מחקר זה נתמך על ידי בית החולים בריגהם &amp; נשים ואת מצעד של דיים. המחברים מבקשים להודות לכל חברי המעבדה הלבנה על תמיכתם ועצתם.

כל הניסויים axolotl בוצע בהתאם בית החולים בריגהם של נשים (BWH) מוסדיים טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה. 1. הגדרת ניסוי perfusion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים axolotl מבוגר במיכל פלסטיק מלא עם פתרון 0.1% tricaine (MS222) במשך 15-20 דקות או עד הרדים לחלוטין. ודא כי מיכל מלא פתרון tricaine מספיק כך axolotl הוא שקוע לחלוטין. הערה: יש לבצע את כל ההליכים בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים. ב BWH, axolotl נחשב להרדים לחלוטין כאשר הוא נכשל מבחן רגל קמצוץ, כלומר אין תנועה רפלקסיבית כאשר כף הרגל הוא סחוט בעדינות. זהירות: למרות tricaine הוא חומר הרדמה המשמש במיוחד עבור אורגניזמים מימיים, מגע ישיר העור עם פתרון tricaine יש להימנע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תחנת זלוף axolotl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אתמשטח סופג על משטח שטוח, שטוח עם הצד סופג כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים חור במסגרת קצף פוליסטירן כי הוא בגודל המתאים ואת הצורה עבור axolotl הרדים להניח במצב שכיבה. מניחים את המסגרת על משטח סופג. הערה: ניתן למקם מגבות נייר נוספות מיד מתחת למסגרת לקבלת ספיגה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המשאבה peristaltic עם צינורות זלוף. הגדר את המשאבה בקצב זרימה של 0.7 מ&quot;ל / דקה, זורם בכיוון השעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הפתרון מדולל עם 0.7x PBS ו 5% גלוקוז בתערובת 1: 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10 מ&quot;ל של פתרון diluent עם 200 μL של פתרון המניות DiI בצינור 50 מ&quot;ל חרוטי. כיפה ומערבבים על ידי היפוך. כיסוי זה צינור עם נייר אלומיניום לסכל כדי להגן על פתרון העבודה מחשיפה לאור. הערה: כרכים צריך להיות שונה בהתאם לגודל של axolotl באופן יחסי. ערכים אלה הם עבור axolotl כ 15 ס&quot;מ (אורך snout-to-tail). אנימלים בגודל זה אולי לא הגיעו לבגרות מינית מלאה ולכן המין החיה לא ייקבע בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים צינור חרוטי 50 מ&quot;ל עם 0.7x PBS. הערה: PBS ישמש עבור תחול לולאה exxanguination axolotl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את המחט 27-מד פר כדי סוף היציאה של צינורות זלוף. מקפלים את כנפי פרפר אחד על השני ומניחים בעמדה מהדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקצה החופשי של צינורות זלוף בצינור 50 מ&quot;ל חרוטי מלא 0.7x PBS ולהפעיל את משאבת זלוף עד צינורות כולו מלא פתרון. להשהות את המשאבה פעם את כל צינורות מלא PBS. הערה: ודא צינורות ללא בועות אוויר בכל עת, כמו אלה יגרום האוויר emboli ב axolotl ולמנוע זלוף מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מגבת נייר בצורת axolotl בצורת מסגרת קצף פוליסטירן. באמצעות פיפטה העברה, להשרות את המגבת עם פתרון tricaine. הערה: חותכים ריבוע קטן באמצע מגירת הנייראל כדי לאפשר ניקוז של נוזלים במהלך הליך זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שסתום axolotl הרדים על מגבת נייר בתוך מסגרת קצף פוליסטירן. </li></ol></li></ol> 2. פתיחת חזה האקסולוט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים כירורגיים כדי לצבוט את העור לאורך הציר המרכזי של החזה של axolotl, ממש מתחת לקו הכתפיים. לַעֲקוֹר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אזמל לבצע חתך קטן שבו העור כבר משך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פיסת עור מרובעת על החזה כדי לחשוף שתי צלחות סחוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור כדי לפתוח חלון מעל חלל בית החזה גדול מספיק כדי לראות בבירור את הלב כ 5 מ&quot;מ של אבי העורקים הסתעפות של הלב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לקרוע את רקמת החיבור באמצעות מלקחיים או מספריים סגורים על מנת למנוע חיתוך כל כלי הדם העיקריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם כל צלחת הסחוס בנפרד באמצעות מלקחיים ובלו אותם WIth את המספריים כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לצבוט את קרום הלב עם מלקחיים, למשוך למעלה, לנקב אותו באמצעות מספריים כירורגית; חתך זה צריך להיות רק מספיק עמוק כדי לנקב את