 ml con la punta cortada, y el lugar en una cesta de malla. </li><li> Lávese las larvas en la cesta de malla dos veces con agua desionizada H 2 O. Las larvas están listas para los experimentos. </li></ol> 2. Para el tratamiento de las larvas con las drogas <ol><li> Utilizar un pincel para transportar el número deseado de las larvas a un vaso de precipitados de 5 ml que contiene una solución de sacarosa al 5% + fármaco. </li><li> Que las larvas se alimentan por lo menos 15 minutos.</li><li> Vierta tratados con el fármaco larvas en una cesta de malla y enjuague. Ahora están listos para usar. </li></ol> 3. Ensayo de locomotora (medida de la distancia total recorrida o las contracciones de la pared corporal) <ol><li> Use un cepillo para el transporte de larvas de individuo a un: <ol><li> 15 cm de placa de Petri que contenía 2% de agarosa (previamente vertió y se deja endurecer) sobre papel milimetrado con un 0,2 cm 2 cuadrícula. <ol><li> Contar el número de líneas de la cuadrícula cruzado en 1 minuto. </li></ol></li><li> Bien de un plato de vidrio que contiene una disección solución de levadura pasta diluida. <ol><li> Cuente las contracciones peristalsis (anterior pleno movimiento posterior contracción = 1) en un minuto mientras se observa bajo un microscopio de disección. </li></ol></li></ol></li><li> Repita hasta que los números deseados de las larvas han sido contados. </li></ol> B. rápido iterativo geotaxis negativos (ARO) del Protocolo Este ensayo fue De originalmentedescrito por Gargano et al 5. <ol><li> Recoger las moscas recién emergidas adultos de sexo masculino menores de CO 2 anestesia ligera y el lugar en un alimento vial estándar que contiene (o comida + drogas). </li><li> Mantener a las moscas a temperatura ambiente (en la parte superior del banco. ~ 22 ° C) durante 2-3 días para permitir la recuperación de CO 2 (y la acumulación de los niveles del fármaco en estado estacionario en su caso). </li><li> Transferir aproximadamente 25 moscas sin anestesiar a viales de poliestireno preparadas. </li><li> Montar viales con moscas en el aparato de anillo (Figura 1). </li><li> Permita que las moscas se adapte al medio ambiente, sin ser molestado, durante 15-20 minutos. </li><li> En este lugar la cámara digital de tiempo ~ 1 m por delante del aparato (en una plataforma, si es necesario para alinear el centro de la lente a media altura de los viales), el enfoque y zoom con la cámara en el aparato, y establecer un temporizador para 3,0 segundos. </li><li> Con cuidado, sujete el aparato de anillo de modo que no con la mano izquierda a la disturb las moscas, y sostienen que el temporizador con la mano derecha. </li><li> Fuertemente toque el aparato hacia abajo sobre la superficie del banco de tres veces, asegurándose de que el grifo es lo suficientemente duro para tumbar todas las moscas a la parte inferior de los viales. </li><li> Simultáneamente con la terminación de la llave en tercer lugar, iniciar el temporizador de cuenta atrás de 3 segundos. </li><li> En tres segundos, tomar una fotografía. </li><li> Restablecer el temporizador de 1 minuto y comenzar. Durante este tiempo, reajustar la cámara y se centran en el aparato, y establecer otro canal del temporizador durante tres segundos. </li><li> Después de 1 minuto, repita los pasos 1.7-1.10 </li><li> Después de un total de 5-6 ensayos, subir imágenes a un ordenador y usar el visor de imágenes preferida para abrir y marcar la altura promedio subió para cada vial. </li><li> Realizar análisis estadístico de los diferentes grupos que comparan la altura media subió. </li></ol> C. El cortejo y apareamiento de ensayo <ol><li> A primera hora de la mañana, claros y productoras de botellas de FLIes para ser utilizado. </li><li> En el transcurso del día (cada 3-4 horas), recoger recién emergidas machos sexualmente ingenuos y mujeres: <ol><li> Coloque los hombres individualmente en frascos o tubos con el medio. </li><li> Coloque 5-6 hembras juntos por vial / tubo. </li><li> Aislar