Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de odontología y el Instituto Nacional de cáncer (NCI) de los institutos nacionales de salud Premio número R56 DE025098, DE027695 UG3 y F30 CA206296 Craniofacial Research (NIDCR). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud. Este trabajo también fue apoyado por la NSF DMR 1206219 y la innovación de la IADR en Premio de Cuidado Oral (2016).
Nos gustaría agradecer al Dr. Eri Maruyama y Andrew Hollomon su asistencia con la colección de saliva. Nos gustaría agradecer su ayuda con la disección de la glándula Weng Pei-Lun. Nos gustaría agradecer a Matthew Ingalls por su ayuda en la preparación de la figura. Nos gustaría agradecer al Dr. Elaine Smolock y Emily Wu lectura crítica de este manuscrito.

Todo en vivo los procedimientos descritos a continuación fueron aprobados por el Comité de la Universidad sobre los recursos de la Universidad de Rochester, Rochester. NUEVA YORK.
1. preparación
<ol><li>Utilizando una balanza analítica, pesan 20 mg de pilocarpina. Disolver en 2 mL de solución salina estéril en un tubo de microcentrífuga. Nota: Porque pilocarpina es sensible a la luz y pierde actividad con el tiempo, esta solución debe ser preparada el día de la inyección y protegida de la luz hasta que administra.</li>
	<li>Utilizando una balanza analítica, pesar e identificar todos los tubos y capilares de vidrio. El número de tubos y capilares de vidrio debe coincidir con el número de ratones.</li>
</ol>2. traqueostomía
<ol><li>Pesar ratones C57/BL6 utilizando una balanza analítica.</li>
	<li>Utilizando una jeringa de 0.5 mL con aguja 29 x ½", anestesiar ratones con una solución salina estéril inyectada por vía intraperitoneal de 100 mg/kg ketamina y 10 mg/kg xilacina. Proceder al paso siguiente cuando el ratón deja de responder a los estímulos (es decir, ausencia del reflejo pedal retirada), que ocurre generalmente dentro de 5 a 10 minutos después de la inyección.</li>
	<li>Después de dispensar lubricante en un aplicador con punta de algodón, suavemente aplique a los ojos y coloque el ratón en una posición supina en el escenario. El animal anestesiado debe mantenerse en la superficie caliente. Nota: Todas las medidas se realizan a temperatura ambiente.</li>
	<li>Asegure la nariz, extremidades y cola a la etapa con cinta quirúrgica.</li>
	<li>Limpiar y mojar el cuello con un algodón empapado en alcohol. Nota: Esto ayudará a prevenir la piel entren en incisiones posteriores.</li>
	<li>Levantando la piel del cuello del midline ventral con pinzas, hacer un corte pequeño y superficial con tijeras de disección. Guía de las tijeras en la abertura y abra lentamente las hojas por vía subcutánea para separar tejidos planos.</li>
	<li>Mantener la piel levantada, cuidadosamente corte a 1 cm por debajo de la boca.</li>
	<li>Hacer dos incisiones laterales en los aspectos inferior y superiores del primer corte. Suavemente con unas pinzas, reflejan a la piel para permitir el acceso a las estructuras de cabeza y cuello.</li>
	<li>Usando el microscopio de disección con 8 aumentos, visualizar las glándulas submaxilar (media: figura 1).</li>
	<li>Con unas pinzas finas, levante suavemente las glándulas para exponer los cuatro músculos del infrahyoid (correa) que cubre la tráquea. Evitar desgarros o interrumpir la vasculatura circundante o conductos excretores.</li>
	<li>Si recoger saliva de más de un ratón, repita los pasos 2.1-2.10 con cada ratón antes de continuar. Nota: Este procedimiento puede realizar con seguridad en hasta 5 ratones al mismo tiempo.</li>
	<li>Con pequeñas tijeras de disección, quitar la porción medial de los músculos de la correa durante su estancia lo más cerca posible de la línea media. Corte solamente tanto como sea necesario visualizar la tráquea y mantener los músculos de la correa del camino durante el procedimiento. Evitar mellar cualquier buques cercanos porque si hay depleción de volumen secundaria a hemorragia significativa, pilocarpina no será eficaz en la inducción de secreción.</li>
	<li>Reflejo de los músculos de la correa de la tráquea.</li>
	<li>Visualizar la laringe, la tráquea y la glándula tiroides. Asegúrese de que la tráquea esté libre de tejido sobrepuesto.</li>
	<li>Hacer una incisión horizontal en la tráquea inferior posterior de la tiroides usando pequeñas tijeras de disección. Asegurar la vía aérea patente y claro del líquido.</li>
</ol>3. saliva colección
<ol><li>Retire la cinta junto a la boca y el ángulo de fase de disección hacia abajo (45°, cranially) para ayudar a flujo de la saliva.</li>
	<li>Utilizando una jeringa de 0.5 mL con aguja 29 x ½", realizar la inyección intraperitoneal de 10 μl/g cuerpo peso la pilocarpina para una dosis total de 100 mg/kg.</li>
	<li>Iniciar un temporizador. Si la dosis múltiples ratones, reducir tiempo moviendo rápidamente y por tener un ayudante inyecta simultáneamente los ratones restantes.</li>
	<li>Con unas pinzas estándar, abrir la boca para el acceso del tubo capilar.</li>