קרום הלב דק מאוד צריך להיות גדול מספיק כדי לאפשר הסרת קרום הלב. הקפד לא לחתוך את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בעדינות את קרום הלב כדי לחשוף את הלב ואת אבי העורקים. הערה: באמצעות פיפטה העברה, מעת לעת לשטוף את חלל החזה ואת הזימים עם פתרון tricaine לשמור על האזור ברור ולשמור על axolotl הרדים. </li></ol> 3. זלוף של Axolotl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עמדת מהדק עם מחט פרפר טעון ליד מסגרת קצף פוליסטירן, כך זרוע של מהדק יכול בקלות להיות מניפולציה כדי להכניס את המחט לתוך אבי העורקים axolotl. הצבע את קצה המחט לכיוון היבט מקורי של החיה במהלך ההכנסה ולשמור על המחט מקבילים אבי העורקים, כדי למנוע ניקוב זה דרך opצד חיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה peristaltic. 0.7x PBS צריך להמשיך לזרום דרך צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לתוך אבי העורקים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלק את מלקחיים מתחת לקשת אבי העורקים ולמשוך מעט כדי לאפשר גישה קלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמרן את שילוב מחט המחט כך המחט פועל לאורך אורך של אבי העורקים, מצביע לכיוון הראש. הכנס את המחט תוך שימוש במלקחיים עבור תמיכה מאחורי אבי העורקים. הערה: המחט צריך להיות מוכנס עמוק מספיק לתוך אבי העורקים כדי להבטיח שזה לא יחליק החוצה במהלך זלוף. זה יכול להיות על 5 מ&quot;מ עבור 15 ס&quot;מ axolotl. ודא כי המחט היא באופן מושלם בקנה אחד עם אבי העורקים, כדי למנוע לנקב מוחלט של כלי השיט. באמצעות ו-נקבים יכול לגרום דימום מסיבי ולהפחית את שיעורי ההצלחה של זלוף. ההכנסה מוצלחת ניתן לאשר על ידי הגדלה גלוי של אטריה של הלב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר laterate אטריום אחד עם sciSsors ולאפשר דם להתרוקן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף עם פתרון tricaine כדי למנוע הצטברות דם היווצרות קריש בחלל החזה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse את axolotl עם כ 20-30 מ&quot;ל של PBS. הבהמה צריכה להשתנות מ ורוד בהיר בצבע לבן על זלוף מוצלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשהות את המשאבה peristaltic ולהזיז את הקצה החופשי של צינורות לתוך צינור 15 מ&quot;ל של פתרון DiI. הפעל מחדש את המשאבה, היזהר כדי למנוע יצירת בועות אוויר בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse את axolotl עם מלאי העבודה כולו של DiI. הערה: ב זלוף מוצלח, axolotl עם שינוי צבע ורוד בהיר של DiI. זה יהיה בולט ביותר הזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשהות את המשאבה לאחר זלוף עם DiI הושלם במקום סוף חינם של צינורות לתוך פתרון Paraformaldehyde 4% (PFA) לתקן את הרקמה. הפעל מחדש את המשאבה ואת perfuse לפחות 10 מ&quot;ל של PFA. זהירות: PFA הוא רעיל צריך להיות מטופלים ו dispoSed של כראוי. כפפות וכוסות בטיחות צריך להיות משוחק, ופתרונות צריך להיעשות בתוך מכסה המנוע קטר. זלוף של axolotl עם PFA לתקן את הרקמה תוצאות המוות של החיה. </li></ol> 4. סיום זלוף ההכנה ויזואליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המשאבה peristaltic ולהסיר את המחט מן האאורטה axolotl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את axolotl על צלחת פלסטיק. הערה: שימוש של חצי צלחת פטרי גדול עובד היטב ומאפשר לשפוך כמות קטנה של Tricaine או PBS על axolotl כדי לשמור על העור רטוב ולשפר את איכות הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשליך את כל החומרים בשימוש בפחים פסולת המתאימים. נקי כלים כירורגיים עם אתנול 70%, לחטא באמצעות מעקר זכוכית חרוז בין בעלי חיים, וכן לעקר ידי מעוקר בעקבות ההליך. צנרת צינורות עם פתרון PBS ולאחר מכן לנקז, יבש לחלוטין, ולאחסן לשימוש נוסף. </li></ol> 5. ויזואליזציה של Axolotl perfused <oL&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את axolotl תחת מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האורות כמו הדמיה של כלי מוכתם DiI הוא מונע על ידי האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ירוק הקרינה הקרינה פליטה קוביית ( למשל ET-CY3) עם מיקרוסקופ confocal לדמיין את כלי הדם של axolotl. השתמש אור עירור 545 ננומטר. הערה: כדי להשיג תמונה באיכות גבוהה, ניתן להשתמש בפרמטרים הבאים: חשיפה ל -1.1 s, רווח של 1x, רוויה של 1.0, הגדלה של 2X. </li></ol>