las moscas recolectadas a 25 ° C en 12 h luz / oscuridad durante 5 días. </li><li> Transferencia de una mujer dentro de la cámara de una rueda de apareamiento. </li><li> Transferencia de un macho en la cámara de una rueda de apareamiento. </li><li> Observar par bajo un microscopio de disección de los siguientes comportamientos: <ol><li> Orientación (los varones se orienta hacia la mujer) </li><li> Al tocar (el macho golpea a la hembra) </li><li> Canción del ala (el macho se extiende y hace vibrar un ala) </li><li> Licking (lame los varones los genitales femeninos) </li><li> Curling (el macho se curva su abdomen debajo de sí mismo) </li><li> Intento de cópula (Curling la actividad al intentar montar a la hembra) </li></ol></li></ol></li><li> Observe si hay una0 minutos o hasta que la copulación con éxito, teniendo en cuenta el momento en que cada comportamiento se produce (latencia), el tiempo total involucrado en el comportamiento de cortejo hasta la copulación (para calcular el índice de noviazgo), así como el número de pares que realizar con éxito un determinado comportamiento ( frecuencia). 100% de pares de tipo salvaje generalmente se aparean dentro de los 5 minutos. </li><li> Calcular un índice de cortejo (IC) al dividir el tiempo en el cortejo, dividido por el tiempo total hasta la cópula. Para los pares de tipo salvaje esto por lo general oscila entre 0.6-0.8. </li></ol> D. Representante Resultados Rastreo de ensayo Larva normal de tipo salvaje vagará ~ 3 cm / minuto, y exhibición del ~ 40-50 contracciones de la pared del cuerpo en un minuto. Recientemente hemos desarrollado un modelo de Drosophila FUS / TLS relacionada con la esclerosis lateral amiotrófica que muestra defecto de larvas arrastrándose, esperanza de vida reducida y adultos escalada deterioro 6. Nos centramos en la expresión of de tipo salvaje y formas mutantes de FUS / TLS para las neuronas motoras (OK-371-GAL4 conductor) y realizó un ensayo de rastreo de las larvas. Como se muestra a continuación, las larvas de tipo salvaje arrastran hasta 12 cm, mientras que la expresión de la FUS de tipo salvaje disminución de la capacidad de las larvas arrastrándose de unos 6 cm. Los animales que expresan la mutación R521C ALS causando en FUS / TLS demostrar un deterioro muy grave en su movimiento de rastreo (Figura 1), el rastreo sólo aproximadamente 1 cm por minuto. Geotaxis negativo del ensayo ANILLO Jóvenes de tipo salvaje moscas adultas deben tener una altura media de subida de ~ 4-5 cm en un período de tiempo de 3 segundos (el tiempo se puede ajustar de 3 segundos para dar cabida a diferentes cepas o los niveles de actividad para definir una altura promedio determinado para una determinada cepa / tratamiento). Las moscas que se mantienen en la parte inferior se le asigna un valor de 0. No se recomienda usar más de 25 moscas por vial, ya que entonces se hace difícil determinar la ubicación de cada individuo mosca para medir la altura. Ndesensibilización o se ha observado menos hasta los 6 ensayos consecutivos espaciados 1 minuto, aparte de que hemos empleado. Es crítico no reutilizar los viales de ensayo de poliestireno en este ensayo después de los conjuntos iniciales de datos son recogidos por moscas nuevas colocadas en viales utilizados no subirá a la misma medida en viales frescos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3795/3795fig1.jpg" /> Figura 1. De instalación para el ensayo de ANILLO. La cámara digital se coloca aproximadamente 1 m por delante del aparato que contiene las moscas en los viales de poliestireno, el enfoque y zoom con la cámara en el aparato, y establecer un temporizador de 3.0 segundos. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3795/3795fig2.jpg" /> Datos de la figura 2. Representativos de la prueba de rastreo utilizando larvas moscas ectópica expresar UAS-FUS WT, y UAS-FUS R521C bajo el control de un controlador de la neurona motora (OK371-GAL4). <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt;