	<li>Una vez que se observa una gota de saliva en la boca, coloque el extremo proximal del tubo capilar en el líquido, con el extremo distal se coloca en un tubo colector colocado debajo de la etapa de disección (ambos tubos previamente pesados). Nota: En los ratones hembra C57/BL6 6-10 semanas de edad, bruta salivación ocurre dentro de 2 minutos de la inyección de pilocarpina.</li>
	<li>Si saliva en la boca del edificio, pero no fluye a través del tubo, reintentar el paso anterior. Asegúrese de que el tubo no esté directamente contra una superficie mucosa, que puede obstruir la entrada.</li>
	<li>Recoger saliva para un total de 12 minutos después del estímulo la pilocarpina. Asegúrese de que el estoma permanece claro. Nota: Aumento del volumen tidal y secreciones (salivales, urinarias, fecales) son normales durante este tiempo.</li>
	<li>Si los ratones han presionado función de saliva (ej., debido a lesión o intervención), transferir el líquido restante de la boca en el tubo de la colección mediante una micropipeta de P200. Si recogida de varios ratones, asegúrese de que los consejos han cambiado.</li>
	<li>Registrar el peso de saliva recogida más tubos 12 min después de la inyección de pilocarpina.</li>
</ol>4. glándula disección
<ol><li>Eutanasia a ratones por CO2 eutanasia (como se describe en las pautas de AVMA de eutanasia de los animales: edición 2013) seguido de toracotomía, teniendo cuidado de preservar las estructuras de la cabeza y el cuello. Por esta razón, evitar la dislocación cervical como método de eutanasia.</li>
	<li>Coloque el ratón en una posición supina en el escenario. Vuelva a colocar las glándulas en el sitio original sobre la tráquea (figura 1).</li>
	<li>Utilizando un microscopio de disección bajo 8 aumentos, visualizar las glándulas principales: el PG, SMG y SLG. Para distinguir las glándulas durante la disección, identificar que el PG es difusa, lateral a la SMG y SLG. Nota: Si el PG de disección, esto debe hacerse en primer lugar porque es el menos definido y más probable ser rasgado.</li>
	<li>Agarre la cola de la PG con pinzas, tirando lejos de las estructuras subyacentes y suavemente aplique tensión antes de cortar la cabeza de la PG con tijeras de disección.</li>
	<li>Incumplimiento la cápsula que rodea el metralletas con unas pinzas. Separe suavemente el SMG de izquierda y derecho.</li>
	<li>Libre de la cara dorsal de la SMG del tejido nonglandular adherido con unas pinzas.</li>
	<li>Retire el SMG del cuello tenso del conducto de Wharton con pinzas y corte el tubo con tijeras de disección.</li>
	<li>Separe suavemente el SLG de SMG con unas pinzas. Nota: La SLG es en el aspecto superolateral del SMG.</li>
	<li>Con una balanza analítica, registre pesos SMG.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Presentamos un método de varios pasos para evaluar la función de la glándula salival, que puede ser aplicada para el estudio de lesiones de la glándula y terapéutica. Nuestro procedimiento consiste en traqueostomía, la recolección de saliva y disección de la glándula, que tiene aplicaciones experimentales que soporten un estudio integrado de la biología de la glándula salival. Por ejemplo, traqueotomía murino se ha utilizado para la gestión general de la vía aérea durante procedimientos de obstrucción de la cavidad bucal.
Adecuada disección y la incisión traqueal se requieren para la pilocarpina estimula la secreción de saliva en 100 mg/kg. Alternativamente, una dosis de pilocarpina reducido podría evitar la necesidad de traqueostomía y por lo tanto ser utilizada para la evaluación longitudinal de la secreción de saliva16.
Además de registrar la secreción de saliva, este protocolo proporciona un medio preciso y consistente para recoger saliva para análisis adicionales. Dichos estudios incluyen la reología, proteómica, actividad enzimática, saliva osmolaridad25,26,27y descubrimiento de biomarcadores28,29.
Finalmente, métodos de disección estándar para las glándulas salivales principales tienen utilidad más allá de la colección de saliva. Hay un interés por comprender el desarrollo de la glándula y la respuesta a la lesión. Para investigaciones efectivas, es importante realizar disecciones consistente, limpias de las glándulas salivales mayores. Limpieza y aislamiento de glándula eficiente es crítico para cultivos derivados de células primarias que son mecánica y enzimáticamente disociadas de las glándulas salivales mayores30,31y para histologic e immunohistochemical preparativos. Por otra parte, cuando la coloración de proteínas secretadas en secciones del tejido de la glándula, es fundamental considerar y controlar para el probable agotamiento de estos productos tras la colección de saliva estimulada.
Cuantificación de la función de la glándula salival en las investigaciones de lesiones o la intervención es una técnica experimental vital. Histología de la glándula es informativa y puede provocar observaciones claves, sin embargo conclusiones mejor son apoyadas por datos claramente funcionales.

