وأيد هذا البحث من قبل مستشفى بريغهام والمرأة ومارس دايمس. ويود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء مختبر وايتيد على دعمهم ومشورتهم.

تم إجراء جميع التجارب أكسيولوتل وفقا ل بريغهام ومستشفى المرأة (بو) المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة. 1. إعداد تجربة الإرواء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أكسولوتل الكبار في حاوية بلاستيكية مليئة 0.1٪ تريكين حل (MS222) لمدة 15-20 دقيقة أو حتى تخدير تماما. تأكد من أن الحاوية مليئة ما يكفي من محلول تريكين بحيث يتم المغمورة تماما أكسولوتل. ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان المؤسسية. في بو، يعتبر أكسولوتل تخدير كامل عندما يفشل اختبار قرصة القدم، وهذا يعني أنه لا يوجد حركة الانعكاسية عندما يتم تقلص القدم بلطف. الحذر: على الرغم من تريكين هو مخدر تستخدم خصيصا للكائنات المائية، وينبغي تجنب ملامسة الجلد مباشرة مع الحل تريكين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محطة نضح أكسولوتل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الوسادة ماصة على شقة، سطح مستو مع الجانب ماص مواجهة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع حفرة في إطار رغوة البوليسترين الذي هو الحجم المناسب والشكل ل أكسولوتل تخدير لوضعها في موقف ضعيف. وضع الإطار على وسادة ماصة. ملاحظة: يمكن وضع بعض المناشف الورقية الإضافية مباشرة تحت الإطار لمزيد من الامتصاصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل مضخة تحوي مع أنابيب نضح. تعيين المضخة إلى معدل تدفق 0.7 مل / دقيقة، وتتدفق في اتجاه عقارب الساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الحل المخفف مع برنامج تلفزيوني 0.7x و 5٪ الجلوكوز في خليط 1: 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 10 مل من محلول مخفف مع 200 ميكرولتر من حل الأسهم ديي في أنبوب مخروطي 50 مل. كاب ومزيج من انعكاس. تغطية هذا الأنبوب مع رقائق الألومنيوم ورقة لحماية حل العمل من التعرض للضوء. ملاحظة: يجب تغيير الأحجام وفقا لحجم أكسولوتل نسبيا. هذه القيم هي حوالي 15 سم أكسولوتل (طول الذيل إلى الذيل). انيمالس من هذا الحجم قد لا تكون قد وصلت إلى النضج الجنسي الكامل حتى الجنس الحيوان قد لا يتم تحديدها في هذا الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أنبوب مخروطي 50 مل مع برنامج تلفزيوني 0.7x. ملاحظة: سيتم استخدام برنامج تلفزيوني لتشكيل الحلقة و إكسولانغيناتيون أكسولوتل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق إبرة فراشة 27 قياس إلى نهاية خروج أنابيب نضح. أضعاف أجنحة فراشة على بعضها البعض ومكان في موقف المشبك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع نهاية حرة من أنابيب نضح في أنبوب مخروطي 50 مل مليئة برنامج تلفزيوني 0.7X وتشغيل مضخة نضح حتى يتم تعبئة كامل أنابيب مع الحل. وقفة المضخة مرة واحدة يتم ملء أنابيب بأكملها مع برنامج تلفزيوني. ملاحظة: تأكد من أنابيب خالية من فقاعات الهواء في جميع الأوقات، وهذه سوف تسبب صمة الهواء في أكسولوتل ومنع نضح الكامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع منشفة ورقية في العفن على شكل أكسولوتل في إطار رغوة البوليسترين. باستخدام ماصة نقل، نقع منشفة مع الحل تريكين. ملاحظة: قطع مربع صغير في منتصف سحب الورقإل للسماح لتصريف السوائل أثناء إجراء التروية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مستحلب أكسولوتل مستلق على منشفة ورقية داخل إطار رغوة البوليسترين. </li></ol></li></ol> 2. فتح الصدر أكسولوتل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط الجراحية لقرصة الجلد على طول المحور المركزي للصدر أكسولوتل، فقط تحت خط الكتفين. اسحب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مشرط لجعل شق صغير حيث تم سحب الجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة التصحيح مربع من الجلد على صدره من أجل الكشف عن اثنين من لوحات الغضروف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجلد لفتح نافذة على التجويف الصدري كبيرة بما فيه الكفاية لرؤية بوضوح القلب وحوالي 5 ملم من الشريان الأورطي المتفرعة من القلب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمزيق الأنسجة الضامة بعناية باستخدام ملقط أو مقص مغلقة من أجل تجنب قطع أي الأوعية الدموية الرئيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع كل لوحة الغضروف بشكل فردي باستخدام ملقط ومكوس لهم ثإيث مقص جراحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قرصة بعناية التامور مع ملقط، سحب ما يصل، وثقب ذلك باستخدام مقص جراحي. وينبغي أن يكون هذا شق عميق فقط بما فيه الكفاية لثقب التامور رقيقة