<ol>
	<li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery.">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature Mar. 23 (6776), 394-398 (2000).</li><li>Auluck, P. K., Bonini, N. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialyltransferase+regulates+nervous+system+function+in+Drosophila.">Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).</li><li>Nedelsky, N. B., Pennuto, M., Smith, R. B., Palazzolo, I., Moore, J., Nie, Z., Neale, G., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+functions+of+the+androgen+receptor+are+essential+to+pathogenesis+in+a+Drosophila+model+of+spinobulbar+muscular+atrophy.">Native functions of the androgen receptor are essential to pathogenesis in a Drosophila model of spinobulbar muscular atrophy.</a> Neuron. 67 (6), 936-952 (2010).</li><li>Lorenzo, D. N., Li, M. G., Mische, S. E., Armbrust, K. R., Ranum, L. P., Hays, T. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+5-HT(2)+and+5-HT(1A)-like+receptors+differentially+modulate+aggressive+behaviors+in+Drosophila+melanoga-+ster.">Serotonin 5-HT(2) and 5-HT(1A)-like receptors differentially modulate aggressive behaviors in Drosophila melanoga- ster.</a> Neuroscience. 158 (2), 1292-1300 (2009).</li><li>Bastock, M., Manning, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Courtship+of+Drosophila+Melanogaster.">The Courtship of Drosophila Melanogaster.</a> Behaviour. , 85-111 (1955).</li><li>Greenspan, R. J., Ferveur, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Courtship+in+Drosophila.">Courtship in Drosophila.</a> Annu. Rev. 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No tenemos nada que revelar.

