Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.

No conflicts of interest to disclose.

Aquí se describe un protocolo sobre cómo llevar a cabo una infección experimental básico con la cepa EGD de L. monocytogenes en 25 ratones C57BL / 6J macho o hembra. Este protocolo se creó con el fin de estudiar el efecto de una novela pequeña molécula IS001 en la producción de IFN-γ por los linfocitos innata y adaptativa in vivo 31. Mediante el control de la eliminación bacteriana y la supervivencia después de la infección, se adquirieron conocimientos sobre cómo estos cambios en IFN-γ afectadas la capacidad del huésped para controlar la infección. Consideraciones críticas en el Protocolo Una consideración importante en el diseño de este tipo de estudio es que cada experimento sea adecuadamente alimentados y controlados de forma adecuada. Debido a la variación biológica en la respuesta inmune a la infección (ver las figuras 4 y 6), se recomienda que N = 4-5 ratones por grupo se debe utilizar para los estudios inmune inicial. Si unaespués de estos estudios existe una tendencia en los datos, pero no hubo diferencia significativa aparente entre los grupos, un cálculo de potencia se podría hacer para determinar el menor número de animales necesarios en estudios posteriores para lograr la significación estadística. En cuanto a los controles, es importante incluir controles no infectados para la determinación de las respuestas de IFN-gamma de línea de base para los estudios inmunológicos y vehículo controla para ayudar a distinguir el efecto del tratamiento del estrés asociado con la administración del tratamiento. Otra consideración importante es el momento del tratamiento. Puesto que la respuesta innata de L. monocytogenes es muy rápida, se recomienda que el primer tratamiento puede administrar en el día antes de, o al mismo tiempo que, la inoculación con el fin de asegurar que los niveles terapéuticos del reactivo lograrse antes de la la iniciación de la respuesta inmune innata. Sin embargo, otra consideración importante es la dosis del agente patógeno que se utilizará para INFECTIOnorte. Una dosis subletal se recomienda para la medición de la carga bacteriana, ya que aumenta la posibilidad de que el patógeno se concentrará en el bazo y el hígado, lo que permite la enumeración más exacta de las bacterias. Una dosis subletal también se recomienda para la enumeración de las respuestas de IFN-gamma por los linfocitos de adaptación para asegurar que los animales no sucumben a la listeriosis antes del momento de la expansión de células T pico. Por el contrario, se recomienda que una dosis más alta infecciosa se utiliza para la medición de la respuesta temprana de células NK y NKT a las 24 horas con el fin de maximizar la producción de IFN-γ por estas células. El LD clásica 50 es la dosis de agente patógeno que resulta en 50% de letalidad de ratones. Ya que la muerte no fue un criterio de valoración aceptable en nuestra institución y puesto que muchos de los síntomas de listeriosis pueden predecir si un animal es probable que sucumbir a una infección, se utilizó una lista definida de los signos clínicos en lugar de la muerte como un punto final en nuestros estudios. Using este método, se determinó que la LD modificado 50 era 10 5 CFU para 8 semanas de edad, macho y 1,5 x 10 5 CFU para 8 semanas de edad, hembra C57BL / 6J 31. Estos LD 50 dosis se determinaron midiendo el porcentaje de supervivencia de los ratones a los puntos finales en los estudios de escalada de dosis graduales (N = 5 estudios en total) que contenían cada uno N = 8 ratones por grupo (por ejemplo, los ratones se infectaron primero con 10.000 CFU , a continuación, un segundo lote con 20.000 CFU, etc.). El cálculo LD 50 se determina a partir de un gráfico de regresión del log (CFU) (eje x) frente a la probit de los valores de porcentaje de supervivencia (eje y) (página web: userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit /ProbitAnalysis.pdf). Tenga en cuenta que la LD 50 dosis modificado determinado en nuestro laboratorio puede diferir de la de otro laboratorio, incluso cuando la infección de los ratones con la misma cepa de L. monocytogenes. Parte de esta variabilidad puede relacionarse con la naturaleza subjetiva of monitoreo de signos clínicos de listeriosis en comparación con el punto final más absoluto de muerte. variabilidad adicional puede ser resultado de diferencias en los factores ambientales tales como la dieta del ratón o la microbiota o las diferencias en la preparación de inóculo entre laboratorios. Por lo tanto, se recomienda que antes de embarcarse en cualquier estudio de supervivencia, se realizó un estudio piloto donde los ratones hembra (n = 8 ratones / grupo) están infectados con 1,5 x 10 5 UFC de la misma cepa de L. monocytogenes tal como se utiliza en este estudian y síntomas monitorizados para determinar si este hecho se traduce en dosis de supervivencia del 50% a los puntos finales. Si la supervivencia es inferior o superior a 50% en este UFC, la escalada de dosis paso a paso o de dosis estudios de apaciguamiento podrían