جدا، وينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي للسماح لإزالة التامور. الحرص على عدم قطع القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بدقة التامور لفضح القلب والشريان الأبهر. ملاحظة: باستخدام ماصة نقل، دافق بشكل دوري تجويف الصدر والخياشيم مع حل تريكين للحفاظ على المنطقة واضحة والحفاظ على تخدير أكسولوتل. </li></ol> 3. إرواء أكسولوتل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع موقف المشبك مع إبرة فراشة تحميل بجانب إطار رغوة البوليسترين، بحيث يمكن بسهولة التلاعب في ذراع المشبك لإدراج الإبرة في الشريان الأبهر أكسولوتل. نقطة طرف الإبرة نحو الجانب منقاري من الحيوان خلال الإدراج والحفاظ على موازية الإبرة إلى الشريان الأبهر لتجنب ثقب ذلك من خلال المرجعبوسيت الجانب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مضخة تحوي. وينبغي أن يستمر برنامج تلفزيوني 0.7X في التدفق من خلال الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الإبرة في الشريان الأبهر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حرك الملقط تحت القوس الأبهر وسحب ما يصل قليلا للسماح لسهولة الوصول إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مناورة مجموعة إبرة المشبك مثل أن الإبرة يمتد على طول الشريان الأبهر، لافتا نحو الرأس. إدراج الإبرة أثناء استخدام ملقط للدعم وراء الشريان الأبهر. ملاحظة: يجب إدراج إبرة عميقة بما فيه الكفاية في الشريان الأورطي للتأكد من أنها لن تنزلق خلال نضح. قد يكون هذا حوالي 5 ملم ل 15 سم أكسولوتل. تأكد من أن الإبرة هو تماما في خط مع الشريان الأبهر لتجنب ثقب كامل من السفينة. من خلال-- من خلال-- ثقب من خلال يمكن أن يسبب نزيف هائل ونقصان معدلات نجاح نضح. يمكن تأكيد الإدراج الناجح عن طريق توسيع مرئية من أتريا القلب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة تمزيق أتريوم واحد مع الخيال العلميسسورس والسماح الدم لاستنزاف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دافق مع حل تريكين لمنع تراكم الدم وتشكل الجلطة في تجويف الصدر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي أكسولوتل مع حوالي 20-30 مل من برنامج تلفزيوني. الحيوان يجب أن تتغير من الضوء الوردي في اللون إلى الأبيض في نضح ناجحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقفة مضخة تحوي ونقل نهاية خالية من الأنابيب في أنبوب 15 مل من حل الجاذبة. إعادة تشغيل المضخة، ورعاية لتجنب خلق أي فقاعات الهواء في الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي أكسولوتل مع الأسهم العمل بأكمله من الجاذبة. ملاحظة: في نضح ناجحة، و أكسولوتل مع تغيير اللون إلى الوردي مشرق من الجاذبة. وهذا سيكون أكثر وضوحا في الخياشيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقفة مضخة بعد نضح مع الجاذبة كاملة ووضع نهاية حرة من الأنابيب إلى 4٪ بارافورمالدهيد (بفا) حل لإصلاح الأنسجة. إعادة تشغيل مضخة وإرواء لا يقل عن 10 مل من بفا. الحذر: بفا هو سامة ويجب التعامل معها و ديسبوسيد من المناسب. يجب ارتداء القفازات ونظارات السلامة، ويجب أن تكون الحلول داخل غطاء الدخان. إرواء من أكسولوتل مع بفا لإصلاح نتائج الأنسجة في وفاة الحيوان. </li></ol> 4. إنهاء الإرواء والتصور التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف مضخة تحوي وإزالة الإبرة من الشريان الأبهر أكسولوتل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أكسولوتل على لوحة من البلاستيك. ملاحظة: استخدام نصف طبق بتري كبير يعمل بشكل جيد ويسمح لصب كمية صغيرة من تريكين أو برنامج تلفزيوني على أكسولوتل للحفاظ على بشرتها الرطب وتحسين جودة التصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلص من جميع المواد المستخدمة في صناديق النفايات المناسبة. تنظيف الأدوات الجراحية مع الايثانول 70٪، وتطهير باستخدام معقم الزجاج حبة بين الحيوانات، وتعقيم عن طريق التعقيم بعد الإجراء. تدفق أنابيب مع الحل بس ومن ثم استنزاف، تجف تماما، وتخزين لمزيد من الاستخدام. </li></ol> 5. التصور بيرفوسد أكسولوتل <oل&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أكسولوتل تحت المجهر متحد البؤر الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف الأضواء كما التصور من الأوعية الملوثة الجاذبة هو عائق من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأخضر مضان مرشح تصفية الانبعاثات (على سبيل المثال إت-CY3) مع المجهر متحد البؤر لتصور الأوعية الدموية من أكسولوتل. استخدام ضوء الإثارة من الطول الموجي 545 نانومتر. ملاحظة: للحصول على صورة ذات جودة عالية، يمكن استخدام المعلمات التالية: التعرض ل 1.1 ثانية، وكسب 1X، والتشبع من 1.0، والتكبير 2X. </li></ol>

<ol>
	<li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels.">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels.">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374 (2013).</li><li> Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Scanning+electron+microscopy+and+vascular+corrosion+casting+for+the+characterization+of+microvascular+networks+in+human+and+animal+tissues."> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li><li> Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+DiI+and+DiO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing."> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells.">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+TALEN-mediated+gene+editing+of+an+endogenous+locus+in+axolotl.">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li><li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine.">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li><li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration.">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

التصور من الأوعية الدموية من أكسولوتل يمكن أن يتحقق بنجاح عن طريق نضح مع صبغ كاربوسيانين محبة للدهون، الجاذبة. في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكول رواية لنضح من أكسولوتل مع الجاذبة باستخدام مضخة تحوي. وتبين لنا أيضا التصور اللاحق من الأوعية الدموية أكسولوتل باستخدام المجهر متحد البؤر الفلورسنت. وكان هذا البروتوكول التكيف من القوارض بروتوكول نضح الجاذب ينظر في لي وآخرون. 7 ، ولكن الاختلافات الرئيسية بين القوارض و أكسولوتل يتطلب تنقيح البروتوكول لتناسب نموذج أكسولوتل. هذه الدراسة يناقش طريقة نضح الجاذبة من أكسولوتل من أجل تصور بنجاح الأوعية الدموية. الاختلافات في علم التشريح وعلم وظائف الأعضاء بين السمندل والقوارض تغيرات الطلب في الجوانب الرئيسية للنضح، بما في ذلك موقع إدخال الإبرة، وطريقة نضح، والكواشف المستخدمة. من أجل أتشإيفي نضح ناجحة، نحن محدودة الأضرار التي لحقت الأوعية الدموية من أكسولوتل. في حين فتح تجويف الصدر، اتخذت الرعاية للكشف عن القلب والشريان الأورطي تماما مع تجنب أي ضرر أو تمزقات الأوعية الدموية الرئيسية. الحد من استخدام المقص الجراحي منعت قطع عرضي من السفن الرئيسية في حين شقوق صغيرة الحفاظ على السيطرة على التعرض للقلب والشريان الأبهر. كما زادت معدلات نجاح بيرفوسيونس عندما تم إدخال إبرة الجاذبة من خلال الشريان الأبهر، وليس مباشرة إلى غرف القلب. و أكسولوتل، على عكس الماوس، لديه ثلاثة غرف غرف، تحتوي على بطين واحد فقط مع أقل بكثير من العضلات من الماوس. وبسبب هذه الاختلافات، كان يجب أن يتم نقل موقع إدخال الإبرة إلى الشريان الأورطي أكثر استقرارا. تم تحديد الشريان الأورطي ليكون الموقع الأمثل لإدراج إبرة نضح كما أنها كبيرة بما يكفي لثقب من قبل إبرة 27 G ولها حركة محدودة. وكانت الحركة إلى أدنى حدإيز من أجل تجنب إزالة عرضي أو الانزلاق من إبرة نضح أو من خلال و من خلال ثقب الشريان الأبهر. أثبتت عمليات الإيقاع القلبي باستخدام البطين كنقطة الإدراج أن معدل نجاحه أقل بكثير من معدل الإصابة بقسم الشريان الأورطي. ثقب خاطئ من الأوعية الدموية غالبا ما أدى إلى تشكيل صمات أو منع نضح، مما أدى إلى معدلات منخفضة جدا من الوسم الناجحة