El comportamiento de Drosophila está estrechamente regulada por factores genéticos y ambientales. Nosotros, y otros, han utilizado previamente los ensayos descritos aquí para recoger datos para examinar los genes relacionados a volar a los comportamientos y las enfermedades neurodegenerativas humanas modeladas en Drosophila 5-19. Para la prueba de rastreo, la selección cuidadosa de 3 de las larvas es un paso crítico. Si el tratamiento con un fármaco, se tardará 10-15 minutos (o más dependiendo del tipo y la naturaleza del fármaco) para conseguir el efecto máximo si tiene buena solubilidad. Por lo tanto, de manera rutinaria alimentar vuela el fármaco durante 15 minutos, y luego esperar un período adicional de 15 minutos antes del ensayo. Es importante, sin embargo, para mantener las concentraciones de fármaco en solución, y tiempos de exposición, entre los grupos de tratamiento del mismo para la comparación exacta. Fármacos activos del SNC por lo general tienen un efecto máximo duradera ~ 45 minutos. Las larvas deben ser bien lavadas después de la selección (o excavados, alimentación) para eliminar la comida y la moscapermitió aclimatarse durante 1 minuto antes de comenzar el ensayo gatear. La placa de agar debe mantenerse a temperatura ambiente (~ 22 ° C) durante una hora, como a baja temperatura pueden influir en la capacidad de rastreo de larvas. Aunque el ensayo de rastreo de las larvas puede proporcionar información importante sobre los niveles de actividad, no es adecuado para el análisis de los déficits de coordinación sutiles. Por lo tanto, como una plataforma de cribado es más apropiado para una primera pasada examinar déficits brutas de actividad. Un comportamiento de los adultos que consiste en la coordinación motora fina es el cortejo y el apareamiento. Este comportamiento se ha utilizado para examinar los aspectos de los comportamientos relacionados con enfermedades humanas, y consiste en el procesamiento sensorial (olfato, acústica visual), además de buen control del motor 18. Cuando un hombre se da cuenta de una mujer, se inicia el ritual de cortejo que avanza en un patrón que comienza con el estereotipo de comportamiento de la orientación (hacia el y persiguiendo a la hembra). Esto es seguido por wingsong, chuparseg intervención de los órganos genitales de la hembra, rizado del abdomen hacia la hembra, y culmina en la cópula, que puede durar varias decenas de minutos 20-22. Debido a que muchos de los aspectos del cortejo implican señales visuales, la oscuridad conducir a una degradación de la conducta de apareamiento, y los ensayos deben realizarse con suficiente luz para que las moscas pueden ver unos a otros. En consecuencia, las moscas de ojos blancos por lo general tienen un rendimiento muy pobre en nuestro ensayo descrito y los lectores se les recomienda no utilizar la planificación de experimentos con este protocolo. Si el tratamiento de las moscas con un fármaco, poner el fármaco en el medio de las moscas están aislados en (por ejemplo, 1% de agarosa sacarosa + 10% + de drogas en lugar de comida estándar en el tratamiento con fármaco para evitar cualquier posible degradación del fármaco por los microorganismos en el los alimentos). En general, las moscas se encuentran aisladas en 5 tubos de ensayo que tienen ml 300-500 ml de comida en ellos, tapados con algodón. NO anestesiar a las moscas para la transferencia a la rueda de apareamiento. Se is absolutamente crítico para lavar la rueda de apareamiento muy bien entre utiliza para eliminar las feromonas residuales (agua tibia con un poco de jabón Alconox durante la noche con agitación, luego se lava por un mínimo de 48 horas en agua desionizada con agitación, y numerosos cambios de agua) . Otra consideración al realizar el ensayo se describe es el clima. En las moscas de nuestra experiencia no se corte si está lloviendo o parece que va a llover. Ellos se desempeñan mejor en días soleados, sin importar si el laboratorio tiene ventanas o no. Nuestra teoría actual es que este fenómeno está relacionado con la presión atmosférica, pero no hemos investigado esto. El método tradicional geotaxis negativa se basa en la medición de cómo muchas moscas subir por encima de una altura predeterminada en 10 segundos (que se describe en el <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/details.php?id=2504">https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/details.php?id=2504</a> ). Creemos que el ensayo ANILLO tiene ciertas ventajas sobre el método tradicional. Uno es throughput, como seis repeticiones independientes se pueden medir simultáneamente en comparación con la del ensayo estándar, y el sistema es generalmente escalan. Otra es la sensibilidad, ya que la altura promedio se incrementó en un período de tiempo definido se cuantifica, en lugar de un pase / fallo número para la altura absoluta. Con este enfoque, los déficits más sutiles pueden ser observadas. Debido a que el nivel de rendimiento, el ensayo es más adecuado a las pantallas que el más tedioso método tradicional geotaxis negativo. Además, Garagano et al. (2005) describen un método de puntaje computarizado que si se emplea más que aumentar el rendimiento. Las consideraciones principales para este ensayo son que es imperativo que las moscas no son anestesiados antes de la prueba, y que los viales frescas se utilizan después de un determinado conjunto de ensayos antes de que un nuevo lote de las moscas se ponen a prueba.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Fisher Scientific </td><td> S5-500 </td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> 6 oz botella de Drosophila </td><td> Genesee Científico </td><td> 32-130 </td></tr><tr><td> Paint Brush (# 1) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 11859 </td></tr><tr><td> Fly componentes de los alimentos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Harina de maíz </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9109741 </td></tr><tr><td> Agar </td><td> Genesee Científico </td><td> 66-104 </td></tr><tr><td> Melaza </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9349176 </td></tr><tr><td> El ácido propiónico </td><td> Acros </td><td> 14930-0010 </td></tr><tr><td> Tegosept </td><td> Ápice </td><td> 20-258 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> PescadorCientífico </td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> Levadura </td><td> Genesee Científico </td><td> 62-107 </td></tr></tbody></table>

methods to assay drosophila behavior

Drosophila melanogaster, la mosca de la fruta, se ha utilizado para estudiar los mecanismos moleculares de una amplia gama de enfermedades humanas tales como cáncer, enfermedades cardiovasculares y diversas enfermedades neurológicas 1. Hemos optimizado los ensayos de comportamiento simples y robustos para determinar la locomoción de larvas, la capacidad de escalada para adultos (ensayo anillo), y comportamientos de cortejo de Drosophila. Estos ensayos de comportamiento son ampliamente aplicables para el estudio del papel de los factores genéticos y ambientales en el comportamiento de la mosca. Capacidad de rastreo de las larvas puede utilizarse de manera fiable para determinar los cambios en las primeras etapas de las habilidades que se arrastran de las larvas de Drosophila y también para examinar el efecto de las drogas o los genes de enfermedades humanas (en moscas transgénicas) en su locomoción. El ensayo de rastreo de las larvas es más aplicable si la expresión o la supresión de un gen que causa la letalidad de la pupa o adulto, ya que estas moscas no sobreviven a la edad adulta que de otro modo podría ser evaluada. Este básico de unssay también puede ser utilizado en conjunción con la luz brillante o estrés adicionales para examinar las respuestas de comportamiento en larvas de Drosophila. El comportamiento de cortejo ha sido ampliamente utilizado para investigar las bases genéticas de la conducta sexual, y también se puede utilizar para examinar la actividad y la coordinación, así como el aprendizaje y la memoria. El comportamiento de cortejo de Drosophila implica el intercambio de diferentes estímulos sensoriales como visuales, auditivas, y las señales de quimiosensoriales entre hombres y mujeres que llevan a una compleja serie de conductas motoras bien caracterizados que culminaron en la cópula exitosa. Los ensayos tradicionales para adultos de escalada (geotaxis negativas) son el trabajo tedioso, intensiva, y requiere mucho tiempo, con una variación significativa entre los diferentes ensayos 2-4. El rápido iterativo geotaxis negativos (RING) ensayo de 5 tiene muchas ventajas sobre los protocolos más ampliamente utilizados, proporcionando un enfoque de rendimiento reproducible, sensible y de alta para cuantificar la locomotora de adultos y negativos b geotaxisehaviors. En el ensayo de ANILLO, varios genotipos o tratamientos de drogas se puede probar de forma simultánea con gran número de animales, con el enfoque de alto rendimiento por lo que es más susceptible para los experimentos de detección.

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Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster es un sistema de genética y de comportamiento modelo manejable que se ha utilizado para entender las bases moleculares y celulares de muchos procesos biológicos importantes para más de un siglo 1. Drosophila ha sido bien aprovechado para hacerse una idea de la base genética del comportamiento de las moscas.

Métodos de ensayo a Drosophila Comportamiento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods to Assay Drosophila Behavior

42.7K vistas.  Louisiana State University Health Sciences Center. Drosophila melanogaster es un sistema de genética y de comportamiento modelo manejable que se ha utilizado para entender las bases moleculares y celulares de muchos procesos biológicos importantes para más de un siglo 1. Drosophila ha sido bien aprovechado para hacerse una idea de la base genética del comportamiento de las moscas.

Video: Methods to Assay Drosophila Behavior

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Investigación

Neurociencias

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Métodos de estudio de la morfogénesis neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporación en la corteza cerebral embrionario murino

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Métodos locales y globales de evaluación de nocicepción térmica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenético estimulación de comportamiento de escape en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

Un ensayo de una sola mosca por el comportamiento de forrajeo en<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Teñido Insectos de la Conducta ensayos: el comportamiento de apareamiento de anestesiada<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Uso de los canales lineales de agarosa para estudiar<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamiento de las larvas de arrastre

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Una manera sencilla de medir alteraciones en el comportamiento de búsqueda de recompensa Uso<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Cuantificación de la Drosophila Grooming Comportamiento

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.