Esta investigación fue apoyada por el Brigham &amp; Women&#39;s Hospital y la March of Dimes. Los autores desean agradecer a todos los miembros del Whited Lab por su apoyo y asesoramiento.

Todos axolotl experimentación se realizó de acuerdo con Brigham y Women&#39;s Hospital (BWH) Institucional Cuidado de Animales y el Comité de Uso. 1. Configure Experimento de Perfusión <ol><li> Coloque un axolotl adulto en un recipiente de plástico lleno de solución de tricaína al 0,1% (MS222) durante 15-20 min o hasta anestesiar completamente. Asegúrese de que el recipiente esté lleno de suficiente solución de tricaína de modo que el axolotl esté completamente sumergido. Nota: Todos los procedimientos deben realizarse de acuerdo con las pautas institucionales de cuidado de los animales. En BWH, un axolotl se considera anestesiado completamente cuando falla una prueba de la pinzadura del pie, significando allí no es movimiento reflexivo cuando el pie es apretado suavemente. Precaución: Aunque tricaine es un anestésico específicamente utilizado para organismos acuáticos, se debe evitar el contacto directo de la piel con la solución de tricaína. </li><li> Establecer la estación de perfusión axolotl. <ol><li> Colocar elAbsorbente sobre una superficie plana y nivelada con el lado absorbente hacia arriba. </li><li> Cortar un agujero en el marco de espuma de poliestireno que es el tamaño y la forma adecuada para el axolotl anestesiado para establecer en posición supina. Coloque el marco sobre la almohadilla absorbente. Nota: Algunas toallas de papel adicionales se pueden colocar inmediatamente debajo del marco para una absorción adicional. </li><li> Cargue la bomba peristáltica con el tubo de perfusión. Ajuste la bomba a un caudal de 0,7 ml / min, fluyendo en el sentido de las agujas del reloj. </li><li> Hacer la solución diluida con 0,7x PBS y 5% de glucosa en una mezcla 1: 4. </li><li> Mezclar 10 ml de solución diluyente con 200 μl de la solución madre DiI en un tubo cónico de 50 ml. Tape y mezcle por inversión. Cubra este tubo con papel de aluminio para proteger la solución de trabajo de la exposición a la luz. Nota: Los volúmenes deben cambiarse proporcionalmente según el tamaño del axolotl. Estos valores son para un axolotl de aproximadamente 15 cm (longitud de hocico a cola). UNLos nimales de este tamaño pueden no haber alcanzado la madurez sexual completa, por lo que el sexo animal no se puede determinar en este momento. </li><li> Llenar un tubo cónico de 50 ml con PBS 0,7x. Nota: Se utilizará PBS para cebar el lazo y la exsanguinación axolotl. </li><li> Conecte la aguja de mariposa de calibre 27 al extremo de salida de la tubería de perfusión. Doble las alas de la mariposa sobre el otro y coloque en el soporte de la abrazadera. </li><li> Coloque el extremo libre de la tubería de perfusión en el tubo cónico de 50 ml lleno de PBS 0,7x y haga funcionar la bomba de perfusión hasta que se llene toda la tubería con solución. Detenga la bomba una vez que el tubo completo esté lleno de PBS. Nota: Asegúrese de que el tubo esté libre de burbujas de aire en todo momento, ya que causarán embolias aéreas en el axolotl y evitarán la perfusión completa. </li><li> Coloque una toalla de papel en el molde en forma de axolotl en el marco de espuma de poliestireno. Utilizando una pipeta de transferencia, remoje la toalla con solución de tricaína. Nota: Cortar un pequeño cuadrado en el medio del remolque de papelEl para permitir el drenaje de fluidos durante el procedimiento de perfusión. </li><li> Coloque el axolotl supinado anestesiado sobre la toalla de papel dentro del marco de espuma de poliestireno. </li></ol></li></ol> 2. Apertura del tórax Axolotl <ol><li> Utilice una pinza quirúrgica para pellizcar la piel a lo largo del eje central del tórax del axolotl, justo debajo de la línea de los hombros. Levantar. </li><li> Utilice un bisturí para hacer una pequeña incisión donde se ha retirado la piel. </li><li> Quitar un parche cuadrado de piel sobre el pecho para revelar dos placas de cartílago. <ol><li> Quitar la piel para abrir una ventana sobre la cavidad torácica lo suficientemente grande como para ver claramente el corazón y aproximadamente 5 mm de la aorta se ramifica fuera del corazón. </li></ol></li><li> Cuidadosamente romper el tejido conectivo con fórceps o las tijeras cerradas con el fin de evitar el corte de los vasos sanguíneos principales. </li><li> Levante cada placa de cartílago individualmente usando la pinza y sáquelaCon las tijeras quirúrgicas. </li><li> Cuidadosamente pellizque el pericardio con la pinza, tire hacia arriba y pinche con las