الأوعية الدموية. باستخدام حامل المشبك لعقد إبرة فراشة خلال نضح، ونحن قد انخفض حركتها، وبالتالي زيادة معدل الإيقاع ناجحة. بالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلك إلى حساسية الأنسجة أكسولوتل، بالمقارنة مع الماوس، كانت مضخة نضح تحوي اللازمة، على عكس نضح اليدوي المستخدمة سابقا. استخدام هذه المضخة يسمح لنهج حر اليدين لنضح أكسولوتل للحد من ثقب خاطئة من الأنسجة الرقيقة. لم تنجح العطاءات لعدة أسباب إضافية، بما في ذلك من خلال ومن خلال بونكتأور، تخثر، والانسداد. في حالة إدراج الإبرة في الشريان الأورطي وثقب ثان تم إنشاؤه من خلال الجدار الخلفي، فإن حل الجاذبة يتدفق مباشرة في تجويف الصدر بدلا من المرور عبر الدورة الدموية النظامية. بالإضافة إلى ذلك، بمجرد خروج الدم من الأوعية الدموية، وسرعان ما شكلت جلطة دموية التي يمكن أن تعرقل نضح. يمكن أن تشكل الجلطات والفقاعات الهوائية أيضا في الأوعية الدموية، مما تسبب في الصمات التي تحول دون نضح ناجحة. وأخيرا، فإن هذا البروتوكول دمج الكواشف تعديلها لتناسب الأسمولية أكسولوتل، والذي يختلف كثيرا عن ذلك من الثدييات. التكيف من هذا البروتوكول والتغيرات الهامة التي أدخلت لتناسب نموذج أكسولوتل سيساعد في السعي لفهم عملية إعادة التوعي من الأنسجة أثناء التجديد. دي، وهو الوردي في اللون، سوف يروي الحيوان وتعطيه هوى الوردي مشرق. أصبح بيرفوسد بنجاح أكولوتلز الوردي مشرق إلى بالعين المجردة، مع درجة عاليةالمناطق الأوعية الدموية تظهر أكثر ملطخة بشكل مكثف. الحيوانات بيرفوسد ينظر مع المجهر متحد البؤر الفلورسنت باستخدام مرشح الأخضر يمكن تصور في الطيف الانبعاثات الأحمر والبرتقالي. كان أفضل تصور الأوعية الدموية في أنسجة أرق التي تقلل من تلطيخ الجاذبة عرضية من الأنسجة غير الأوعية الدموية. إرواء الأنسجة مع 4٪ بارافورمالدهيد (بفا) فورا بعد نضح الجاذبة ينبغي أن يتم لإصلاح الأنسجة. ديفوسيونس الجاذبة هي نهاية نقطة التجارب ل أكسولوتل. خلال هذا الإجراء، يتم استنزاف كل من دم الحيوان بشكل فعال واستبداله مع برنامج تلفزيوني 0.7X، تليها فورا حل الجاذبة، وأخيرا 4٪ بفا. وهذا يعطل قدرة أكسولوتل على الانخراط في العمل الحيوي من تبادل الغاز ويفقد القدرة على أكسجين أنسجة الجسم. ونظرا لهذه الطبيعة نقطة نهاية، كل نضح يلتقط فقط نقطة واحدة من نمو الأوعية الدموية، والحيوان لا يمكن أن يكون بيرفوسد أبعد في وقت لاحق. بسبب هذا الوقت-ليميعامل تينغ، يجب أن تستخدم الحيوانات متعددة من أجل وصف مسار الزمن لتطوير الأوعية الدموية. هذا بروتوكول الجاذبة، والتعديلات المطبقة لتحسينه، ويمكن استخدامها لتسمية بنجاح وتصور الأوعية الدموية من أكسولوتل. منذ أكسولوتل هو كائن نموذج أساسي لدراسة التجدد، والروائح ناجحة تفتح فرصا لاستجواب عملية الأوعية الدموية خلال التجديد. و أكسولوتل هو كائن نموذج لدراسة التجدد لأنه حيوان نيوتنوس وبالتالي يحتفظ قدرة ملحوظة لتجديد طوال سن البلوغ 8 . عملية إعادة التوعي من الأنسجة تجديد، ومع ذلك، ليست مفهومة جيدا، وبالتالي التكيف من نضح الجاذبة لنظام أكسولوتل يوفر فرصا لفهم التجدد التي لم تكن متوفرة مع نموذج الثدييات. نضح من أكسولوتل باستخدام الجاذبة هو تقنية جديدة لدراسة ريفاسكولاريزاتيون من الأنسجة تجديد في هذا النموذج الحيوان، وبالتالي، يمكن استخدام هذا البروتوكول كذلك لفهم أورغانوجينيسيس خلال التنمية وأوعية الدموية أثناء المرض، وكذلك أن تستخدم كأداة هامة أثناء دراسة التجديد.