<ol>
	<li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels.">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels.">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374 (2013).</li><li> Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Scanning+electron+microscopy+and+vascular+corrosion+casting+for+the+characterization+of+microvascular+networks+in+human+and+animal+tissues."> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li><li> Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+DiI+and+DiO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing."> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells.">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+TALEN-mediated+gene+editing+of+an+endogenous+locus+in+axolotl.">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li><li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine.">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li><li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration.">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ויזואליזציה של כלי הדם של axolotl ניתן להשיג בהצלחה באמצעות זלוף עם צבע lbophilic carbocyanine, DiI. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול חדש עבור זלוף של axolotl עם DiI באמצעות משאבת peristaltic. כמו כן, אנו מראים את ההדמיה שלאחר מכן של vasculature axolotl באמצעות מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי. פרוטוקול זה היה הסתגלות של המכרסמים DiI זלוף פרוטוקול לראות Li et al. 7 , אולם ההבדלים העיקריים בין מכרסם לבין axolotl נדרש עדכון של הפרוטוקול כדי להתאים את המודל axolotl. מחקר זה דן בשיטה של ​​זלוף DiI של axolotl כדי להצליח לדמיין את כלי הדם. הבדלים באנטומיה ובפיזיולוגיה בין הסלמנדרה לבין שינויים בביקוש מכרסם בהיבטים העיקריים של זלוף, כולל מיקום של הכנסת מחט, שיטת זלוף, ואת ריאגנטים בשימוש. כדי כאביםIve זלוף מוצלח, הגבלנו את הנזק שנגרם vasculature של axolotl. בעת פתיחת חלל החזה, נלקח טיפול לחשוף באופן מלא את הלב ואת אבי העורקים, תוך הימנעות כל נזק או lacerations לכלי הדם הגדולים. הגבלת השימוש במספריים הכירורגיים מנעה קליטה מקרית של כלי שיט גדולים, ואילו חתכים קטנים שמרו על החשיפה של הלב ואבי העורקים. שיעורי ההצלחה של perfusions גם גדל כאשר מחט DiI הוכנס דרך אבי העורקים, ולא ישירות לתוך תאי הלב. Axolotl, שלא כמו העכבר, יש לב שלושה חדרים, המכיל רק חדר אחד עם שרירים פחות משמעותית מזו של העכבר. בגלל הבדלים אלה, המיקום של הכנסת המחט היה צריך להיות מועבר אבי העורקים יציבה יותר. אבי העורקים היה נחוש להיות המיקום האופטימלי עבור החדרת מחט זלוף כפי שהוא גדול מספיק עבור לנקב על ידי מחט 27 G יש תנועה מוגבלת. התנועה היתה מינימליתIzed על מנת למנוע הסרת מקרית או החלקה של מחט זלוף או לנקב דרך ו-דרך של אבי העורקים. כאבי לב באמצעות החדר כמו נקודת הכניסה הוכיח שיש שיעור נמוך בהרבה של הצלחה מאשר אלה עם נקודת הכניסה אבי העורקים. ניקוב מזויף של כלי הדם גרם לעתים קרובות