Trastornos de la glándula salival incluyen síndromes de altera o deteriora la secreción hacia la superproducción (sialorrea) o insuficiente (xerostomía e hiposalivación) de saliva1. En ambos casos, hay un interés por mejorar nuestra comprensión de la biología de la glándulas salivales hacia la meta final del desarrollo terapéutico2.
Las glándulas salivales son órganos altamente radiosensibles y a menudo se dañan durante la radioterapia de cáncer cabeza y cuello, hacia la permanente boca seca (xerostomía)3,4. Sin embargo, a diferencia de otros tejidos radiosensibles, índice de rotación de la glándula salival es relativamente baja, y el mecanismo de la pérdida de secreción es mal entendido5,6. En este escenario de lesiones únicas, estrategias de regeneración y protección radiológica de tejido requieren evaluación funcional salival. Experimentalmente, colección de saliva murino es una herramienta especialmente valiosa en la evaluación de la respuesta de la glándula a la radiación y los agentes terapéuticos.
Aquí, presentamos un método para realizar y cuantificar la secreción de saliva estimulada con pilocarpina, un potente agonista muscarínico7. La pilocarpina estimula el sistema nervioso autónomo para inducir la secreción de la glándula8,9. Para completar correctamente esta prueba, una traqueotomía se requiere para asegurarse de que el ratón mantenga una vía aérea patente durante todo el procedimiento y para reducir los riesgos de asfixia y aspiración de secreciones agrupadas en la cavidad oral10.
Este es un procedimiento terminal, culminando en la eliminación de las tres glándulas salivales mayores: parótida (PG), el submaxilar (SMG) y sublingual (SLG). Para los estudios funcionales, glándula pesos se registran y se utilizan a menudo para normalizar saliva medición11,12,13. Esta información es particularmente importante en estudios de radiación, en la que la atrofia de la glándula es un resultado esperado14,15
Hay variabilidad en la literatura con respecto a la secreción de saliva estimulada cómo se realiza y divulga16. Por ejemplo, dosis de pilocarpina en la literatura palmo por lo menos tres órdenes de magnitud17,18,19,20,21,22,23. Aquí, presentamos un protocolo de pilocarpina optimizado de dosis alta con la intención de mejora reproducibilidad en ejecución método, así como proporcionar una plataforma modular de técnicas (traqueostomía, la recolección de saliva y disección de la glándula) que pueden ser adaptados como necesario.
Además de la demostración del Protocolo, incluimos datos funcionales representativos de flujo de la saliva a las 2 semanas después de la radiación fraccionada (4 dosis de 6.85 Gy) a la región SMG.