تصور الأوعية الدموية يلعب دورا حيويا في فهم بنية ووظيفة الكائنات الحية عبر العديد من الأنواع. ابتداء من القرن ال 16 مع ليوناردو دا فينشي، وقد تم دراسة النماذج والرسوم البيانية من الدورة الدموية 1 . باستخدام الشمع والقوالب المطاطية، تم بيرفوسد الأنسجة لخلق نماذج ثلاثية الأبعاد من الأوعية الدموية، مما سمح لدراسة أورغانوجينيسيس والمرضية 1 ، 2 . تم تلوين الراتنجات والشمع مع الأصباغ مثل الهند الحبر أو القرمزي الأحمر للسماح لتصورها سهلة 1 ، 2 . ومع ذلك، تسببت هذه التقنيات العديد من القضايا لأن اللزوجة العالية منعت نضح كامل من الأنسجة من الفائدة 1 . كما أصبح الحقل أكثر تطورا، واستخدام المجاهر متحد البؤر والإلكترون دخلت حيز اللعب، ونقل تيشنيق نضح<html> إيس بعيدا عن قوالب الزهر نحو بيرفوسيونس السائل من الأوعية الدموية، وبعضها سمح للنضح والتصوير من الأوعية الدموية دون تدمير الأنسجة الأولية 3 . دي، صبغ كاربوسيانين الفلورسنت، هو واحد من مثل وصمة عار الذي يسمح لنضح الحيوانات دون الأضرار التي لحقت أنسجة الأوعية الدموية. الأصباغ كاربوسيانين هي الأصباغ محبة للدهون التي تدمج في أغشية الخلايا عند الاتصال. هذه الأصباغ تسمح لتلطيخ سهلة وحظية من الخلايا البطانية الوعائية، والتي يمكن بعد ذلك أن ينظر إليها تحت المجهر متحد البؤر الفلورسنت. تتحرك الجاذبة عن طريق الانتشار الجانبي في غشاء الدهون من الخلايا، كما هو مبين في وضع العلامات وتعقب الخلايا العصبية 4 . كيميائيا، وسلاسل ألكيل اثنين من الجاذبة تعطي الصبغة تقارب عالية لأغشية الخلايا، في حين أن اثنين من حلقات مترافق من فلوريوكروم الذي هو المسؤول عن انبعاث الطول الموجي الأحمر عندما متحمس من الفلورسنت الضوء الأخضر مرشحات&gt; 4. وقد استخدمت الجاذبة في العديد من القدرات، بما في ذلك وضع العلامات الناجحة للغشاء البلازما وعلى حد سواء أنتيروغريد والوراء إلى الوراء في الخلايا العصبية 5 ، 6 . وقد استخدمت سابقا الجاذبة في بروتوكولات نضح في حين تصور الأوعية الدموية من الفئران 7 . أكسولوتلس ( أمبيستوما ميكسيكانوم ) هي السلمندرات التي تعيش حصرا في البحيرات المالحة بالقرب من مكسيكو سيتي، المكسيك. وقد أصبحت هذه الحيوانات نموذجا هاما لفهم عمليات التجدد لأنها يمكن أن تجدد أطرافه الكاملة والذيل (بما في ذلك الحبل العصبي)، وأجزاء من القلب والأعضاء الداخلية الأخرى، وأجزاء من العين والبالغين 8 ، 9 . بالإضافة إلى ذلك، مع التطبيق الأخير من الأدوات الجينية في أكسولوتلس، نظرة غير مسبوقة في الجزيئات والخلايا التي تقود هذه العمليات من الممكن الآن 8 . نجاح ريجينالتموينية من طرف كامل يتطلب عملية إعادة التوعي واسعة النطاق، والتي قد تلعب دورا هاما في تجديد بعد مجرد الوظائف التقليدية للأوعية الدموية في توفير الأكسجين والمواد المغذية. فهم إعادة التوعي في سياق تجديد الأنسجة أمر حتمي. وقد سبق تصور الأوعية الدموية أكسولوتل باستخدام الهند الحبر، وبينما كانت النتائج مثيرة للاهتمام، لم يتم إعادة النظر في هذه العملية في العقود اللاحقة 10 . سعينا إلى تكييف بروتوكول نضح الجاذبة وضعت لاستخدامها في الثدييات للسماح لنضح كاملة والتصور من الأوعية الدموية أكسولوتل 7 . يصف هذا البروتوكول الخطوات التي اتخذت لإرواء بنجاح وبعد ذلك تصور الدورة الدموية أكسولوتل مع تقنية تلطيخ الجاذبة. هذا الإجراء سوف يسمح لتصور دقيق من الأوعية الدموية براءات الاختراع في الأنسجة التماثل، وكذلك في تجديد الأنسجة، ويوفر طريقة جديدة ل فيسواليزاتيون وتحليل عملية إعادة التوعي في أكسولوتل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1583">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:405px;">Peristaltic Pump&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Marshall Scientific&#160;</td>
			<td style="width:152px;">RD-RP1</td>
			<td style="width:831px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">Perfusion tubing</td>
			<td style="width:195px;">Excelon Lab &#38; Vacuum Tubing</td>
			<td>436901705</td>
			<td>size S1A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">27g butterfly needle</td>
			<td style="width:195px;">EXELint Medical Products</td>
			<td>26709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">NaCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">KCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7747-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Distilled water</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFischer</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ethanol (100% vol/vol)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Surgical foreceps&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>MDG0748741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Polystyrene foam frame</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>any polystyrene foam square with an axolotl-shaped&#160; cut out</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>DYND04025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Scalpel&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>MDS15210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Absorbent underpad</td>
			<td style="width:195px;">Avacare Medical</td>
			<td>PKUFSx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Paper towels</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Standard disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:195px;">Fisherbrand</td>
			<td>50216954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Clamp stand</td>
			<td style="width:195px;">Adafruit</td>
			<td style="width:152px;">291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Tricaine powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Adult axolotl</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">MgSO4</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">CaCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Plastic tanks</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Varying size appropriate for the axolotl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Axolotl</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Leica Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">ET-CY3 Fluorescent Filter</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum

وقد استخدمت تقنيات الإرواء لعدة قرون لتصور تداول الأنسجة. أكسولوتل (أمبيستوما ميكسيكانوم) هو نوع من السمندل الذي برز كنموذج أساسي لدراسات التجدد. لا يعرف إلا القليل عن كيفية إعادة التوعي يحدث في سياق التجدد في هذه الحيوانات. هنا نحن الإبلاغ عن طريقة بسيطة لتصور الأوعية الدموية في أكسولوتل عن طريق نضح من 1،1&#39;-ديوكتاديسي 3،3،3 &#39;، 3&#39;-تيتراميثيليندوكاربوسيانين البيركلورات (الجاذبة). الجاذبة هو صبغ كاربوسيانين محبة للدهون التي تدرج في غشاء البلازما من الخلايا البطانية على الفور. يتم الإرواء باستخدام مضخة تحوي بحيث يدخل الجاذبة الدورة الدموية من خلال الشريان الأبهر. خلال نضح، وتدفق صبغ من خلال الأوعية الدموية أكسولوتل ودمجها في طبقة ثنائية الدهون من الخلايا البطانية الوعائية عند الاتصال. الإجراء نضح يستغرق حوالي ساعة واحدة لمدة 8 بوصة أكسولوتل. مباشرة بعد نضح وايث داي، و أكسولوتل يمكن تصور مع المجهر متحد البؤر الفلورسنت. ينبعث مؤشر الجاذب الضوئي الضوء في نطاق أحمر برتقالي عندما متحمس مع مرشح الفلورسنت الأخضر. هذا الإجراء نضح الجاذبة يمكن استخدامها لتصور بنية الأوعية الدموية من أكسولوتلس أو لإظهار أنماط إعادة التوعي في تجديد الأنسجة.

