Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oftalmología, como la proliferación de pericitos o la migración. La principal ventaja de este procedimiento es que proporcionan una variedad de opciones de visualización. Demostrando los procedimientos estarán Karin Dreisig y Frank W.Blixt, dos post-doctorados en nuestro laboratorio.
Para enuligar el ojo, primero usa un bisturí para hacer las hendiduras posterior y anterior de aproximadamente 0,5 centímetros en el párpado de la rata. Agarre el ojo con fórceps e incline cuidadosamente hacia un lado para exponer el tejido circundante. Enuclete el ojo haciendo cortes con tijeras de disección en el tejido conectivo y muscular.
Coloque brevemente el ojo en un 4%formaldehído y solución salina tamponada con fosfato durante uno o dos minutos. Enjuague brevemente en tampón de sodio antes de hacer un agujero en el limbo corneal aplicando una ligera presión con la punta de un bisturí. Corte a lo largo del limbo corneal con tijeras de disección para eliminar la córnea y la lente con fórceps.
Sumerja el tejido restante con retina en 4%formaldehído en PBS durante dos a cuatro horas. Cryo-proteger el tejido sumergiendo en el tampón de fosfato de Sorenson que contiene 10%sacarosa y luego 25%sacarosa. Transfiera el tejido una vez que se haya hundido en la parte inferior del recipiente.
Incrustar en medio de Yazulla preparado con 3%gelatina de piel porcina y 30%albúmina de clara de huevo de pollo. A continuación, corte las criocciones verticales de 10 micras de la retina incrustada en gelatina hasta el nervio óptico. Coloque las criocciones en un tobogán de vidrio y deje secar durante un mínimo de una hora.
Una vez seco, sumerja el portaobjetos en PBS con 0.25%Triton-X 100 durante 15 minutos. Luego, gotee una mezcla de 1:100 anticuerpos primarios del receptor PDGF beta y 1:500 NG2 en PBST y 1%BSA sobre la criosectación y colóquelos en una cámara húmeda a cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, lave las secciones sumergiendo la diapositiva en PBST dos veces durante 15 minutos cada vez.
A continuación, gotee una mezcla de 1:100 anticuerpos secundarios anti-ratón Alexa Fluor 594 y 1:100 anti-Rabbit FITC diluidos en PBST con 3%BSA en las criocciones y incubar durante una hora en la oscuridad. Después de la incubación, enjuague el portaobjetos de vidrio en PBST dos veces durante 15 minutos cada vez. Monte las criocciones teñidas con un medio de montaje antidescolorante que contenga DAPI y un cubreobjetos.
Una segunda técnica de preparación del tejido de la retina es de montaje completo. Después de la extirpación de la córnea, utilice pequeños movimientos de apertura de fórceps para separar la retina del epitelio pigmentario de la retina hacia el nervio óptico. Libera la retina en el nervio óptico con tijeras de disección y haz de tres a cuatro rendijas de unos pocos milímetros de longitud desde la periferia de la retina hacia la cabeza del nervio óptico.
Esparce la retina sobre un portaobjetos de vidrio y deja secar durante cinco a 10 minutos. Gotee 4%formaldehído en la retina y arréglalo durante 20 a 30 minutos. Después de la fijación, enjuague con PBS.
Para obtener resultados óptimos, la inmunosu mancha directamente después del enjuague. Primero, gotee PBST en todo el montaje e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Vierta el PBST, luego agregue la solución de anticuerpos primarios e incubar en una cámara húmeda a cuatro grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, verter el anticuerpo primario y gotear en PBST para enjuagar la retina dos veces durante 15 minutos cada vez. Después de verter el segundo lavado, gotee la solución de anticuerpos secundarios sobre la retina e incubar durante una hora en una cámara húmeda a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación secundaria de anticuerpos, lave dos veces con PBST como antes.
Monte el soporte completo teñido con un medio de montaje antidescolorante que contenga DAPI y un resbalón de cubierta. Alternativa al montaje integral de la retina, la vasculatura de la retina se puede aislar por aislamiento hipotónico. Primero, coloque la retina en un mililitro de agua desionizada en una placa de 24 pozos y agite a 200 rpm con una órbita de vibración de 1,5 milímetros durante una hora a temperatura ambiente, luego agregue 200 unidades de DNAse 1 para disociar los restos celulares lisos de la vasculatura retinural y agitar durante otros 30 minutos a temperatura ambiente.
Enjuague la retina con agua desionizada tres veces durante cinco minutos cada una con temblores a 150 a 300 rpm para eliminar los restos celulares neuronales. La retina debe ser más transparente con cada enjuague, indicativo de la eliminación de desechos celulares neuronales. Después del enjuague, fijar la retina en un mililitro de 4%paraformaldehído y PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Enjuague con PBS tres veces. Si se procede a la inmunosucultura, bloquee la vasculatura hipotónica aislada con 500 microlitros de 10% de suero de burro diluido en PBS durante una hora con temblores a 100 rpm. Después del bloqueo, incubar la retina durante la noche en 600 microlitros de solución de anticuerpos primarios que consisten en 1:100 PDGF-receptor beta y 1:500 NG2 anticuerpos primarios diluidos en 10%suero de burro y PBS.
Al día siguiente, enjuague la red de retina tres veces en PBS durante cinco minutos cada vez, luego incubar en 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594th-linked y 1:100 Anti-Rabbit FITC-linked anticuerpos secundarios, diluidos en 10%suero de burro y PBS con temblor a 100 rpm a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad. Después de un lavado de cinco minutos en PBST, incubar en 0,2 nanogramos por mililitro DAPI y PBST durante 15 minutos. Lavar tres veces durante cinco minutos con PBST mientras está protegido de la luz.
A continuación, corte la punta de una pipeta Pasteur de plástico. Retire los bordes afilados con una punta de pipeta, humedezca la pipeta Pasteur con PBST, luego aspire la vasculatura de la retina en la pipeta y prescinda en un portaobjetos de cámara de vidrio de cuatro pozos. El paso de humectante es importante para evitar que la vasculatura de la retina se pegue al interior de la pipeta Pasteur.
Coloque la vasculatura de la retina inclinando el deslizamiento de la cámara hacia adelante y hacia atrás. Retire el medio de los pozos de la corredera de la cámara. La tensión superficial del líquido aplanará la vasculatura en la parte inferior de la diapositiva.
Si es necesario, gotas de líquido sobre la vasculatura de la retina para desplegar. Asegúrese de desplegarse correctamente bajo un microscopio antes de retirar los pozos de plástico de la corredera de la cámara. Monte la vasculatura teñida con un medio de montaje antidescolorante y un resbalón de cubierta.
La inmunohistoquímica NG2 revela vasos positivos dentro de la parte interna de la retina. Las flechas indican inmunorreactividad circular y en forma de herradura en los vasos. La punta de flecha señala un recipiente cortado longitudinalmente.
La inmunohistoquímica beta del receptor de PDGF muestra una inmunoreactividad similar a la NG2. Una vez más las flechas y la punta de flecha indican inmunoreactividad en los vasos. Esta imagen muestra una fusión de NG2 en verde, PDGF-receptor beta en rojo, y DAPI en azul.
Al superponer los tres filtros diferentes, se revela que NG2 y PDGF-receptor beta están co-localizados. Esta imagen muestra una preparación de montaje completo inmunomonto con tinción NG2 en rojo. La inmunoreactividad es visible a lo largo de la red vascular superficial con manchas intensas en pericitos abluminales.
Las células neuronales son visibles como núcleos azules DAPI entre la microvasculatura teñida de NG2. Esta imagen muestra la red vascular de la retina de rata aislada hipotónica manchada con NG2 en verde y PDGF-receptor beta en rojo. La red completa mostró inmunoreactividad NG2.
Se encontró inmunoreactividad beta del receptor de PDGF en somas celulares. Con mayor aumento, está claro que la tinción beta del receptor de PDGF sólo se observa en somas celulares en la red vascular, lo que indica inmunoreactividad pericitato. Incluyendo la tinción DAPI junto con NG2 y PDGF-receptor beta revela tres pericitos en dos células de pared de recipientes indefinidas en esta imagen de alto aumento.
Después de estos procedimientos, otras inmunosuchaciones como la célula muscular lisa o tinciones endoteliales se pueden utilizar con el fin de responder preguntas adicionales. Por ejemplo, ¿cómo se ven las células de la vasculatura retinal después de la isquemia?