<table><tbody><tr><td>Pilocarpine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6503</td><td>Pilocarpine</td></tr><tr><td>Student Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-9</td><td>Spring Scissors for Tracheostomy</td></tr><tr><td>Sterile Saline Solution</td><td>Medline</td><td>RDI30296H</td><td>Saline</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td>Curved Forceps</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Straight Forceps</td></tr><tr><td>Standard Pattern Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Blunt Forceps</td></tr><tr><td>Fine Scissors- Tungsten Carbide</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td>Dissection Scissors</td></tr><tr><td>Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362566</td><td>Capillary tubes</td></tr><tr><td>Lubricant Eye Ointment</td><td>Refresh</td><td>N/A</td><td>Refresh Lacri-Lube</td></tr><tr><td>Goat polyclonal anti-Nkcc1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-21545</td><td>Nkcc1 Antibody</td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>ver6.0</td><td>Statistical Software</td></tr><tr><td>Cotton tipped applicator</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td>Applicator for eye ointment</td></tr><tr><td>0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2&quot;</td><td>BD</td><td>7629</td><td>Syringe for intraperitoneal injection</td></tr></tbody></table>

murine salivary functional assessment via pilocarpine stimulation following fractionated radiation

Hiposalivación se observa comúnmente en la reacción autoinmune síndrome de Sjögren o siguiente lesión por radiación a las glándulas salivales mayores. En estos casos, quedan preguntas con respecto a la patogénesis de la enfermedad y las intervenciones eficaces. Una técnica optimizada que permite la evaluación funcional de las glándulas salivales es muy valiosa para la investigación terapéutica, disfunción y biología de la glándula exocrine. Aquí, presentamos un enfoque paso a paso para realizar la pilocarpina estimula la secreción de saliva, incluyendo la disección de las glándulas salivales murinas principales tres y traqueostomía. También detallamos la anatomía cabeza y cuello murina apropiada accedida durante estas técnicas. Este enfoque es escalable, permitiendo múltiples ratones ser procesados simultáneamente, mejorando así la eficiencia del flujo de trabajo. Nuestro objetivo es mejorar la reproducibilidad de estos métodos, cada uno de ellos tiene más aplicaciones en el campo. Además de la colección de saliva, discutimos métricas para cuantificar y normalización de la capacidad funcional de estos tejidos. Datos representativos se incluyen de las glándulas submaxilares con función deprimida de la glándula salival 2 semanas después de la radiación fraccionada (4 dosis de 6.85 Gy).

Cuando realizar pilocarpina dosis altas estimula la colección de saliva, es importante mantener la vía aérea para prevenir la aspiración o asfixia de las secreciones en la cavidad bucal. Un esquema de la traqueotomía se proporciona (figura 1). Tras la incisión traqueal, el estoma debe permanecer claro de tejido y fluidos.
Para mejorar la acción capilar durante la recogida de saliva, ratones deben colocarse con la cabeza hacia abajo en un ángulo de 45°. Estos pasos pueden realizarse en > 1 ratón, aunque se recomienda no exceder 5 ratones a la vez (figura 2). Una vez se ha completado la colección, se recomienda que los tubos se pesa rápidamente para evitar las pérdidas por evaporación.
Siguiendo la colección de saliva, ratones son sacrificados. Dislocación cervical no debe realizarse, ya que puede dañar las estructuras de cabeza y cuello. Ratones se devuelven a la etapa de disección, y las glándulas deben reposicionarse en la tráquea, como originalmente situado. Disección de la glándula (figura 3) debe comenzar con el PG, debido a su posición y consistencia difusa. La SMG SLG son firmes y pueden ser quitados fácilmente.
Después de 4 fracciones de 6.85 de Gy de radiación en SMG murino, función de la saliva disminuye significativamente por 2 semanas (figura 4). Ambos total de secreción de saliva y secreción normalizada para peso húmedo de la glándula se trazaron. Usando cualquier métrica, capacidad funcional salival es reducido, como se esperaba, a las 2 semanas tras la irradiación24.
Tejido de la glándula puede ser fijas y seccionadas para manchas histológicas o inmunohistoquímica. Hematoxilina y eosina tinción (H & E) muestran similar bruto arquitectura SMG con o sin estimulación de pilocarpina (figura 5). Coloración para Nkcc1, un transportador de cloruro de sodio potasio de la membrana, muestra similar morfología celular independientemente de la estimulación de la pilocarpina (figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57522/57522fig1.jpg"> Figura 1 . Traqueostomía PDF. (A) después de abrir la región del cuello, visualizar las estructuras principales. (B) para completar una traqueotomía, suavemente Levante, pero no separes las metralletas sin afectar estructuras vecinas, incluyendo irrigación sanguínea, inervación y conductos excretores. Cortar los músculos de la correa para exponer el cartílago traqueal antes de realizar una incisión en la tráquea. Deje el SMG y tráquea expuesta durante el procedimiento de recogida de saliva entera. <a href="/files/ftp_upload/57522/57522fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57522/57522fig2.jpg"> Figura 2 . Colección de saliva. Tras estimulación de pilocarpina, ángulo ratones hacia abajo y recoger la saliva a través de tubos capilares en tubos previamente pesado, que se colocan por debajo de la etapa de disección. <a href="/files/ftp_upload/57522/57522fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57522/57522fig3.jpg"> Figura 3 . Disección de la glándula salival de mayor. Una vez que los ratones han sido sacrificados, vuelva a colocar y separar el SMG de izquierda y derecho. Con cuidado separar cada glándula que rodea los vasos sanguíneos y tejidos nonglandular. El PG es una estructura difusa, lateral. El SMG y el SLG se unen, pero pueden separarse limpiamente con el fórceps. <a href="/files/ftp_upload/57522/57522fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57522/57522fig4.jpg"> Figura 4 . Datos de secreción representante. Dos semanas después de la radiación fraccionada (4 dosis de 6.85 Gy) al SMG, se midió la secreción de la saliva estimula pilocarpine. Función salival se divulga como volumen total de saliva (A) y el volumen total de saliva (B) normalizaron a SMG peso húmedo total. Como era de esperar, hay una disminución significativa en la capacidad funcional de la SMG (media ± SD **p < 0.01 con dos colas t-test). <a href="/files/ftp_upload/57522/57522fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57522/57522fig5.jpg"> Figura 5 . Hematoxilina y eosina SMG tinción. Tejido SMG fue cosechado de un ratón después de la estimulación de la pilocarpina (100 mg/kg, derecha) en comparación con el control, sin tratamiento ratón SMG (izquierda). H & E tinción muestra estructura de glándula bruto en 10 X (barras de escala: 200 μm) (A, B) y 40 X (barras de escala: 50 μm) (C, D). <a href="/files/ftp_upload/57522/57522fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57522/57522fig6.jpg"> Figura 6 . Inmunohistoquímica SMG Nkcc1. Tejido SMG fue cosechado de un ratón después de la estimulación de la pilocarpina (100 mg/kg, derecha) en comparación con el control, sin tratamiento ratón SMG (izquierda). Nkcc1 es una proteína de membrana y puede ser utilizado para evaluar la morfología celular. DAPI se utiliza como una contratinción nuclear (barras de escala: 75 μm). <a href="/files/ftp_upload/57522/57522fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Evaluación funcional salival murino mediante pilocarpina estímulo siguiente fraccionado radiación

Presentamos un enfoque detallado para realizar la colección de saliva, incluyendo traqueotomía murino y el aislamiento de tres glándulas salivales mayores.

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

murine-salivary-functional-assessment-via-pilocarpine-stimulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K vistas.  University of Rochester. Presentamos un enfoque detallado para realizar la colección de saliva, incluyendo traqueotomía murino y el aislamiento de tres glándulas salivales mayores.

Video: Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their head and neck regions for cancer treatment. Both groups of patients experience symptoms such as xerostomia (dry mouth), dysphagia 
(impaired chewing and swallowing), severe dental caries, altered taste, oro-pharyngeal infections (candidiasis), mucositis, pain and discomfort.
One innovative approach of regenerative medicine for the treatment of salivary gland hypo-function is speculated in RS Redman, E Mezey 
et al. 2009: stem cells can be directly deposited by cannulation into the gland as a potent method in reviving the functions of the impaired organ. Presumably, 
the migrated foreign stem cells will differentiate into glandular cells to function as part of the host salivary gland. Also, this cannulation technique is an 
expedient and effective delivery method for clinical gene transfer application.
Here we illustrate the steps involved in performing the cannulation procedure on the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct 
(Fig 1). C3H mice (Charles River, Montreal, QC, Canada) are used for this experiment, which have been kept under clean conventional conditions at 
the McGill University animal resource center. All experiments have been approved by the University Animal Care Committee and were in accordance with the 
guidelines of the Canadian Council on Animal Care.
For this experiment, a trypan blue solution is infused into the gland through the opening of the Wharton's duct using a 
insulin syringe with a 29-gauge needle encased inside a polyethylene tube. Subsequently, the mouse is dissected to show that the infusions migrated 
into the gland successfully.

A protocol for the cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct is described. For this experiment, the trypan blue solution is used as a dyer to demonstrate how this technique effectively delivers infusions into the targeted gland, and to suggest the reliability of this new approach as a potential clinical drug/cell therapy for the regeneration of salivary glands.

Canulación de la glándula salival submaxilar del ratón a través del conducto de Wharton

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

Investigación

Medicina

Quantifying Cognitive Decrements Caused by Cranial Radiotherapy

With the exception of survival, cognitive impairment stemming from the clinical management of cancer is a major factor dictating therapeutic outcome. For many patients afflicted with CNS and non-CNS malignancies, radiotherapy and chemotherapy offer the best options for disease control. These treatments however come at a cost, and nearly all cancer survivors (~11 million in the US alone as of 2006) incur some risk for developing cognitive dysfunction, with the most severe cases found in patients subjected to cranial radiotherapy (~200,000/yr) for the control of primary and metastatic brain tumors1. Particularly problematic are pediatric cases, whose long-term survival plagued with marked cognitive decrements results in significant socioeconomic burdens2. To date, there are still no satisfactory solutions to this significant clinical problem.
We have addressed this serious health concern using transplanted stem cells to combat radiation-induced cognitive decline in athymic rats subjected to cranial irradiation3. Details of the stereotaxic irradiation and the in vitro culturing and transplantation of human neural stem cells (hNSCs) can be found in our companion paper (Acharya et al., JoVE reference). Following irradiation and transplantation surgery, rats are then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. To critically evaluate the success or failure of any potential intervention designed to ameliorate radiation-induced cognitive sequelae, a rigorous series of quantitative cognitive tasks must be performed. To accomplish this, we subject our animals to a suite of cognitive testing paradigms including novel place recognition, water maze, elevated plus maze and fear conditioning, in order to quantify hippocampal and non-hippocampal learning and memory. We have demonstrated the utility of these tests for quantifying specific types of cognitive decrements in irradiated animals, and used them to show that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function3.
The cognitive benefits derived from engrafted human stem cells suggest that similar strategies may one day provide much needed clinical recourse to cancer survivors suffering from impaired cognition. Accordingly, we have provided written and visual documentation of the critical steps used in our cognitive testing paradigms to facilitate the translation of our promising results into the clinic.

Cognitive impairment resulting from the radiotherapeutic management of brain tumors represents a clinically intractable condition that adversely impacts quality of life. The capability to critically evaluate potential interventions for ameliorating radiation-induced cognitive decrements ultimately depends on the capability to undertake rigorous quantitative assessments of cognition.

Disminuye la cuantificación cognitivos causados ​​por la radioterapia craneal

With the exception of survival, cognitive impairment stemming from the clinical management of cancer is a major factor dictating therapeutic outcome. For ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogatorio funcional de adultos hipotalámica neurogénesis con focal Radiológica Inhibición

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Neurociencias

Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice

Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal model of epilepsy, we generated pilocarpine-treated chronic epileptic mice. We present a protocol for three different behavioral tests using these epileptic mice: novel object location (NL), novel object recognition (NO), and pattern separation (PS) tests to evaluate learning and memory for places, objects, and contexts, respectively. We explain how to set the behavioral apparatus and provide experimental procedures for the NL, NO, and PS tests following an open field test that measures the animals&#8217; basal locomotor activities. We also describe the technical advantages of the NL, NO, and PS tests with respect to other behavioral tests for assessing memory function in epileptic mice. Finally, we discuss possible causes and solutions for epileptic mice failing to make 30 s of good contact with the objects during the familiarization sessions, which is a critical step for successful memory tests. Thus, this protocol provides detailed information about how to assess epilepsy-associated memory impairments using mice. The NL, NO, and PS tests are simple, efficient assays that are appropriate for the evaluation of different kinds of memory in epileptic mice.

This article presents experimental procedures for assessing memory impairments in pilocarpine-induced epileptic mice. This protocol can be used to study the pathophysiologic mechanisms of epilepsy-associated cognitive decline, which is one of the most common comorbidities in epilepsy.

Evaluación de la función de la memoria en ratones epilépticos inducidos por pilocarpina

Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal ...

Comportamiento

Adapting Human Videofluoroscopic Swallow Study Methods to Detect and Characterize Dysphagia in Murine Disease Models

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating translational dysphagia research. Successful outcomes are dependent upon three critical components: test chambers that permit self-feeding while standing unrestrained in a confined space, recipes that mask the aversive taste/odor of commercially-available oral contrast agents, and a step-by-step test protocol that permits quantification of swallow physiology. Elimination of one or more of these components will have a detrimental impact on the study results. Moreover, the energy level capability of the fluoroscopy system will determine which swallow parameters can be investigated. Most research centers have high energy fluoroscopes designed for use with people and larger animals, which results in exceptionally poor image quality when testing mice and other small rodents. Despite this limitation, we have identified seven VFSS parameters that are consistently quantifiable in mice when using a high energy fluoroscope in combination with the new murine VFSS protocol. We recently obtained a low energy fluoroscopy system with exceptionally high imaging resolution and magnification capabilities that was designed for use with mice and other small rodents. Preliminary work using this new system, in combination with the new murine VFSS protocol, has identified 13 swallow parameters that are consistently quantifiable in mice, which is nearly double the number obtained using conventional (i.e., high energy) fluoroscopes. Identification of additional swallow parameters is expected as we optimize the capabilities of this new system. Results thus far demonstrate the utility of using a low energy fluoroscopy system to detect and quantify subtle changes in swallow physiology that may otherwise be overlooked when using high energy fluoroscopes to investigate murine disease models.

This study successfully adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating translational dysphagia research.

Adaptación videofluoroscópicos Swallow Métodos de Estudio Humanos para detectar y caracterizar disfagia en modelos murinos de enfermedades

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Aislamiento de células de la glándula salival del ratón madre

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Biología

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally delivering bioactive compounds to the salivary glands, greater tissue concentrations can be safely achieved versus systemic administration. Furthermore, off target tissue effects from extra-glandular accumulation of material can be dramatically reduced. In this regard, retroductal injection is a widely used method for investigating both salivary gland biology and pathophysiology. Retroductal administration of growth factors, primary cells, adenoviral vectors, and small molecule drugs has been shown to support gland function in the setting of injury. We have previously shown the efficacy of a retroductally injected nanoparticle-siRNA strategy to maintain gland function following irradiation. Here, a highly effective and reproducible method to administer nanomaterials to the murine submandibular gland through Wharton's duct is detailed (Figure 1). We describe accessing the oral cavity and outline the steps necessary to cannulate Wharton's duct, with further observations serving as quality checks throughout the procedure.

Local drug delivery to the submandibular glands is of interest in understanding salivary gland biology and for the development of novel therapeutics. We present an updated and detailed retroductal injection protocol, designed to improve delivery accuracy and experimental reproducibility. The application presented herein is the delivery of polymeric nanoparticles.