llevar a cabo para una rápida optimización de la dosis LD 50. Otra consideración importante es la cepa o subcepa de ratones utilizados para estudios de infección. Este protocolo describe la infección de la comúnmente utilizada endogámica cepa de ratón C57BL / 6J. Esta<html> cepa es muy adecuado para la medición de las respuestas de IFN-gamma desde este ratón se considera que es un Th1 propensas cepa 33 y, como resultado, es relativamente resistente a L. monocytogenes infección (en comparación con las cepas de Th2-propensas ratón tales como BALB / c) 34,35. La adaptación de este protocolo para otras cepas de ratón requerirá el conocimiento de la dosis infecciosa del patógeno de la cepa en particular. También se recomienda el uso de ratones de la misma edad, el sexo y el proveedor como se describe en este protocolo con el fin de reducir la cantidad de solución de problemas que conlleva la creación del modelo. Por ejemplo, C57BL / 6 ratones ordenó de un proveedor (por ejemplo, C57BL / 6J) pueden exhibir diferencias genéticas que C67BL / 6 ratones ordenados de otro proveedor (por ejemplo, C57BL / 6NTac) 36. Además, la microbiota intestinal difiere entre C57BL / 6 subcepas obtenidos de diferentes proveedores, que pueden influir en el equilibrio de las respuestas Th1 y Th17 en el ratón 37. ove_title &quot;&gt; Modificaciones potenciales a la Técnica Los ratones se inoculan más comúnmente ip o por vía intravenosa en lugar de la ruta natural de la infección en los seres humanos, que es a través del tracto gastrointestinal. Las infecciones orales son menos comunes debido a cepas estándar de L. monocytogenes ineficiente infectan el epitelio intestinal de los ratones 38. Esto es porque hay un solo cambio de aminoácido en la secuencia de ratón E-cadherina de la cadherina E humana que resulta en la pérdida de reconocimiento de E-cadherina por la proteína invasión listerial, internalina A (INIA) 39. Para superar esta barrera, los investigadores utilizan ratones que son transgénicos para la proteína E-cadherina humana o utilizan listeria que se han diseñado para expresar una secuencia mutada del INIA (INIA mut) que se une al ratón E-cadherina con la misma afinidad que WT EGD para E-cadherina humana 40. Por lo tanto, una modificación potencial de esta técnica es infectar ratones por vía oral. Se remite al lector a otra publicación JoVe que describe métodos de inoculación por vía oral 38. Tenga en cuenta que la alteración de la modalidad de la infección afectará a la dosis infecciosa, así como la cinética de difusión del patógeno. Este protocolo describe el uso de listeria muertas por calor para provocar la producción de IFN-γ por las células CD4 + y T CD8 +. Muertas por calor L. monocytogenes fue elegido como un estímulo en nuestros estudios, ya que este antígeno es barato y porque nuestro laboratorio estaba interesado principalmente en las respuestas de células T CD4 + al patógeno. Una limitación es que las bacterias muertas por calor no lo hacen de manera eficiente las respuestas principales CD8 + de células T ya sea in vitro o in vivo 41 42,43 infección en. Por lo tanto, la producción de células CD8 + T IFN-γ que observamos por esplenocitos cosechadas en el pico de la infección (es decir, la Figura 6) probablemente es en respuesta a la residualbacterias vivas presentes en los cultivos de esplenocitos o se obtuvo como resultado de citoquinas inducidas por citoquinas liberan 41. Como alternativa a la listeria muertos por calor, también se podría provocar respuestas IFN-gamma ex vivo mediante la exposición de las células T a los péptidos que codifican epítopos en proteínas listeria. De hecho, inmunodominante MHC Clase epítopos para listeriolisina O y la hidrolasa p60 II-restringido y se han descrito para los ratones C C57BL / 6 y BALB / y epítopos inmunodominantes MHC de clase I se han descrito para BALB / c 44. Sin embargo, otro enfoque es infectar ratones con cepas de L. monocytogenes que han sido diseñados para expresar antígenos modelo, tales como ovoalbúmina o antígenos virales con el fin de tomar ventaja de existente MHC de Clase I y Clase II reactivos MHC-tetrámero para enumerar específica de antígeno células T en ratones infectados 45,46. Otras limitaciones del protocolo Otra limitación de este modelo es que oproducción medidas ólo IFN-γ por las células inmunes en el bazo. Además de la utilización de tetrámeros para enumerar las células T específicas de antígeno (de ovoalbúmina que expresan variantes de L. monocytogenes), citometría de flujo paneles de tinción descritos aquí podría ser fácilmente modificado para medir la producción de otras citoquinas tales como TNF o IL-2 o moléculas efectoras que participan en CD8 de células T o la destrucción mediada por NK del patógeno tal como perforina o granzima B. Además, este protocolo también podrían adaptarse para examinar IFN-γ producido por las células inmunes en el hígado. Las aplicaciones futuras Una vez que se domina este protocolo, que puede servir como un simple modelo in vivo para examinar los efectos de varios agentes o genes en Th1 y la inmunidad celular.