להיווצרות של אמבולי או מנע זלוף, וכתוצאה מכך שיעורי נמוך מאוד של תיוג כלי הדם מוצלח. באמצעות דוכן מהדק להחזיק את מחט פרפר במהלך זלוף, יש לנו ירידה התנועה שלה, ולכן להגדיל את שיעור מוצלח של perfusions. בנוסף, בשל עדינות הרקמה axolotl, בהשוואה לעכבר, משאבת זלוף peristaltic היה הכרחי, בניגוד זלוף ידני בעבר. השימוש במשאבה זו איפשר גישה של הידיים ללא זלוף axolotl כדי למזער ניקוב מוטעה של רקמות דקות. זיכיונות נכשלו מסיבות רבות נוספות, כולל סימני פיסוקUre, קרישה, ותסחיף. במקרה המחט הוכנס לתוך אבי העורקים ונקב השני נוצרה דרך הקיר האחורי, הפתרון DiI יזרמו ישירות לתוך חלל החזה ולא לעבור דרך מחזורית מערכתית. בנוסף, פעם אחת הדם יצא מן כלי הדם, הוא במהירות נוצר קריש דם אשר יכול לעכב זלוף. קרישי בועות אוויר יכול גם בצורת כלי הדם, גרימת embole אשר מונע זלוף מוצלח. לבסוף, פרוטוקול זה כלל ריאגנטים מותאמים כדי להתאים את osmolality axolotl, אשר שונה באופן משמעותי מזה של היונק. הסתגלות של פרוטוקול זה ואת השינויים המשמעותיים שנעשו כדי להתאים את המודל axolotl יסייע במרדף להבנת תהליך של רה-וסקולריזציה של רקמות במהלך התחדשות. DiI, שהוא בצבע ורוד, יהיה perfuse החיה ולתת לו גוון ורוד בוהק. בהצלחה axolotls perfused הפך ורוד בהיר לעין בלתי מזוינת, עם מאודאזורים וסקולריים המופיעים בכתמים חזקים יותר. בעלי חיים perfused שנצפו עם מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי באמצעות מסנן ירוק ניתן דמיינו בספקטרום פליטה אדום כתום. Vasculature היה דמיינו הטובה ביותר ברקמות דקיק כי למזער מכתים DiI בשוגג של רקמות לא כלי הדם. זלוף של הרקמה עם Paraformaldehyde 4% (PFA) מיד לאחר זלוף DiI צריך להיעשות כדי לתקן את הרקמה. DiI הם perfusions end-point ניסויים axolotl. במהלך ההליך, כל הדם של החיה הוא למעשה מרוקן מוחלף עם 0.7x PBS, ואחריו מיד על ידי פתרון DiI, ולבסוף 4% PFA. זה משבש את היכולת של axolotl לעסוק בפעולה חיונית של חילופי גז והוא מאבד את היכולת חמצן רקמות הגוף שלה. בשל אופי זה נקודת קצה, כל זלוף לוכדת רק נקודת זמן אחת של צמיחה כלי הדם, ואת החיה לא יכול להיות perfused נוספת במועד מאוחר יותר. בגלל הזמן הזה-לימיTing גורם, בעלי חיים מרובים יש להשתמש כדי לתאר את מהלך הזמן של התפתחות כלי הדם. פרוטוקול DiI זה, ושינויים החלים כדי לשפר את זה, יכול לשמש בהצלחה תווית לדמיין את כלי הדם של axolotl. מאז axolotl הוא אורגניזם מודל חיוני לחקר התחדשות, מוצלחת perfusions לפתוח הזדמנויות לחקור את תהליך angiogenesis במהלך התחדשות. Axolotl הוא אורגניזם מודל לחקר התחדשות כי הוא בעל חיים ניאוטני ולכן שומרת על יכולת יוצאת דופן להתחדש לאורך הבגרות 8 . תהליך ההחלמה מחדש של רקמות התחדשות, לעומת זאת, אינו מובן היטב, ולכן הסתגלות של זלוף DiI למערכת axolotl מציג הזדמנויות להבין התחדשות שלא היו זמינים עם המודל יונקים. זלוף של axolotl באמצעות DiI היא טכניקה חדשה לחקר revasCularization של רקמות התחדשות במודל זה חיה, ולכן, פרוטוקול זה ניתן להשתמש עוד יותר כדי להבין אורגנוגנזה במהלך התפתחות אנגיוגנזה במהלך המחלה, כמו גם להיות מנוצל ככלי חשוב במהלך המחקר של התחדשות.