tijeras quirúrgicas; Esta incisión debe ser lo suficientemente profunda como para perforar el pericardio muy delgado y debe ser lo suficientemente grande para permitir la eliminación del pericardio. Tenga cuidado de no cortar el corazón. </li><li> Delicadamente quitar el pericardio para exponer el corazón y la aorta. Nota: Utilizando una pipeta de transferencia, enjuague periódicamente la cavidad torácica y las branquias con solución de tricaína para mantener la zona libre y mantener el axolotl anestesiado. </li></ol> 3. Perfusión del Axolotl <ol><li> Coloque el soporte de la abrazadera con la aguja de mariposa cargada junto al bastidor de espuma de poliestireno, de manera que el brazo de la abrazadera pueda manipularse fácilmente para insertar la aguja en la aorta axolotl. Apunte la punta de la aguja hacia el aspecto rostral del animal durante la inserción y mantenga la aguja paralela a la aorta para evitar perforarla a través de la operaciónLado positivo </li><li> Encienda la bomba peristáltica. 0.7x PBS debe continuar fluyendo a través de la tubería. </li><li> Inserte la aguja en la aorta. <ol><li> Deslice la pinza bajo el arco aórtico y levántela ligeramente para permitir un fácil acceso. </li><li> Maniobrar la combinación de aguja-abrazadera de modo que la aguja se extienda a lo largo de la aorta, apuntando hacia la cabeza. Inserte la aguja mientras usa el fórceps para apoyo detrás de la aorta. Nota: La aguja debe insertarse lo suficientemente profundo en la aorta para asegurar que no se resbale durante la perfusión. Esto puede ser de aproximadamente 5 mm para un axolotl de 15 cm. Asegúrese de que la aguja esté perfectamente alineada con la aorta para evitar una punción completa del vaso. Los pinchazos directos pueden causar hemorragia masiva y disminuir las tasas de éxito de la perfusión. La inserción exitosa puede ser confirmada por la ampliación visible de las aurículas del corazón. </li></ol></li><li> Rápidamente lacerar un atrio con el sciSsors y permitir que la sangre se drene. <ol><li> Enjuague con solución de tricaína para prevenir la acumulación de sangre y la formación de coágulos en la cavidad torácica. </li></ol></li><li> Perfundir el axolotl con aproximadamente 20-30 mL de PBS. El animal debe cambiar de color rosa claro a blanco en una perfusión exitosa. </li><li> Haga una pausa en la bomba peristáltica y mueva el extremo libre del tubo en el tubo de 15 ml de solución DiI. Reinicie la bomba, tenga cuidado de no crear burbujas de aire en el tubo. </li><li> Perfundir el axolotl con todo el stock de trabajo de DiI. Nota: En una perfusión exitosa, el axolotl con cambio de color al rosa brillante del DiI. Esto será más notable en las branquias. </li><li> Pausa la bomba después de la perfusión con DiI es completa y coloque el extremo libre de la tubería en 4% paraformaldehído (PFA) solución para fijar el tejido. Reinicie la bomba y perfuse al menos 10 ml de PFA. Precaución: PFA es tóxico y debe ser manipulado y dispoSed de manera apropiada. Se deben usar guantes y gafas de seguridad, y las soluciones deben hacerse dentro de una campana extractora. La perfusión del axolotl con PFA para fijar el tejido resulta en la muerte del animal. </li></ol> 4. Finalización de la perfusión y preparación de visualización <ol><li> Detenga la bomba peristáltica y retire la aguja de la aorta axolotl. </li><li> Coloque el axolotl en una placa de plástico. Nota: El uso de una mitad de una placa de Petri grande funciona bien y permite verter una pequeña cantidad de Tricaine o PBS en el axolotl para mantener su piel húmeda y mejorar la calidad de visualización. </li><li> Deseche todos los materiales usados ​​en los contenedores de desechos apropiados. Limpiar las herramientas quirúrgicas con etanol al 70%, desinfectar con un esterilizador de vidrio entre animales y esterilizar en autoclave siguiendo el procedimiento. Enjuague el tubo con la solución de PBS y luego drene, seque completamente y guárdelo para su uso posterior. </li></ol> 5. Visualización del Axolotl Perfecto <oL <li> Coloque el axolotl bajo un microscopio confocal fluorescente. </li><li> Apague las luces, ya que la visualización de los vasos teñidos por DiI es impedida por la luz. </li><li> Utilice un cubo de filtro de emisión de fluorescencia verde ( por ejemplo, ET-CY3) con el microscopio confocal para visualizar la vasculatura del axolotl. Utilice una luz de excitación de 545 nm de longitud de onda. Nota: Para obtener una imagen de alta calidad, se pueden utilizar los siguientes parámetros: exposición de 1,1 s, ganancia de 1x, saturación de 1,0, aumento de 2X. </li></ol>