IFN-γ es una citoquina que es crucial para la mediación de la inmunidad contra los patógenos intracelulares y para controlar el crecimiento del tumor 5. La importancia de esta citocina en la resistencia bacteriana es evidente en la observación de que los seres humanos con mutaciones en la vía de señalización de IFN-γ son altamente susceptibles a la infección por micobacterias y salmonelas 6. De manera similar, los ratones deficientes en IFN-γ o los defectos de exhibición receptor de IFN-γ en la resistencia a las micobacterias 7-9 y otros patógenos intracelulares, incluyendo L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, Salmonella typhimurium 13, y ciertos virus 11. Además de los agentes patógenos que combaten, IFN-γ juega un papel crucial en la defensa de huésped contra tumores 14. Aunque una mayor producción de IFN-γ es beneficioso en el contexto de la infección o el cáncer, la producción prolongada de esta citocina se ha relacionado to el desarrollo de autoinmunidad sistémica 15-17 y la aceleración de la diabetes tipo I en el modelo de ratón diabético no obeso 18. Las principales fuentes de IFN-γ incluyen células NK, células NKT, delta gamma células T, células T auxiliares 1 (Th1) y linfocitos T citotóxicos (CTL) 5,19,20. IFN-γ aumenta tanto la inmunidad innata y adaptativa por: (1) hasta la regulación de complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II expresión, (2) el aumento de la expresión de moléculas co-estimuladoras en las células presentadoras de antígeno, (3) los macrófagos mejora la fagocitosis y la producción de citoquinas pro-inflamatorias y microbicidas factores (por ejemplo, óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno), (4) la promoción de la diferenciación de células T CD4 + vírgenes en células efectoras Th1, (5) la promoción de cambio de clase de anticuerpo a la inmunoglobulina ( Ig) 2a y IgG3 (en el ratón), (6) la inducción de la producción de quimiocinas para reclutar células inmunes a sitios de iNFECCIÓN, y (7) el aumento de células NK y las respuestas de CTL 5,19. Dada la importancia crucial de IFN-γ en la respuesta del huésped a patógenos y tumores, IFN-γ recombinante ha sido probado como tratamiento para diversas infecciones y neoplasias (revisado en 19). Sin embargo, ya que la administración sistémica de IFN-γ o la citoquina Th1 promoción de la interleucina-12 (IL-12) está asociada con efectos secundarios y la toxicidad relacionada con la dosis 19,21, existe un interés en el desarrollo de estrategias alternativas para aumentar la producción de IFN-γ por células inmunes. El desarrollo de nuevos productos biológicos y moléculas pequeñas requiere herramientas de cribado in vivo para probar si tales agentes aumentan la producción de IFN-γ durante una respuesta inmune y si esto se traduce en efectos biológicos significativos tales como el aumento en la supervivencia animal. La infección experimental de ratones con la bacteria L. monocytogenes gram positivas ha sido un modelo Instrumental paradescifrar el papel del IFN-γ en el huésped-inmunidad contra patógenos intracelulares 1,22. La infección de ratones con el patógeno por vía intravenosa o por vía intraperitoneal (ip) conduce a la rápida difusión de las bacterias en el bazo y el hígado, donde quedan internalizadas por los macrófagos residentes y los hepatocitos con cargas bacterianas pico en el bazo se producen entre 3 y 4 días post 1,3,22 infección. La producción de IFN-γ por las células NK es importante para la activación de macrófagos y la resistencia temprana contra el patógeno 3; Sin embargo, a dosis altas infecciosas, producción de IFN-γ también puede ser perjudicial para aclaramiento patógeno 23. Células NKT son también una fuente de IFN-γ en el bazo y el hígado durante el control temprano de patógenos 2,24 y esta producción se ha demostrado para amplificar la producción de IFN-γ por otros tipos de células incluyendo las células NK 2. Por otra parte, después de acción linfocitos T de adaptación, las células T CD8 + en particular, son importantes para mediar en la eliminación del patógeno y proporcionando protección contra 1,4,22 reinfección. Este modelo de infección ha sido atractivo para los investigadores para una serie de razones (revisado en 1). En primer lugar, la infección con el patógeno es altamente reproducible e induce una fuerte respuesta inmune Th1 y celular. En segundo lugar, durante la infección subletal, la carga bacteriana se concentra en el hígado y el bazo en los que se puede medir fácilmente. En tercer lugar, el patógeno puede ser manejado con seguridad bajo nivel de bioseguridad 2 (BSL2) condiciones. En cuarto lugar, el organismo y la respuesta inmune que genera se han caracterizado ampliamente. Por último, una variedad de cepas mutantes y genéticamente modificados han sido desarrollados que están disponibles para su uso. Aquí se describe un protocolo básico para la inoculación de los ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de L. monocytogenes y 25 para la medición de IFN - γ rerespuestas por NK, NKT, y los linfocitos de adaptación después de la infección. También se describe cómo medir la carga bacteriana en el bazo y el hígado después de la infección subletal y para llevar a cabo estudios de supervivencia después de la infección con un LD 50 dosis modificada del patógeno. Finalmente, los datos representativos se muestran de cómo este protocolo se puede utilizar para detectar el efecto de los nuevos tratamientos en las respuestas de IFN-gamma y la supervivencia del ratón de L. monocytogenes infección.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="923">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Brain Heart Infusion Broth, Modified</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">299070</td>
			<td style="width:273px;">any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:107px;">214010</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">X100</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1xPBS</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">D8537</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TissueLyser II</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:107px;">85300</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ammonium Chloride (NH3Cl)</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">KHCO3</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">22400089</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">12483</td>
			<td>Before use, heat-inactivate at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25030</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Non-essential amino acids</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">11140</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">554724</td>
			<td>Use 4 &#956;l in 6 ml cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">16% Paraformaledehye</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:353px;">10 x Perm/Wash buffer</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">554723</td>
			<td>Dilute 10x in ddH20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">14-0161</td>
			<td>Dilute 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">65-0866</td>
			<td>Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">15-0041</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">11-0081</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PBS57/mCD1d tetramer-APC</td>
			<td style="width:191px;">NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td>Obtained as a gift from the facility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Mouse TCR&#946;-PE-Cy7 (H56-597)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">25-5961</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">47-3351</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">25-0451</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">12-7311</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">OneComp eBeads</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">01-1111</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Mouse IFN gamma ELISA kit</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td>88-7314</td>
			<td>Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50 mL vented tubes for culture</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">bacterial petri dishes</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">2 ml cyrovials</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">UV spectrometer</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">safety engineered needles</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">C57BL6/J</td>
			<td style="width:191px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:107px;">Stock#000664</td>
			<td>Order for arrival at 7 wks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Bleach</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>For decontamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>For decontamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Glass beads</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>rotor, buckets, bucket covers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Sterile Glycerol</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Pipette Tips</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Pipette</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">70 micron strainers</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">3 ml syringe</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Pipette gun</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Filtration Units</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Round bottomed plates</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">FACs tubes</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">BD LSR II</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Flowjo software</td>
			<td style="width:191px;">Treestar</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Multichannel pipettor (0-300 &#181;l)</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for washing glass beads, any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Microbank Bacterial Preservation System</td>
			<td style="width:191px;">Pro-lab Diagnositics</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental infection with listeria monocytogenes as a model for studying host interferon-&#947; responses