ויזואליזציה של כלי הדם משחק תפקיד חיוני בהבנת המבנה והתפקוד של אורגניזמים על פני מינים רבים. החל מהמאה ה -16 עם לאונרדו דה וינצ&#39;י, נחקרו מודלים וייצוגים גרפיים של המחזור. באמצעות שעווה ותבניות גומי, רקמות היו perfused כדי ליצור מודלים תלת מימדיים של כלי הדם, אשר אפשרה את המחקר של אורגנוזה ו פתוגנזה 1 , 2 . שרפים ושעווה היו בצבע עם צבעים כגון הודו דיו או אדום carmine כדי לאפשר להדמיה קלה שלהם 1 , 2 . עם זאת, טכניקות אלה גרמו לבעיות רבות בגלל צמיגות גבוהה שלהם מנעו זלוף מלא של הרקמה של עניין 1 . ככל שהשדה נעשה מתוחכם יותר, השימוש במיקרוסקופים קונפוקליים ואלקטרוניים נכנס לפעולה, והעביר את הטכנולוגיות של הזלוף<html> Ues במרחק של תבניות יצוק לעבר נוזלים נוזלי של כלי הדם, שחלקם מותר זלוף הדמיה של כלי הדם מבלי להרוס את הרקמה הראשונית 3 . DiI, צבע קרבוזינין פלואורסצנטי, הוא כתם אחד כזה המאפשר זלוף של בעלי חיים ללא נזק לרקמות כלי הדם. צבעים Carbocyanine הם צבעים lipophilic המשלבים לתוך קרום התא על המגע. צבעים אלה מאפשרים מכתים קל מיידית של תאים אנדותל כלי דם, אשר לאחר מכן ניתן לצפות תחת מיקרוסקופ confocal ניאון. DiI נע דרך דיפוזיה לרוחב בקרום השומנים של תאים, כפי שמוצג תיוג ואת מעקב של נוירונים 4 . מבחינה כימית, שתי שרשראות אלקיל של DiI לתת לצבוע את זיקה גבוהה של קרום התא, בעוד שני טבעות מצומדות מ fluorochrome אשר אחראי על פליטת אור אדום אדום כאשר נרגש על ידי מסנני אור פלואורסצנטי ירוק&gt; 4. DiI כבר מנוצל יכולות רבות, כולל תיוג מוצלח של קרום פלזמה וגם אנטרוגרד ו תיוג מדרדר נוירונים 5 , 6 . DiI בעבר נעשה שימוש בפרוטוקולים זלוף תוך הדמיה vasculature של עכברים 7 . Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) הם סלמנדרס שחיים אך ורק אגמים מליחים ליד מקסיקו סיטי, מקסיקו. בעלי חיים אלה הפכו למודל חשוב להבנת תהליכי התחדשות, שכן הם יכולים ליצור מחדש את הגפיים המלאות, הזנב (כולל כבל עצב), חלקים של הלב ואיברים פנימיים אחרים, וחלקים בעין כמבוגרים 8 , 9 . בנוסף, עם היישום האחרון של כלים גנטיים ב axolotls, תובנה חסרת תקדים של מולקולות ותאים המניעים תהליכים אלה כעת אפשרי 8 . את regen מוצלחהקצבה של איבר שלם דורש תהליך רחב של רה-וסקולריזציה, אשר עשוי לשחק תפקיד משמעותי התחדשות מעבר פשוט את הפונקציות המסורתיות של כלי הדם במתן חמצן וחומרים מזינים. הבנת רה-וסקולריזציה בהקשר של התחדשות רקמות היא הכרחית. כלי הדם Axolotl בעבר דמיינו באמצעות הודו דיו, בעוד התוצאות היו מסקרנות, תהליך זה לא היה revisited בעשורים הבאים 10 . ביקשנו להתאים פרוטוקול Diusion זלוף שפותחה לשימוש יונקים כדי לאפשר זלוף מלא ויזואליזציה של כלי הדם axolotl 7 . פרוטוקול זה מתאר את הצעדים שננקטו בהצלחה perfuse ולאחר מכן לדמיין את זרימת axolotl עם טכניקה מכתים DiI. הליך זה יאפשר הדמיה מדויקת של כלי הדם הפטנט ברקמות הומיאוסטיות, כמו גם ברקמות התחדשות, ומספק שיטה חדשה visualisatioN וניתוח של תהליך רה-וסקולריזציה ב axolotl.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1583">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:405px;">Peristaltic Pump&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Marshall Scientific&#160;</td>
			<td style="width:152px;">RD-RP1</td>
			<td style="width:831px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">Perfusion tubing</td>
			<td style="width:195px;">Excelon Lab &#38; Vacuum Tubing</td>
			<td>436901705</td>
			<td>size S1A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">27g butterfly needle</td>
			<td style="width:195px;">EXELint Medical Products</td>
			<td>26709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">NaCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">KCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7747-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Distilled water</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFischer</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ethanol (100% vol/vol)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Surgical foreceps&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>MDG0748741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Polystyrene foam frame</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>any polystyrene foam square with an axolotl-shaped&#160; cut out</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>DYND04025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Scalpel&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>MDS15210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Absorbent underpad</td>
			<td style="width:195px;">Avacare Medical</td>
			<td>PKUFSx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Paper towels</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Standard disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:195px;">Fisherbrand</td>
			<td>50216954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Clamp stand</td>
			<td style="width:195px;">Adafruit</td>
			<td style="width:152px;">291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Tricaine powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Adult axolotl</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">MgSO4</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">CaCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Plastic tanks</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Varying size appropriate for the axolotl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Axolotl</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Leica Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">ET-CY3 Fluorescent Filter</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum

טכניקות זלוף שימשו במשך מאות שנים כדי להמחיש את זרימת הרקמות. Axolotl (Ambystoma mexicanum) הוא מין של סלמנדרה שהתגלתה כמודל חיוני ללימודי התחדשות. מעט ידוע על איך מתרחשת רה-וסקולריזציה בהקשר של התחדשות אצל בעלי חיים אלו. כאן אנו מדווחים על שיטה פשוטה להדמיה של כלי הדם ב axolotl באמצעות זלוף של 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI הוא צבע lbophilic carbocyanine כי מוסיף לתוך קרום פלזמה של תאים האנדותל באופן מיידי. זלוף נעשה באמצעות משאבת peristaltic כך DiI מזין את זרימת הדם דרך אבי העורקים. במהלך זלוף, צבע זורם דרך כלי הדם של axolotl ומשלב לתוך bilayer השומנים של תאים אנדותל כלי הדם על קשר. הליך זלוף לוקח בערך שעה אחת עבור axolotl שמונה אינץ &#39;. מיד לאחר זלוף wiDiI, axolotl ניתן דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. ה- DiI פולט אור בטווח כתום אדום כאשר מתרגש עם מסנן פלואורסצנטי ירוק. הליך זה זלוף Di ניתן להשתמש כדי לדמיין את המבנה של כלי הדם של axolotls או להדגים דפוסים של רה-וסקולריזציה ברקמות התחדשות.

<html> עם מכתים DiI, vasculature של axolotl ניתן דמיינו בקלות. כלי דם של בעלי חיים perfused עם צבע lipophilic נראים מיד תחת מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי. איור 1-1-1.5 הוא ייצוג סכמטי של פרוטוקול הזלוף. לאחר זלוף עם צבע ורוד בהיר, axolotl perfused בהצלחה יופיע ורוד. באמצעות מסנן פלואורסצנטי ירוק על מיקרוסקופ confocal אדום פליטה של ​​רשת כלי הדם יופיע. מכתים DiI מתרחשת בכל רקמות הגוף כאשר זלוף מוצלח, כולל הזנב, הגפיים, הזימים, ואת העיניים ( איור 2 א , איור 2 ב , איור 2 ג , איור 2 ד , reactively). מוצלחות perfusions לגרום חוסר של כלי דם מוכתמים אדום או מכתים של כתמים של כלי. Ntent &quot;עבור: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55740/55740fig1.jpg" /> איור 1: סכמטי של פרוטוקול זלוף. Axolotls בהצלחה perfused עם צבע lipophilic, DiI, להפגין מכתים מלאה של כלי הדם על הדמיה. 1: axolotl שובב מלא לפני ניסוי זלוף. 2: פתיחת החזה של axolotl. 2: Axolotl עם חלל פתוח החזה. 3: הכנסה של 27 G פרפר מחט לתוך אבי העורקים של axolotl. 4: צינורות צריך קודם כל להכיל 0.7x PBS, ואז הפתרון עובד DiI, ולבסוף 4% PFA. 5: axolotls perfused לחלוטין מופיעים ורוד. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55740/55740fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55740/55740fig2.jpg" /> איור 2: תמונות של Axolo מבושל לחלוטיןTl. תמונות של כלי הדם axolotl נלקחו באמצעות מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי לאחר זלוף מוצלח עם כתם DiI. 2A: זנב. 2 ב: רגל. 2C: Gills. 2D: עין. הדמיה מתבצעת באמצעות מיקרוסקופ confocal עם קוביית פלואורסנט ירוק מסנן פליטה. הגדלה עבור תמונות A, B, C ו- D, הן 1.74X, 2.16X, 1.18X ו- 5.69X, בהתאמה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55740/55740fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum at JoVE.com

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

באמצעות lipophilic 1,1-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) מכתים טכניקה, Ambystoma mexicanum יכול לעבור זלוף כלי הדם כדי לאפשר ויזואליזציה קלה של כלי הדם.

DiI זלוף כשיטת ויזואליזציה של כלי הדם<em&gt; Ambystoma מקסיקניום</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

dii-perfusion-as-method-for-vascular-visualization-ambystoma

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

9.8K Views.  Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital.  באמצעות lipophilic 1,1-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) מכתים טכניקה, Ambystoma mexicanum יכול לעבור זלוף כלי הדם כדי לאפשר ויזואליזציה קלה של כלי הדם. 

Video: DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: שיטה פשוטה genotyping מדויק

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

השימוש Rotorod כשיטה לניתוח איכותי של הליכה עכברוש

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

ויזואליזציה של Caenorhabditis elegans לציפורן מבנים באמצעות דיי ויטל lipophilic, DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

ויזואליזציה של כלי דם Ca 2 + איתות מופעלות על ידי ROS נגזר אוטוקריני

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.