<ol>
	<li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels.">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels.">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374 (2013).</li><li> Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Scanning+electron+microscopy+and+vascular+corrosion+casting+for+the+characterization+of+microvascular+networks+in+human+and+animal+tissues."> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li><li> Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+DiI+and+DiO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing."> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells.">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+TALEN-mediated+gene+editing+of+an+endogenous+locus+in+axolotl.">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li><li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine.">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li><li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration.">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La visualización de la vasculatura del axolotl puede lograrse con éxito mediante la perfusión con el colorante de carbocianina lipófilo, DiI. En este estudio se describe un nuevo protocolo para la perfusión del axolotl con DiI utilizando una bomba peristáltica. También se muestra la posterior visualización de la vasculatura axolotl utilizando un microscopio confocal fluorescente. Este protocolo fue una adaptación del protocolo de perfusión DiI de roedor observado en Li et al. 7 , sin embargo diferencias importantes entre el roedor y el axolotl requirieron una revisión del protocolo para ajustarse al modelo axolotl. Este estudio discute un método de perfusión DiI del axolotl con el fin de visualizar con éxito la vasculatura. Las diferencias en la anatomía y la fisiología entre la salamandra y el roedor requieren alteraciones en los aspectos principales de la perfusión, incluyendo la localización de la inserción de la aguja, el método de perfusión y los reactivos utilizados. Con el fin deCreemos una perfusión exitosa, limitamos el daño hecho a la vasculatura del axolotl. Al abrir la cavidad torácica, se tuvo cuidado de exponer completamente el corazón y la aorta evitando cualquier daño o laceraciones a los vasos sanguíneos principales. La limitación del uso de las tijeras quirúrgicas evitó el recorte accidental de los vasos mayores mientras que las incisiones pequeñas mantuvieron el control sobre la exposición del corazón y la aorta. Las tasas de éxito de las perfusiones también aumentaron cuando la aguja DII se insertó a través de la aorta, en lugar de directamente en las cámaras del corazón. El axolotl, a diferencia del ratón, tiene un corazón de tres cámaras, que contiene sólo un ventrículo con una musculatura significativamente menor que la del ratón. Debido a estas diferencias, la localización de la inserción de la aguja tuvo que ser movida a la aorta más estable. Se determinó que la aorta era la localización óptima para la inserción de la aguja de perfusión, ya que es lo suficientemente grande para la punción por una aguja de 27 G y tiene movimiento limitado. El movimiento fue mínimoCon el fin de evitar el retiro accidental o el deslizamiento de la aguja de perfusión o la perforación pasante de la aorta. Las perfusiones cardíacas que usaban el ventrículo como punto de inserción demostraron tener una tasa de éxito mucho menor que aquellas con un punto de inserción aórtico. La punción errónea de la vasculatura a menudo da lugar a la formación de embolia oa la perfusión prevenida, dando como resultado tasas muy bajas de marcaje vascular exitoso. Utilizando un soporte de sujeción para sujetar la aguja de la mariposa durante la perfusión, hemos disminuido su movimiento, aumentando así la tasa de perfusiones exitosas. Además, debido a la delicadeza del tejido axolotl, en comparación con el ratón, era necesaria una bomba de perfusión peristáltica, en contraposición a la perfusión manual previamente utilizada. El uso de esta bomba permitió una aproximación manos libres a la perfusión de axolotl para minimizar la punción equivocada de los tejidos finos. Perfusiones no tuvieron éxito por muchas razones adicionales, incluyendo a través de y-a través de punctUre, la coagulación y la embolia. En el caso de que la aguja se inserta en la aorta y se crea una segunda punción a través de la pared posterior, la solución DiI fluiría directamente a la cavidad torácica en lugar de pasar a través de la circulación sistémica. Además, una vez que la sangre salió de la vasculatura, rápidamente formó un coágulo de sangre que podría impedir la perfusión. También podrían formarse coágulos y burbujas de aire en la vasculatura, causando embolias que impiden una perfusión exitosa. Por último, este protocolo incorporó reactivos ajustados para ajustarse a la osmolalidad axolotl, que difiere significativamente de la del mamífero. La adaptación de este protocolo y los cambios significativos realizados para ajustarse al modelo axolotl ayudarán a comprender el proceso de revascularización de los tejidos durante la regeneración. DiI, que es de color rosa, perfundirá el animal y le dará un color rosa brillante. Los axolotes perfectamente perfundidos se volvieron de color rosa brillante a simple vista,Regiones vascularizadas que aparecen más intensamente teñidas. Los animales perfundidos vistos con un microscopio confocal fluorescente usando un filtro verde se pueden visualizar en el espectro de emisión rojo-anaranjado. La vasculatura se visualizó mejor en tejidos más delgados que minimizaron la tinción accidental de DI de tejidos no vasculares. Perfusión del tejido con 4% de paraformaldehído (PFA) inmediatamente después de la perfusión DII debe hacerse para fijar el tejido. Las perfusiones DiI son experimentos de punto final para el axolotl. Durante el procedimiento, toda la sangre del animal se drena eficazmente y se reemplaza con PBS 0,7x, seguida inmediatamente por solución DiI, y finalmente PFA al 4%. Esto interrumpe la capacidad del axolotl para participar en el acto vital del intercambio de gas y pierde la capacidad de oxigenar sus tejidos del cuerpo. Debido a esta naturaleza de punto final, cada perfusión capta solamente un único punto de tiempo de crecimiento vascular, y el animal no puede ser perfundido más adelante en un momento posterior. Debido a este tiempo-limiTante, se deben utilizar múltiples animales para describir un curso del tiempo de desarrollo vascular. Este protocolo DiI, y las modificaciones aplicadas para mejorarlo, pueden usarse para etiquetar y visualizar con éxito la vasculatura del axolotl. Dado que el axolotl es un organismo modelo esencial para el estudio de la regeneración, las perfusiones exitosas abren oportunidades para interrogar el proceso de angiogénesis durante la regeneración. El axolotl es un organismo modelo para el estudio de la regeneración porque es un animal neotenous y por lo tanto conserva una capacidad notable de regenerar a través de la edad adulta 8 . Sin embargo, el proceso de revascularización de los tejidos regeneradores no es bien comprendido, por lo que la adaptación de la perfusión DiI al sistema axolotl presenta oportunidades para entender la regeneración que no estaban disponibles con el modelo de mamífero. La perfusión del axolotl usando DiI es una técnica novedosa para el estudio de revasCularización del tejido regenerador en este modelo animal, por lo tanto, este protocolo puede utilizarse además para comprender la organogénesis durante el desarrollo y la angiogénesis durante la enfermedad, así como ser utilizado como una herramienta importante durante el estudio de la regeneración.