L. monocytogenes es una bacteria gram-positiva que es una causa de enfermedad transmitida por alimentos en seres humanos. La infección experimental de ratones con este patógeno ha sido altamente informativo sobre el papel de las células inmunes innatas y adaptativas y citocinas específicas en la inmunidad del huésped contra los patógenos intracelulares. La producción de IFN-γ por las células innatas durante la infección subletal con L. monocytogenes es importante para la activación de los macrófagos y el control temprano del patógeno 1-3. Además, la producción de IFN-γ por los linfocitos de memoria de adaptación es importante para la imprimación de la activación de las células innatas a la reinfección 4. La L. monocytogenes modelo de infección por lo tanto sirve como una gran herramienta para investigar si las nuevas terapias que están diseñados para aumentar la producción de IFN-γ tener un impacto en las respuestas de IFN-γ in vivo y tienen efectos biológicos productivos, tales como el aumento de la eliminación de bacterias o la mejora de la supervivencia del ratón deinfección. Se describe aquí es un protocolo básico para cómo llevar a cabo las infecciones intraperitoneales de ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de L. monocytogenes y para medir la producción de IFN-γ por las células NK, células NKT, y linfocitos de adaptación por citometría de flujo. Además, los procedimientos se describen a: (1) crecer y preparar las bacterias para la inoculación, (2) medir la carga bacteriana en el bazo y el hígado, y (3) la supervivencia medida de los animales a los puntos finales. También se proporcionan datos representativos para ilustrar cómo este modelo de infección se puede utilizar para probar el efecto de agentes específicos en las respuestas de IFN-gamma a L. monocytogenes y la supervivencia de los ratones de esta infección.

La Figura 3 presenta un poco de flujo típico de citometría de tinción de IFN-γ en las células NK y NKT esplénicas a las 24 horas después de la infección con 10 5 CFU del patógeno. Esta figura también ilustra la estrategia de gating para el panel de tinción descrito en la Tabla 2. La Figura 4 muestra algunos datos representativos que se obtuvieron en un experimento donde los ratones macho se trataron con el antagonista de PPAR IS001 o vehículo de control, infectados con 10 5 CFU L. monocytogenes, y después se analizó para IFN-γ en las células NK y NKT después de 24 hr . Esta figura muestra que el tratamiento con IS001 impulsó respuestas IFN-gamma por las células NKT, pero las células no NK después de la infección con el patógeno. La Figura 5 muestra la tinción representativa de IFN-γ en esplénica CD4 + y células T CD8 + a los 7 días después de la infección después de la re-estimulación ex vivo con pa muertos por calorthogen. Esta figura también muestra la estrategia gating para el panel de tinción descrito en la Tabla 3. La figura 6 muestra datos representativos que se obtuvieron en un experimento en ratones machos fueron tratados diariamente con el antagonista IS001 o un vehículo de control de PPAR, infectados con una dosis subletal de L. monocytogenes, y analizados a los 7 días después de la infección. Este experimento muestra que el tratamiento con IS001 mejorada respuestas IFN-gamma por tanto CD4 + y linfocitos CD8 +. La Figura 7 muestra los datos representativos de un estudio que investigó el efecto de la IS001 antagonista de PPAR en la supervivencia del ratón para puntos finales después de la infección con el LD 50 dosis modificada del patógeno. Plotted es el porcentaje de supervivencia de los ratones contra el tiempo después de la infección. Esta figura muestra que el tratamiento con IS001 aumentó la supervivencia de ratones macho a los puntos finales. En conjunto, estos datos ilustran cómo este modelo se puede aplicar a investigarlos efectos de nuevos medicamentos o tratamientos sobre las respuestas de IFN-γ en vivo y para explorar cómo estos cambios afectan a la supervivencia del animal inmune contra la infección. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig1.jpg" /> Figura 1. La disección de los bazos de ratones infectados. Esta serie de fotos muestra cómo diseccionar el bazo de un ratón muerto. (a) Se encuentran el ratón sobre su lado derecho y rocíe la piel con etanol al 70%. (b) El uso de pinzas asépticas o estériles y tijeras-difíciles de cortar, una incisión en la piel justo por debajo de la parte inferior de la caja torácica. (c) de pulverización hacia abajo la capa muscular expuesta con 70% de etanol. El bazo debe ser visible debajo de la capa muscular (cabeza de flecha abierta). (d) El uso de pinzas asépticas o estériles y tijeras finas, haga una incisión de la capa muscular para revelar el bazo. (e) agarrar suavemente el bazo con las pinzas y USE finas tijeras para cortar el bazo de distancia de alrededor del tejido conectivo. (f) Colocar el bazo en un tubo cónico de 15 ml que contenía 1x estéril PBS. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig2.jpg" /> Figura 2. Los esplenocitos recuento usando un hemocitómetro. (a) muestra la red central del hemocitómetro. (b) muestra una vista ampliada de la red central que contiene 25 cuadrados grandes (que contienen cada uno 16 cuadrados más pequeños). Los cinco grandes plazas utilizados para el recuento se resaltan en (4 cuadrados de las esquinas más el cuadrado central de la cuadrícula central) grises. (c) muestra una vista ampliada de uno de los grandes cuadrados grises. Para determinar el volumen de las células en 10 6 / ml, primero recuentotodas las células viables dentro de los cinco grandes cuadrados grises. En el ejemplo mostrado, este recuento es 215. Al contar, sólo para asegurarse de contar con todas las células claras (no-azul), incluidos los que estén en contacto con las líneas dobles en la derecha y abajo de la parrilla. No contar las células que tocan las líneas dobles en la izquierda y la parte superior de la rejilla. Tome el recuento de cinco cuadrados totales y se divide por 10 para obtener el número de células en 10 6 / ml. En el ejemplo, 215 dividido por 10 es de 21,5 x 10 6 células / ml. Tenga en cuenta que estos cálculos sólo funcionan si usted está contando 5 de las grandes plazas como se destaca y diluyen las células de 1: 1 en azul tripán. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig3.jpg" /> Figura 3. Estrategia de apertura de puerta para la detección de IFNγ producción en las células NK y NKT. Primera puerta a los linfocitos en FSC-A por SSC-Una trama. Luego de compuerta en aquellos eventos que están en la diagonal en el FSC-H / FSC-Una parcela. Estos son los singletes. Luego de compuerta en vivo (AmCyan -) y CD8 - células. Se representa la tinción de tetrámero contra el TCR. Las células NKT se encuentran dentro de la población doble positivo y las células NK son dentro de la población doble negación. Puerta de las células dobles positivas, y la trama NKp46 frente a FSC. Puerta de la población negativa NKp46, que son las células NKT (esta puerta se puede ajustar mediante la búsqueda del punto de división en las dos poblaciones de la trama de las células NK). Las células NK son el tetrámero - TCR - NKp46 + población. Dentro de NK y NKT puertas de células, las células + IFN-gamma en el canal de PE se identifican después de configurar una puerta basado en el control FMO. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig3large.jpg" target="_blank">Por favor haz click</a>aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig4.jpg" /> Figura 4. Los datos representativos obtenidos para las frecuencias de las células NK y NKT IFN-γ + a las 24 horas post-infección. En este experimento, machos C57BL / 6J (N = 3 - 4 / grupo) fueron infectados ip con 10 5 UFC de L. monocytogenes o se dejaron un-infectados. Los ratones también se les administró el IS001 fármaco o vehículo (0,5% de carboximetilcelulosa) al mismo momento de la inoculación y 12 horas más tarde. Veinticuatro horas después de la inoculación, los ratones fueron sacrificados y los bazos se retiraron y se procesaron de forma individual y se tiñeron para citometría de flujo. Se muestra son la media ± SEM de frecuencia de células en el NK IFN-γ + (a) o puertas de células NKT (b) en los ratones no infectados o infectados después del tratamiento con un vehículo o el IS001 de drogas. *Indicarsa diferencia (P &lt;0,05) de control del vehículo mediante la prueba t de dos colas. Los datos se vuelven a imprimir desde el 31 con el permiso del Journal of Immunology (volumen 195, pp. 5.189-5202, 2015). Derechos de autor 2015. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig5.jpg" /> Figura 5. Estrategia de apertura de puerta para la detección de la producción de IFN-γ en las células CD4 y CD8. Primera puerta a los linfocitos en FSC-A por parcelas SSC-A. Luego de compuerta en aquellos eventos que están en la diagonal en el FSC-H / FSC-Una parcela. Estos son los singletes. Dentro de esta puerta, puerta de AmCyan (-) en vivo las células CD45 +. Entonces la puerta en las poblaciones ya sea CD8 + o CD4 +. Dentro de cada puerta, el IFN-γ +las células en el canal de PE se identifican mediante la comparación de la tinción con el control FMO. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig6.jpg" /> Figura 6. Los datos representativos obtenidos para las frecuencias de células CD4 + y CD8 + IFN-γ + a los 7 días después de la infección con L. monocytogenes (cepa EGD). En este experimento, ratones C57BL / 6J machos fueron infectadas ip con 2 x 10 4 CFU L. monocytogenes (N = 7 / grupo) o se dejaron sin infectar (N = 3 / grupo). Los ratones también se les administró el IS001 fármaco o vehículo (0,5% de carboximetil celulosa) de partida dos veces al día en el día de la inoculación. Siete días después, los ratones fueron sacrificados y los bazos se retiraron y se procesaron individualmente paracultivo de células. Las células mononucleares de esplenocitos fueron estimulados durante 24 horas con inhibidores añadidos para la final de 4 horas de cultivo destruidas por calor L. monocytogenes con el transporte de proteínas. Las células fueron teñidas para la citometría de flujo. Se muestra son la media ± SEM de frecuencia de IFN-γ + células en el CD4 + (A) o puertas de células CD8 + (B) en ratones no infectados o infectados después del tratamiento con un vehículo (carboximetilcelulosa 0,5%) o el IS001 de drogas. * Indica una diferencia (P &lt;0,05) de la contraparte control del vehículo según se determina mediante la prueba t de dos colas. Los datos se vuelven a imprimir desde el 31 con el permiso del Journal of Immunology (volumen 195, pp. 5.189-5202, 2015) .Copyright 2015. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 7. Los datos representativos obtenidos durante un experimento que comparó el efecto de un antagonista PPAR 1S001 de ratón La supervivencia a los puntos finales después de la infección de ratones macho C57BL / 6J ratones con L. monocytogenes (cepa EGD). En este experimento, machos C57BL / 6J (n = 10 ratones / grupo) fueron ip infectado con el LD 50 dosis modificada del patógeno (10 5 CFU) de L. monocytogenes. Los ratones también se les administró el IS001 fármaco o vehículo (0,5% de carboximetil celulosa) de partida dos veces al día en el día de la inoculación. Los ratones fueron observados diariamente para detectar signos clínicos y se sometieron a eutanasia si se cumplían puntos finales. Se muestra la supervivencia de ratones por ciento a lo largo del tiempo los puntos finales * indica una diferencia en la supervivencia entre los grupos según lo determinado por la prueba de log-rank (p &lt;0,05). Los datos se vuelven a imprimir desde el 31 con el permiso del Diario Of Inmunología (volumen 195, pp. 5189 a 5.202, 2015). Derechos de autor 2015. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig7large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="tabla 1" src="/files/ftp_upload/54554/54554table1.jpg" /> Tabla 1: Muestra algunos cálculos representativo para determinar UFC en una alícuota del Día de la Cultura. En este ejemplo, una parte alícuota de la cultura días fue tomada y se diluyó 1: 1 con medio de BHI. La OD 600 de esta muestra diluida se determinó que era 0,84. Además, una parte alícuota de 100 l fue tomada para la determinación de CFU. Esta muestra se diluyó con 900 l de medios BHI (10 -1) y se lavó y se resuspendió en 1 ml BHI. Se preparó una serie de dilución de 10 veces de esta muestra (10 -2-10 -9) y muestras diluidas se depositaron sobre placas BHI aga(sólo se muestran los valores de 10 -4 10 -9) placas r. Se contaron las colonias día siguiente. Sólo aquellas placas que tenían los números de colonias entre 30-300 fueron considerados para el cálculo (es decir, 10 -6 placa, resaltado en amarillo). A continuación, el número de colonias en esta placa (70) se dividió por 0,1 (volumen en ml chapado) para obtener el UFC / ml de la muestra diluida. Este valor se multiplica por el factor de dilución (10 6) para obtener la lectura / ml CFU del cultivo sin diluir. TMTC = demasiados para contarlos. <img alt="Tabla 2" src="/files/ftp_upload/54554/54554table2.jpg" /> Tabla 2: Panel de tinción para la detección de IFN-γ en células NK y NKT. Tenga en cuenta que bolas de compensación teñidas con los anticuerpos de flujo utilizado en el panel o los esplenocitos se tiñeron con varias versiones fluorocromo de CD4 GK1.1 clon de anticuerpo pueden ser usados ​​como controles positivos individuales. <img alt="Tabla 3" src="/files/ftp_upload/54554/54554table3.jpg" /> Tabla 3: Panel de tinción para la detección de IFN-γ en CD4 + y CD8 +. Tenga en cuenta que bolas de compensación teñidas con los anticuerpos de flujo utilizado en el panel o los esplenocitos se tiñeron con varias versiones fluorocromo de CD4 GK1.1 clon de anticuerpo pueden ser usados ​​como controles positivos individuales.

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Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Este protocolo describe cómo inocular ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) y para medir el interferón-γ (IFN-γ) las respuestas de las células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), y adaptativa linfocitos T después de la infección. Este protocolo también describe cómo llevar a cabo estudios de supervivencia en ratones después de la infección con una dosis DL50 modificada del patógeno.

La infección experimental con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como un modelo para el estudio de host Respuestas interferón gamma

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

experimental-infection-with-listeria-monocytogenes-as-model-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K vistas.  University of Toronto.  Este protocolo describe cómo inocular ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) y para medir el interferón-γ (IFN-γ) las respuestas de las células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), y adaptativa linfocitos T después de la infección. Este protocolo también describe cómo llevar a cabo estudios de supervivencia en ratones después de la infección con una dosis DL50 modificada del ...

Video: Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Investigación

Inmunología e Infección

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

La<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Modelo: Estudiar Contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the gastrointestinal phase of listeriosis due to the lack of a small animal model that closely mimics human disease. This paper describes a novel mouse model for oral transmission of L. monocytogenes. Using this model, mice fed L. monocytogenes-contaminated bread have a discrete phase of gastrointestinal infection, followed by varying degrees of systemic spread in susceptible (BALB/c/By/J) or resistant (C57BL/6) mouse strains. During the later stages of the infection, dissemination to the gall bladder and brain is observed. The food borne model of listeriosis is highly reproducible, does not require specialized skills, and can be used with a wide variety of bacterial isolates and laboratory mouse strains. As such, it is the ideal model to study both virulence strategies used by L. monocytogenes to promote intestinal colonization, as well as the host response to invasive food borne bacterial infection.

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

This paper describes a novel method for oral infection of mice using Listeria monocytogenes-contaminated food. The protocol can readily be adapted for use with other food borne bacterial pathogens.

La transmisión oral de<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En ratones a través de la ingestión de alimentos contaminados

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

El uso de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como organismo modelo para estudiar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infección

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC secreción de investigar la infección celular por el patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para la evaluación de la interacción de bacterias anaerobias con células huésped

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

La purificación del ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En los macrófagos

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologías para el estudio<em&gt; B. subtilis</em&gt; Las biopelículas como modelo para la caracterización de Pequeño Biofilm inhibidores de moléculas

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.