Inyección de nanopartículas de Retroductal a la glándula submaxilar de ratón

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Bioingeniería

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. Irreparable cell damage results in a chronic loss of salivary function that impairs basic oral activities, and increases the risk of oral infections and dental caries. Salivary hypofunction and its complications gravely impact a patient's comfort. Current symptomatic management of the condition is ineffective, and newer therapies to assuage the condition are needed. 
Salivary glands are exocrine glands, which expel their secretions into the mouth via excretory ducts. Cannulation of these ducts provides direct access to the glands. Retroductal delivery of a contrast agent to major salivary glands is a routine out-patient procedure for diagnostic imaging. Using a similar procedure, localized treatment of the glands is feasible. However, performing this technique in preclinical studies with small animals poses unique challenges. In this study we describe the technique of retroductal administration in rat submandibular glands, a procedure that was refined in Dr. Bruce Baum's laboratory (NIH)1, and lay out a procedure for local gland irradiation.

Salivary gland hypofunction, a major adverse effect of head and neck radiotherapy diminishes a patient's quality of life. The demonstration of efficacy of new therapies in animal models is a prerequisite before clinical transition. This protocol describes retroductal administration and local irradiation of rat submandibular glands.

Retroductal submandibular Glándula instilación y con localización fraccionado irradiación en un modelo de rata de hipofunción salival

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Inmunología e Infección

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with radiotherapy. Experimental approaches to understanding mechanisms of salivary gland dysfunction and restoration have focused on in vivo models, which are handicapped by an inability to systematically screen therapeutic candidates and efficiencies in transfection capability to manipulate specific genes. The purpose of this salivary gland organotypic culture protocol is to evaluate maximal time of culture viability and characterize cellular changes following ex vivo radiation treatment. We utilized immunofluorescent staining and confocal microscopy to determine when specific cell populations and markers are present during a 30-day culture period. In addition, cellular markers previously reported in in vivo radiation models are evaluated in cultures that are irradiated ex vivo. Moving forward, this method is an attractive platform for rapid ex vivo assessment of murine and human salivary gland tissue responses to therapeutic agents that improve salivary function.

Using three-dimensional organotypic cultures to visualize morphology and functional markers of salivary glands may provide novel insights into the mechanisms of tissue damage following radiation. Described here is a protocol to section, culture, irradiate, stain, and image 50&#8211;90 &#956;m thick salivary gland sections prior to and following exposure to ionizing radiation.

Tratamiento de radiación de cultivos organotípico de glándulas salivales submandibulares y parótidas modelos clave en vivo características

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

Evaluación funcional salival murino mediante pilocarpina estímulo siguiente fraccionado radiación

Resumen

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Capítulos en este video

Canulación de la glándula salival submaxilar del ratón a través del conducto de Wharton

Disminuye la cuantificación cognitivos causados por la radioterapia craneal

Interrogatorio funcional de adultos hipotalámica neurogénesis con focal Radiológica Inhibición

Evaluación de la función de la memoria en ratones epilépticos inducidos por pilocarpina

Adaptación videofluoroscópicos Swallow Métodos de Estudio Humanos para detectar y caracterizar disfagia en modelos murinos de enfermedades

Aislamiento de células de la glándula salival del ratón madre

Inyección de nanopartículas de Retroductal a la glándula submaxilar de ratón

Retroductal submandibular Glándula instilación y con localización fraccionado irradiación en un modelo de rata de hipofunción salival

Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones

Tratamiento de radiación de cultivos organotípico de glándulas salivales submandibulares y parótidas modelos clave en vivo características

Evaluación funcional salival murino mediante pilocarpina estímulo siguiente fraccionado radiación

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Disminuye la cuantificación cognitivos causados ​​por la radioterapia craneal

Interrogatorio funcional de adultos hipotalámica neurogénesis con focal Radiológica Inhibición

Evaluación de la función de la memoria en ratones epilépticos inducidos por pilocarpina

Adaptación videofluoroscópicos Swallow Métodos de Estudio Humanos para detectar y caracterizar disfagia en modelos murinos de enfermedades

Aislamiento de células de la glándula salival del ratón madre

Inyección de nanopartículas de Retroductal a la glándula submaxilar de ratón

Retroductal submandibular Glándula instilación y con localización fraccionado irradiación en un modelo de rata de hipofunción salival

Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones

Tratamiento de radiación de cultivos organotípico de glándulas salivales submandibulares y parótidas modelos clave en vivo características

Disminuye la cuantificación cognitivos causados por la radioterapia craneal