La visualización de la vasculatura desempeña un papel vital en la comprensión de la estructura y función de los organismos a través de muchas especies. A partir del siglo XVI con Leonardo da Vinci, se han estudiado modelos y representaciones gráficas de la circulación 1 . Usando ceras y moldes de caucho, los tejidos fueron perfundidos para crear modelos tridimensionales de la vasculatura, lo que permitió el estudio de la organogénesis y la patogénesis [ 1 , 2] . Las resinas y las ceras se colorearon con tintes tales como tinta India o rojo carmín para permitir su fácil visualización 1 , 2 . Sin embargo, estas técnicas causaron muchos problemas debido a que sus altas viscosidades impidieron la perfusión total del tejido de interés 1 . A medida que el campo se hizo más sofisticado, el uso de microscopios confocales y electrónicos entró en juego, moviendo la técnica de perfusión<html> Lejos de los moldes y hacia perfusiones líquidas de la vasculatura, algunas de las cuales permitieron la perfusión y la imagen de los vasos sanguíneos sin destruir el tejido inicial 3 . DiI, un colorante de carbocianina fluorescente, es una de tales manchas que permite la perfusión de animales sin dañar el tejido vascular. Los colorantes de carbocianina son tintes lipófilos que se incorporan en las membranas celulares al contacto. Estos colorantes permiten una tinción fácil e instantánea de las células endoteliales vasculares, que pueden ser vistas después bajo un microscopio confocal fluorescente. DiI se mueve a través de la difusión lateral en la membrana lipídica de las células, como se muestra en el etiquetado y rastreo de las neuronas [ 4] . Quımicamente, las dos cadenas alquılicas de DiI dan al tinte su alta afinidad por las membranas celulares, mientras que dos anillos conjugados de un fluorocromo que es responsable de emitir una longitud de onda roja cuando son excitados por filtros de luz fluorescente verde&gt; 4. DiI se ha utilizado en muchas capacidades, incluyendo el etiquetado exitoso de la membrana plasmática y marcaje anterógrado y retrógrado en las neuronas [ 5 , 6] . DiI se ha utilizado previamente en los protocolos de perfusión, mientras que la visualización de la vasculatura de ratones [ 7] . Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) son salamandras que viven exclusivamente en lagos salobres cerca de la Ciudad de México, México. Estos animales se han convertido en un modelo importante para la comprensión de los procesos regenerativos, ya que pueden regenerar los miembros completos, la cola (incluyendo el cordón nervioso), las porciones del corazón y otros órganos internos y las porciones del ojo como adultos 8 , 9 . Además, con la reciente aplicación de herramientas genéticas en axolotls, una visión sin precedentes en las moléculas y las células que conducen estos procesos es ahora posible 8 . El exitoso regeneRación de una extremidad entera requiere un proceso extensivo de la revascularización, que puede desempeñar un papel significativo en la regeneración más allá de las funciones tradicionales de los vasos sanguíneos en proporcionar el oxígeno y los alimentos. Entender la revascularización en el contexto de la regeneración tisular es imperativo. Axolotl vasos sanguíneos han sido previamente visualizados con India Ink, y si bien los resultados fueron intrigantes, este proceso no ha sido revisado en las décadas posteriores [ 10] . Se intentó adaptar un protocolo de perfusión DII desarrollado para su uso en mamíferos para permitir una completa perfusión y visualización de la axolotl vascular 7 . Este protocolo describe las medidas tomadas para perfusar con éxito y posteriormente visualizar la circulación del axolotl con una técnica de tinción DII. Este procedimiento permitirá una visualización precisa de los vasos sanguíneos patentes en tejidos homeostáticos, así como en tejidos regeneradores, y proporciona un nuevo método para la visualizaciónN y análisis del proceso de revascularización en axolotl.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1583">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:405px;">Peristaltic Pump&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Marshall Scientific&#160;</td>
			<td style="width:152px;">RD-RP1</td>
			<td style="width:831px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">Perfusion tubing</td>
			<td style="width:195px;">Excelon Lab &#38; Vacuum Tubing</td>
			<td>436901705</td>
			<td>size S1A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">27g butterfly needle</td>
			<td style="width:195px;">EXELint Medical Products</td>
			<td>26709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">NaCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">KCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7747-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Distilled water</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFischer</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ethanol (100% vol/vol)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Surgical foreceps&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>MDG0748741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Polystyrene foam frame</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>any polystyrene foam square with an axolotl-shaped&#160; cut out</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>DYND04025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Scalpel&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>MDS15210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Absorbent underpad</td>
			<td style="width:195px;">Avacare Medical</td>
			<td>PKUFSx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Paper towels</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Standard disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:195px;">Fisherbrand</td>
			<td>50216954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Clamp stand</td>
			<td style="width:195px;">Adafruit</td>
			<td style="width:152px;">291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Tricaine powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Adult axolotl</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">MgSO4</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">CaCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Plastic tanks</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Varying size appropriate for the axolotl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Axolotl</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Leica Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">ET-CY3 Fluorescent Filter</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum

Las técnicas de perfusión se han utilizado durante siglos para visualizar la circulación de los tejidos. Axolotl (Ambystoma mexicanum) es una especie de salamandra que ha surgido como un modelo esencial para los estudios de regeneración. Poco se sabe acerca de cómo se produce la revascularización en el contexto de la regeneración en estos animales. Aquí presentamos un método simple para la visualización de la vasculatura en axolotl vía perfusión de 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI). DiI es un colorante de carbocianina lipofílico que se inserta en la membrana plasmática de las células endoteliales instantáneamente. La perfusión se realiza usando una bomba peristáltica de tal manera que DiI entra en la circulación a través de la aorta. Durante la perfusión, el colorante fluye a través de los vasos sanguíneos del axolotl e incorpora en la bicapa lipídica de las células endoteliales vasculares al contacto. El procedimiento de perfusión dura aproximadamente una hora para un axolotl de ocho pulgadas. Inmediatamente después de la perfusión,Th DiI, el axolotl se puede visualizar con un microscopio confocal fluorescente. El DiI emite luz en el rango naranja-rojo cuando se excita con un filtro fluorescente verde. Este procedimiento de perfusión DiI puede usarse para visualizar la estructura vascular de los axolotes o para demostrar patrones de revascularización en tejidos regeneradores.