<html> مع تلطيخ الجاذبة، والأوعية الدموية من أكسولوتل يمكن تصور بسهولة. الأوعية الدموية من الحيوانات بيرفوسد مع صبغ محبة للدهون هي مرئية على الفور تحت المجهر متحد البؤر الفلورسنت. الشكل 1-1-1.5 هو تمثيل تخطيطي لبروتوكول نضح. بعد نضح مع صبغ وردي مشرق، سوف بيرفوسد بيرفوسد بنجاح تظهر الوردي. باستخدام مرشح الفلورسنت الأخضر على المجهر متحد البؤر سوف تظهر الانبعاثات الحمراء للشبكة الأوعية الدموية. يحدث تلطيخ الجاذبة في جميع أنسجة الجسم عندما نضح ناجحا، بما في ذلك الذيل، وأطرافه، والخياشيم، والعينين ( الشكل 2A ، الشكل 2B ، الشكل 2C ، 2D الشكل ، على التوالي). يؤدي الإهمال غير الناجحة إلى نقص الأوعية الدموية الملطخة باللون الأحمر أو في تلطيخ غير مكتمل للأوعية. نتنت &quot;فو: كيب-together.within-بادج =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="شكل 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55740/55740fig1.jpg" /> الشكل 1: تخطيطي للبروتوكول نضح. أكسولوتلس بنجاح بيرفوسد مع صبغ محبة للدهون، الجاذبة، وإظهار تلطيخ كامل من الأوعية الدموية عند التصوير. 1: مستلق كامل أكسولوتل قبل تجربة نضح. 2: فتح الصدر من أكسولوتل. 2: أكسولوتل مع تجويف الصدر مفتوحة. 3: إدراج 27 G فراشة إبرة في الشريان الأبهر من أكسولوتل. 4: يجب أن تحتوي الأنابيب أولا 0.7X برنامج تلفزيوني، ثم حل العمل الجاذبة، وأخيرا بفا 4٪. 5: بيرفوسد تماما أكولوتلس تظهر الوردي. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55740/55740fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55740/55740fig2.jpg" /> الشكل 2: صور من أكسولو بيرفوسد تماماليرة تركية. تم التقاط صور من الأوعية الدموية أكسولوتل باستخدام المجهر مبائر الفلورسنت بعد نجاح نضح مع وصمة عار الجاذبة. 2A: الذيل. 2B: قدم. 2C: الخياشيم. 2D: العين. ويتم التصوير باستخدام المجهر متحد البؤر مع الأخضر الفلورسنت مرشح الانبعاثات مكعب. التكبير للصور A، B، C، و D، هي 1.74X، 2.16X، 1.18X، و 5.69X، على التوالي. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55740/55740fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum at JoVE.com

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

باستخدام محبة للدهون 1،1&#39;- ديوكتاديسي -3،3،3 &#39;، 3&#39;-تيتراميثيليندوكاربوسيانين البركلورات (الجاذبة) تقنية تلطيخ، أمبيستوما ميكسيكانوم يمكن أن يخضع نضح الأوعية الدموية للسماح لتصور سهلة من الأوعية الدموية.

الجاذبة الإرواء كطريقة لتصور الأوعية الدموية في<em&gt; أمبيستوما ميكسيكانوم</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

dii-perfusion-as-method-for-vascular-visualization-ambystoma

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

9.8K Views.  Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital.  باستخدام محبة للدهون 1،1'- ديوكتاديسي -3،3،3 '، 3'-تيتراميثيليندوكاربوسيانين البركلورات (الجاذبة) تقنية تلطيخ، أمبيستوما ميكسيكانوم يمكن أن يخضع نضح الأوعية الدموية للسماح لتصور سهلة من الأوعية الدموية. 

Video: DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing : طريقة بسيطة لالتنميط الجيني دقيقة

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

استخدام Rotorod كأسلوب للتحليل النوعي من المشي في الجرذ

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

تصور انواع معينة ايليجانس</emالهياكل البشرة> استخدام الصبغة الحيوية محبة للدهون ، صلاح الغيدان

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

طريقة بسيطة للتصوير Arabidopsis يغادر طريق Perfluorodecalin كوسيط التصوير إختراقي

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

تصور كا الأوعية الدموية 2 + اشارة سببها ريوس المشتقة نظير الصماوي

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.