<html> Con la tinción DiI, la vasculatura del axolotl se puede visualizar fácilmente. Los vasos sanguíneos de los animales perfundidos con el colorante lipófilo son inmediatamente visibles bajo un microscopio fluorescente confocal. La figura 1 .1-1.5 es una representación esquemática del protocolo de perfusión. Después de la perfusión con el colorante rosa brillante, un axolotl perfectamente perfundido aparecerá rosa. Usando un filtro fluorescente verde en un microscopio confocal aparecerá una emisión roja de la red vascular. La tinción DiI ocurre en todos los tejidos corporales cuando la perfusión es exitosa, incluyendo la cola, las extremidades, las branquias y los ojos ( Figura 2A , Figura 2B , Figura 2D , repectivamente). Las perfusiones sin éxito producen una falta de vasos sanguíneos manchados de rojo o una tinción irregular de los vasos. Ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55740/55740fig1.jpg" /> Figura 1: Esquema del protocolo de perfusión. Los axolotl perfundidos con éxito con el colorante lipofílico, DiI, demuestran una tinción completa de la vasculatura tras la formación de imágenes. 1: Axolotl supino total antes del experimento de perfusión. 2: Apertura del cofre del axolotl. 2: Axolotl con una cavidad torácica abierta. 3: Inserción de la aguja de la mariposa 27 G en la aorta del axolotl. 4: La tubería debe contener primero PBS 0,7x, luego la solución de trabajo DiI, y finalmente PFA al 4%. 5: Axolotls completamente perfundidos aparecen rosa. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55740/55740fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55740/55740fig2.jpg" /> Figura 2: Imágenes de un Axolo completamente perfundidoTl Las imágenes de la vasculatura axolotl se tomaron usando un microscopio confocal fluorescente después de una perfusión exitosa con la tinción DiI. 2A: Cola. 2B: Pie. 2C: Branquias. 2D: Ojo. La imagen se realiza utilizando un microscopio confocal con un cubo de filtro de emisión fluorescente verde. La ampliación para las imágenes A, B, C y D son 1.74X, 2.16X, 1.18X y 5.69X, respectivamente. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55740/55740fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Usando una técnica lipofílica de tinción de perclorato de 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetrametilindocarbocianina (DiI), Ambystoma mexicanum puede someterse a perfusión vascular para permitir una fácil visualización de la vasculatura.

La perfusión como un método para la visualización vascular<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

9.8K vistas.  Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital.  Usando una técnica lipofílica de tinción de perclorato de 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina (DiI), Ambystoma mexicanum puede someterse a perfusión vascular para permitir una fácil visualización de la vasculatura. 

Video: DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Un método simple para determinar el genotipo exacto

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Investigación

Biología

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

El uso de Rotorod como un método para el análisis cualitativo de la Ruta de la rata

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

La visualización de Caenorhabditis Elegans Estructuras de la cutícula uso del colorante lipofílico Vital, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Un método simple para imágenes Arabidopsis Uso de hojas perfluorodecalina como un medio de imágenes infiltrativas

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Visualización de Ca Vascular 2 + Señalización desencadenada por paracrina derivados ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging en hidrogeles tridimensionales

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares