Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation - Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.

1. Evaluar el efecto de los inhibidores de moléculas pequeñas en Pellicle y la formación de biopelículas Colonia <ol><li> Preparar una solución 2x de medio de 25 MSgg biofilm inductor definido sin el cloruro de calcio y de hierro (III) hexahidrato de cloruro. Después de la esterilización del filtro, añadir el cloruro de calcio. El medio está listo para usar directamente o se puede almacenar a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Preparar la dilución 1x MSgg en el día del experimento. <ol><li> Diluir el medio 2x MSgg a 1x con agua destilada estéril (unas películas) o (80 ° C) de 3% agar caliente estéril (biofilms) y añadir de hierro (III) hexahidrato de cloruro a una concentración final de 50 mM (unas películas) o 250 mm ( biofilms). Añadir antibióticos o inhibidores de moléculas pequeñas a la concentración deseada y se mezcla bien. Por ejemplo, para obtener una concentración final de 0,5 mM D-leucina en 30 ml de establecer unas películas o biofilms, agregar 196,6 l de un 76,3 mM (10 mg / ml) solución madre de D-leucina. NOTE:. La composición final 1x MSgg se describe en la Tabla 1 en comparación con la receta original 25, el medio contenía 50 mg / ml treonina y la concentración de hierro para crecer colonias de biopelícula en medio MSgg sólido se incrementó 2,5 veces para optimizar la morfología de las colonias arrugada . </li></ol></li><li> Después de la solidificación del agar, se secan las placas MSgg sólidos en una campana biológica de 30 a 45 min antes de la inoculación. </li><li> Para seleccionar inhibidores específicos que interfieren con los mecanismos de formación de película (Figura 1), descartan que las concentraciones utilizadas afectan planctónicas y el crecimiento estática. <ol><li> Determinar el crecimiento planctónicas (aumento de la densidad óptica con el tiempo en cultivo líquido) en una curva de crecimiento sencilla mediante la medición de la densidad óptica a 600 nm cada hora hasta que la fase de crecimiento estacionario. </li><li> Para confirmar que la turbidez del cultivo medido representa el recuento de células vivas, determinar el número de unidades formadoras de colonias (CFU)de las células en la fase de crecimiento planctónicas de un cultivo en agitación después de varios puntos de tiempo. </li><li> Para evaluar el efecto de inhibidores de moléculas pequeñas en el crecimiento película estática, las células de la cosecha al final de una incubación de 3 días a 23 ° C a partir de una de 24 pocillos de cultivo celular bien, se inocularon en las mismas condiciones como se describe en las secciones 1,7-1,9 y determinar la CFU. Para este control, utilizar una cepa deficiente en película que carece de los operones que codifican para los componentes de la matriz extracelular (es decir, B. subtilis Δ EpsH, Δ TASA). NOTA: Esta cepa es capaz de crecer en condiciones estáticas, pero en contraste con un tipo salvaje de formación de película-, es deficiente en la capacidad de flotar a la interfaz aire-líquido, donde el crecimiento es favorecido debido al aumento de los niveles de oxígeno 26. Por lo tanto, esta Matriz extracelular y la tensión película es deficiente en una cepa de referencia recomendado para evaluar el crecimiento en condiciones estáticas. NOTA: Para el ex específicaamplia de la D-amino ácido D-leucina no canónica describe a continuación, un efecto sobre el crecimiento del plancton y estática en concentraciones que interferían con la formación de película se descartó 12,17. Los métodos para determinar planctónicas y el crecimiento estática se describen en detalle 17. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig1.jpg" /> Figura 1. Visión general conceptual para la identificación de una configuración experimental sólida para evaluar la inhibición específica de la formación de biopelículas. Criterios de selección de inhibidores de moléculas pequeñas que indican interferencia específica con la formación de biopelículas sin efecto pronunciado sobre el crecimiento del plancton. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <ol start="5"><li> Consecutivas a cabo B. subtilis de una reserva de C -80 ° (LB culture de 10 9 células / ml congelados en glicerol al 20%) para aislar colonias individuales sobre una placa de agar LB-1,5% con una punta estéril o aplicador. </li><li> Crecer durante la noche a 30 ° C. </li><li> Paso crítico: Para una inhibición película sólida por los D-aminoácidos no canónica tales como D-leucina, crecer una sola colonia recogió de la placa de agar LB-1.5% en 3 ml de caldo LB a 37 ° C durante 4 horas en una sacudiendo incubadora (velocidad de agitación 200 rpm). Reemplazar el caldo LB con medio MSgg biofilm inductor antes de la inoculación mediante la centrifugación de cultivo 1,5 ml de arranque durante 4 minutos a 6.000 xg, eliminando cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1,5 ml de medio MSgg. El resto de la cultura puede ser desechada. Importante: Para garantizar la robustez del sistema, la densidad óptica a 600 nm (OD 600) del cultivo iniciador se lavó debe estar entre 0,6 y 1. </li><li> Durante el crecimiento del cultivo iniciador, preparar una placa de cultivo celular multiplaca de 12 pocillos containinG 3 ml de medio de MSgg sin o con un rango de concentración del inhibidor de molécula pequeña (por ejemplo, 0,3, 0,5, 1 mM D-leucina 17). Para descartar los efectos de borde, distribuir la ubicación de las diferentes concentraciones a través de la placa de multiplaca. Alternativamente, utilizar de 24 pocillos de cultivo celular placas multiplaca que contienen 1,5 ml de medio de MSgg. </li><li> Inocular los pocillos de la placa multiplaca de cultivo celular de 12 pocillos con 3 l de cultivo iniciador se lavó (dilución 1: 1000). NOTA: una relación de dilución inferior, es decir, 1: 500 puede ser utilizado. Esto disminuye el tiempo de desarrollo de las unas películas. </li><li> Cultivar las unas películas a 23 ° C bajo condiciones estáticas durante tres días. No mueva las unas películas durante este tiempo, ya que puede afectar a la morfología de la superficie final de la película. </li><li> Adquirir imágenes con una exposición binocular y homogénea de un rayo. Como alternativa, tomar una imagen de las unas películas con una cámara de alta resolución. Para evitar artefactos causados ​​por inconsisángulos y sombras luz de la tienda, toman de arriba hacia abajo imágenes con la cámara fija en un trípode y el uso de una fuente de luz suave y grande a 45 ° de ambos lados. NOTA: Un método alternativo para estudiar B. subtilis pluricelularidad es el ensayo de colonias de biopelícula en medio sólido, biofilm inductor MSgg. Al igual que unas películas, este ensayo permite el estudio de los procesos espacio-temporales. Una vez que se determina el intervalo activo de los inhibidores de molécula pequeña, su efecto sobre la formación de colonias biofilm puede ser estudiado. </li><li> Para crecer colonias de biopelícula, simétricamente detectar 1,5 l de la pre-cultivo sin lavar (Paso 1.7) en la placa de agar 1,5% MSgg seca con la ayuda de una plantilla - 4 gotas por placa Petri de diámetro de 8,5 cm. Deje que las gotas se adsorben a la placa antes de moverlos. NOTA: La plantilla de ayuda a conseguir una distribución equitativa de las colonias de biofilm dentro del área donde se cultivan las células. Para preparar la plantilla, dibujar la superficie total del crecimiento en las escalas originales, dividirlo a la igualdad de sectaORS y marque el centro. Para un plato redondo Petri de 8,5 cm de diámetro, este asigna 14 cm 2 a una colonia biofilm. </li><li> Incubar las placas a 30 ° C durante tres días. Durante este tiempo, las colonias de biopelículas se desarrollan y forman una estructura tridimensional, arrugada. </li><li> Tomar fotografías como en el paso 1.11. </li></ol> 2. El etanol Ensayo de Resistencia <ol><li> Crecer biopelículas como se describe en los pasos 1,1-1,7 y 1.12-1.14. </li><li> Después de 68 h de crecimiento a 30 ° C, cortar las colonias de biopelículas en dos partes iguales con la ayuda de una cuchilla de afeitar y la plantilla. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig2.jpg" /> Figura 2. Ejemplo de diseño experimental para evaluar la resistencia de las células de colonias de biopelículas de agentes esterilizantes. Plantilla (A) utilizada para la distribución equitativa de las colonias de biopelícula a través de una placa de Petri y para el corte. (B)las imágenes de arriba hacia abajo sin tratar de biopelícula de tipo salvaje cultivadas durante 68 horas en un medio sólido, definido biopelícula que inducen MSgg a 30 ° C. La ampliación muestra cómo una colonia de biopelículas se puede cortar en dos mitades iguales. (C) Las dos mitades iguales biopelículas son tratados por igual (control, PBS) o con PBS o agente esterilizante y se procesa como se ha descrito. Barra de escala:. 1 cm <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="3"><li> Levante con cuidado cada mitad de la colonia de la biopelícula de la placa de agar con una pequeña espátula y moverlo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 500 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Si es necesario, raspar las células restantes de la placa y transferirlos al tubo de microcentrífuga también. NOTA: El segundo medio de la colonia biofilm se trata diferencialmente, dependiendo de si es el control o para probar la resistencia a la Steriagentes Lizing. </li><li> Para el control, se incuba la segunda mitad de la colonia de biopelículas en 500 l de PBS como en el paso 2.3. Para evaluar la resistencia a los agentes esterilizantes, transferir la segunda mitad de la colonia biopelícula a 500 l 50% (v / v) de etanol. NOTA: Alternative esterilización agentes tales como el hipoclorito de sodio se puede utilizar. Para todos los agentes de esterilización utilizados, determinar la concentración y tiempo de incubación activo en un experimento preliminar. </li><li> Incubar las colonias de biofilm por 10 min en el banco-tapa a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar las colonias biofilm durante 5 minutos a 18.000 xg y retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta. Añadir 300 l de PBS. </li><li> Sonicar las células ligeramente (amplitud 10%, pulso 5 seg), con la micropunta de un aparato de ultrasonidos. NOTA: La energía de ultrasonidos debe ser suficiente para los agregados de biopelícula separadas. Sin embargo, demasiado duro sonicación puede lisar las células. Confirmar con antelación por microscopía de luz que la energía de ultrasonidosutilizadas no lisar las células y que todos los agregados se disuelven. </li><li> Añadir 700 l de PBS a un volumen final de 1 ml. Realizar una dilución en serie (a 10 -7) en PBS y se extendió 100 l de 3 diluciones en una placa de agar LB 1.5%-usando perlas de vidrio estériles. NOTA: Las diluciones óptimas para ser plateado debe determinarse en un experimento preliminar, ya que esto depende de la cantidad de células en la colonia biofilm de interés y la tasa de supervivencia de las células en respuesta al agente de esterilización. </li><li> Incubar las placas durante la noche a 30 ° C, contar el CFU y determinar CFU / ml. Desde el final de UFC / ml de cada una de las colonias de la mitad de la biopelícula, se calcula el porcentaje de supervivientes. NOTA: Cuando se realiza y se analizaron como se ha descrito, las dos mitades de la colonia de control de la biopelícula y el no tratado frente a un medio de etanol-tratada de la colonia de la biopelícula no tratada debe producir diferencias a continuación 10% en los recuentos de células viables, la verificación de la simetría o la resistencia de la colonia , respectively. Alternativamente, los resultados pueden ser representados en total CFU. Los recuentos de células de control y colonia biofilm sin tratar deben permanecer en el mismo orden de magnitud. Por el contrario, se espera que los recuentos de células de la mitad tratados con etanol de una pequeña colonia de biopelículas molécula tratados de pasar por un mínimo de dos órdenes de magnitud a reclamar por un aumento de la sensibilidad al agente esterilizante. </li></ol> 3. El biofilm colonia Preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido <ol><li> Crecer colonias de biopelícula como se describe en los pasos 1,1-1,7 y 1.12-1.14. </li><li> Preparar un nuevo lote de 2% (v / v) de glutaraldehido, 3% (v / v) de solución de paraformaldehído en cacodilato de sodio 100 mM, 5 mM de tampón de cloruro de calcio, pH 7,3. Preparar 5 ml de fijador para cada placa de Petri de 8,5 cm de diámetro. PRECAUCIÓN: glutaraldehído y paraformaldehído son peligrosos. Manejarlos con el equipo de seguridad dentro de una campana química. Descartar las soluciones y los materiales contaminados a la ZACresiduos peligrosos. </li><li> añadir con cuidado el fijador a las colonias de biopelícula, sin dispensar directamente en la parte superior de las biopelículas. NOTA: Debido al carácter hidrófobo de la colonia biofilm, las colonias se desprenden lentamente del agar y comienzan a flotar. </li><li> sellar cuidadosamente las placas con una tira de Parafilm. Incubar en un agitador rotatorio durante 2 horas a temperatura ambiente y, posteriormente, transferir las placas a 4 ° C durante la noche. </li><li> Al día siguiente, retire con cuidado el líquido con una pipeta Pasteur de vidrio conectado a una bomba de vacío. </li><li> Añadir cuidadosamente 10 ml 100 mM de cacodilato de sodio, tampón de cloruro de calcio 5 mM para lavar el biofilm y se incuba durante 5 min. Retire con cuidado el líquido con la pipeta Pasteur de vidrio desde la esquina de la placa para evitar dañar la biopelícula y añadir solución de lavado fresca por pipeteo suave. Repita este paso una vez. </li><li> Para la deshidratación de las colonias de biopelícula, continúe con los siguientes pasos: 2x 5 min en ddH2O; 2x 20 min en 30% de etanol; 2x 20 min en 50% de etanol; 2x 20 min en 70% de etanol; 2x 20 min en 96% de etanol; 2x 30 min en 100% de etanol. <ol><li> Añadir 15 ml de líquido por cada placa de Petri de 8,5 cm de diámetro en cada paso y eliminar el líquido cuidadosamente después de cada incubación. </li></ol></li><li> Utilizar uno de dos métodos diferentes para el secado de las muestras en etanol. <ol><li> Para el secado al aire a partir de etanol: <ol><li> Cortar un papel de filtro de celulosa (diámetro de 9 cm) en cuartos. Brevemente sumergir una cuarta parte en etanol al 100%, y luego transferir cuidadosamente una colonia flotante de biopelículas en la misma. Ponga el papel de filtro húmedo en una placa de Petri forrada con un papel de filtro. Cubrir la placa de Petri y dejar que las colonias biofilm secar durante la noche en una campana química. </li></ol></li><li> Por punto crítico (CP) SECADO utilizando dióxido de carbono (CO 2) como fluido de transición: <ol><li> Llenar 75% de la cámara de la máquina punto de secado crítico con 100% de etanol. La transferencia de las muestras en un soporte, cada muestra en su propia cHamber. Si es necesario, cortar el biofilm con tijeras en trozos más pequeños. Deje las muestras sumergidas en etanol durante toda la manipulación. A continuación, transferir el soporte en la cámara y cerrar la cámara herméticamente. </li><li> Se enfría la cámara a 7 ° C y empezar a agitar. Llenar la cámara completamente con CO2 líquido. Durante un tiempo de incubación de 7 minutos, dejar que la mezcla de etanol con el CO 2. A continuación, la descarga 25% de la solución. NOTA: No vaciar la cámara por debajo del nivel de la muestra. </li><li> Repita el paso 3.8.2.2 cuatro veces. </li><li> Repita el paso 3.8.2.2 cinco veces con un tiempo de incubación de tan sólo 5 min. Finalmente, el etanol debe ser completamente sustituido por CO 2. </li><li> Durante la última ronda, vacío sólo el 5% de la cámara. Apagar la agitación y el enfriamiento. Iniciar el calentamiento de la cámara a 42 ° C. A una temperatura de 31,1 ° C y una presión de 73,9 bar, el CO2 líquido alcanza su punto crítico, el estado en el que el pH gaseosaASE tiene la misma densidad que la fase líquida del disolvente 27. Una vez que la temperatura alcanza 42 ° C, se incuba durante 10 min. A 42 ° C, las emisiones de CO 2 en la cámara existe como gas supercrítico. NOTA: comprobar constantemente la presión de la cámara. La presión no debe superar los 120 bar a 42 ° C. </li><li> Comience lentamente para liberar el gas con calentamiento continuo. Esto mantiene las muestras en la fase de CO 2 -gas y previene la deformación de la morfología de la muestra a través de la tensión superficial del líquido. Ajuste el medidor de flujo a 5 L / hr por el ajuste fino de la válvula dosificadora controlar el medidor de caudal. Espere hasta que se suelta el que toda la presión en la cámara. Ahora abre la cámara y retirar las muestras cuidadosamente del soporte. </li></ol></li></ol></li><li> Escudo una microscopía electrónica de talón con cinta de carbono. Con la ayuda de pinzas, transferir cuidadosamente las colonias biofilm sobre el trozo. Conectar cada colonia para el talón mediante la adición de un delgado puente de cocheBon cinta, que es crucial para la eliminación de carga bajo el haz de electrones. En esta etapa, manejar las colonias de biopelícula con cuidado, ya que son muy frágiles. Almacenar las muestras en un desecador durante al menos 24 horas o hasta que el examen. </li><li> El día del examen con el microscopio electrónico de barrido, por pulverización catódica-capa de las colonias de biopelícula para 2 min en un ángulo de 60 ° en un oro-paladio por bombardeo iónico revestidor. Repita este paso dos veces y girar las muestras en 120 ° en el medio. Al final, por pulverización catódica abrigo de las muestras una vez durante 3 minutos desde la parte superior. La capa delgada 20 nm de oro-paladio mejora la conductividad y mejora el contraste de la muestra para la formación de imágenes en el SEM. </li><li> Almacenar las muestras en un desecador para evitar la rehidratación de la muestra 28 hasta la formación de imágenes con un microscopio electrónico de barrido 29,30. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bacillus subtilis formas robustas y altamente estructurados biopelículas tanto en estado líquido (unas películas) y en medio sólido (colonias). Por lo tanto, sirve como un organismo modelo ideal para caracterizar el modo de acción de los inhibidores de biopelículas específicas. En medio sólido, las células forman estructuras multicelulares con rasgos distintivos que no son evidentes en unas películas, como las arrugas que irradian desde el centro hasta el borde. Por lo tanto, unas películas y las colonias son sistemas complementarios para estudiar B. pluricelularidad subtilis. El objetivo de este estudio es desarrollar un B. subtilis sistema modelo para el biofilm (unas películas y colonias) inhibición. Varios pasos son críticos para la reproducibilidad del ensayo biofilm perturbación. Un primer paso crítico es confirmar que el efecto sobre la formación de biopelículas no se debe a una toxicidad general para bacterias que crecen en el estilo de vida planctónica. Esto puede ser considerado por comparación del efecto de una concentración dada de comocentro comercial inhibidor de molécula en la inhibición de biopelículas en relación con el efecto de esta molécula en el crecimiento planctónicas. Un efecto más fuerte de manera espectacular en el desarrollo de la biopelícula puede garantizar la identificación de mecanismos de destino que son específicamente importante para el desarrollo de biopelículas. Además, el estudio descrito en este documento demuestra la importancia de las condiciones de pre-cultivo para el desarrollo de unas películas y su sensibilidad a moléculas pequeñas. Antes de la caracterización de los efectos de moléculas pequeñas, reproducibles y robustos condiciones experimentales (por ejemplo, temperatura de crecimiento película y la falta de sensibilidad a la composición de los medios de comunicación) para probar sus efectos debe ser definido. Para encontrar tales condiciones, los medios de comunicación de la condición pre-cultivo, la fase de crecimiento de los medios de pre-cultivo, los medios de eliminación de pre-cultivo, el crecimiento y la temperatura de crecimiento deben ser considerados. Un reto importante, una vez que se encuentra un inhibidor específico de la formación de biopelículas, es encontrar cuantitativay los métodos cualitativos que caracterizan los efectos de estos inhibidores de molécula pequeña sobre el desarrollo de biopelículas y la resistencia. Aquí, dos metodologías importantes se describen en detalle que se puede utilizar para evaluar los efectos de tales inhibidores. En primer lugar, introducimos un método cuantitativo simple que puede sondear de forma reproducible la resistencia de tratados frente a biofilms de colonias no tratadas a bactericidas, tales como el etanol. Los resultados representativos se muestran para la sensibilidad de las colonias de biofilm D-leucina-tratada a 50% de etanol. Sin embargo, este ensayo se puede modificar fácilmente mediante el uso de agentes esterilizantes diferentes o antibióticos. En segundo lugar, un método de SEM se describe en detalle que permite alta resolución examen de los cambios en la colonia biofilm causado por el inhibidor de molécula pequeña en varios niveles complementarios: la estructura general, la organización y la abundancia de la matriz de EPS y sus componentes, y la morfologías unicelulares a lo largo de la biopelícula. Observamos que los dos métodos de dehydratien (secado al aire de 100% de etanol o CP-secado utilizando dióxido de carbono como fluido de transición) se puede utilizar igualmente durante la preparación de la muestra SEM de una colonia de la biopelícula. Es importante destacar que la fijación con éxito de la muestra biofilm se basa en gran medida de la hidrofobicidad de la colonia biofilm. Esta hidrofobicidad es una característica intrínseca de B. biofilms subtilis, debido a la capa superficial hidrófoba 10,34. Varios métodos se han aplicado previamente para estudiar conjunto de biofilm y desarrollo con B. subtilis como un organismo modelo 35. Un número de estudios independientes demostrado los efectos de la composición del medio en el desarrollo de biopelículas 36-38. Hasta ahora, sin embargo, una evaluación sistemática de los efectos de la composición del medio de la inhibición de biopelículas fue, a lo mejor de nuestro conocimiento, que carece. Este estudio demuestra que mientras que la inhibición de película B. subtilis por moléculas pequeñas es sensible a las condiciones pre-cultivo, es Unaffected por los efectos de la temperatura y la composición del medio, y por lo tanto útil para pantallas sistemáticas de los inhibidores de moléculas pequeñas. Además, se estableció un método sencillo, reproducible y cuantitativo para evaluar la resistencia de la molécula sin tratar o pequeño tratados con inhibidor de colonias de biopelícula a agentes antibacterianos, que actualmente carecen en el modelo de biopelícula organismo B. subtilis. B. subtilis biopelículas en combinación con los reporteros fluorescentes se pueden tomar más que buscar inhibidores de moléculas pequeñas que se dirigen tanto en un acto específico del desarrollo de la formación de biopelículas o una subpoblación específica de células dentro de la biopelícula. Los métodos descritos aquí no proporcionan resolución de una sola célula en términos de la expresión de genes dentro de la biopelícula. Los métodos para el análisis de expresión génica matriz dentro de EPS B. biopelículas subtilis a nivel de células individuales se establecieron con éxito 39. biopelículas bacterianas son de Crucial importancia en los entornos agrícolas, industriales y clínicos. En un contexto agrícola, la capacidad para formar biopelículas aumenta la colonización vegetal huésped de numerosos patógenos de plantas 40, y en un contexto clínico, los biofilms son inherentemente resistentes a los agentes antimicrobianos y 21 están en el centro de muchas infecciones bacterianas persistentes y crónicas. Además, ahora se reconoce que las biopelículas tienen enormes repercusiones en los costos para la industria ya que son extremadamente difíciles de eliminar y controlar 41. Por lo tanto, el desarrollo de un marco experimental para el estudio de los inhibidores de biopelículas microbianas proporcionará significativas agrícola 42,43, 21,44 clínicos, y tecnológicos 45-47 avances. Los métodos actuales se limitan a B. subtilis. Alentamos siguiendo los conceptos cuantitativos y cualitativos descritos para estudiar los inhibidores de moléculas pequeñas-biofilm específico en otras especies también. en adición<html> , Este estudio se refiere a un ejemplo específico para la inhibición de biopelículas por D-leucina, de varios inhibidores de biopelículas específica publicó anteriormente 17. Es importante destacar que, D-leucina ya se caracterizó por ser una molécula anti-biopelícula en el fitopatógeno Xanthomonas citri 48, presentando posibles similitudes entre la colonización vegetal y la formación de biopelículas. La formación de biopelículas (película y la formación de colonias rugosas) es también común en los patógenos humanos (por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia 49-51 uropatógeno coli 52,53). Los métodos descritos pueden desarrollarse más para buscar fármacos específicos que inhiben la formación de biopelículas y reducir la resistencia mediada por la biopelícula a los agentes antimicrobianos en la investigación clínica. En general, los métodos descritos aquí se pueden utilizar como una base para desarrollar conceptos cuantitativos y cualitativos para estudiar los inhibidores de molécula pequeña-biofilm específica en otras especies. nt &quot;&gt; En resumen, nos proporcionan una sencilla y útil herramienta para usar que demuestra las ventajas potenciales y los riesgos en el uso de B. subtilis para estudiar los inhibidores de biopelículas.

comunidades bacterianas multicelulares juegan un papel importante en entornos naturales y antropogénicos, y pueden ser beneficiosos o perjudiciales altamente. Estas colonias multicelulares se conocen como las biopelículas, en donde las células individuales están incrustadas en un (EPS) matriz de sustancias poliméricas extracelulares de producción propia. Los EPS se adhieren fuertemente a las células a la superficie que colonizan. Ellos sirven como un escudo contra las fuerzas mecánicas y químicas y crean un estrecho contacto entre las células vecinas, lo que facilita la comunicación celular 1. Una biopelícula puede ser vista como una comunidad diferenciada, donde las células uso altamente regulados, procesos orquestada para coordinar sus actividades dentro de la comunidad, así como en todas las especies 2-5. La transición de un planctónicas, el modo de vida libre de crecimiento a un estado de biopelícula se asocia a menudo con los procesos de desarrollo. Un buen ejemplo es la bacteria del suelo Bacillus subtilis Gram-positivas, y por lo tanto, una undomecepa sticated sirve como un modelo sólido organismo para estudiar las etapas de desarrollo que conducen a la formación de biopelículas. En esta bacteria, células móviles se organizan en estructuras multicelulares visibles que llevan a cabo tareas especializadas 4. Un grupo de células, la matriz-productores secretan exopolisacáridos 6, la proteína amiloide TASA 7,8, y la proteína de hidrofobicidad de la superficie BSLA 9,10; todos los cuales participan en el montaje de las EPS 11-13. Dada la abundancia de biopelículas en nichos naturales y antropogénicos y el daño fatal putativa que pueden causar, hay una necesidad urgente de encontrar formas de prevenir su formación. inhibidores de moléculas pequeñas pueden ayudar en el descubrimiento de nuevas rutas reguladoras, enzimas y proteínas estructurales que participan en la formación de biopelículas, y por lo tanto promover puntos de vista en los complejos procesos de montaje comunidad multicelular. Como B. subtilis es un modelo bien estudiado para bioformación de película 14,15, que puede ser utilizado para evaluar los efectos de varios inhibidores de biopelículas. Este estudio fuerza a cuatro métodos fundamentales que son clave para evaluar la respuesta de las biopelículas a los inhibidores de moléculas pequeñas. En primer lugar, para asegurar que estos inhibidores tienen un objetivo del biofilm específica, la separación del efecto sobre el crecimiento planctónicas del efecto sobre la formación de biopelículas es crítica. La mayoría de los agentes antibacterianos dirigen a las células en su fase de crecimiento del plancton, pero las moléculas que se dirigen a la forma de vida de biopelículas son raros. Adicionalmente, como moléculas que no afectan el crecimiento planctónica no son tóxicos, pueden reducir la presión selectiva que favorece mutantes resistentes a los antibióticos 16. Por ejemplo, cuando biofilms se tratan con D-aminoácidos o ciertas otras moléculas pared interferir celular, o bien son perturbados o desmontados, pero estos inhibidores sólo afectan ligeramente 12,17 crecimiento planctónicas. Por el contrario, muchos antibióticos alteran dramáticamente el crecimiento del plancton, con little o ningún efecto sobre la formación de biopelículas 17. En segundo lugar, se establece un marco experimental consistente y robusta para estudiar el efecto de las moléculas pequeñas es crucial. Hemos observado que el intervalo de concentración activa de inhibidores de moléculas pequeñas era sensible a las condiciones de pre-cultivo y para la configuración experimental utilizada para estudiar el efecto de estos inhibidores de molécula pequeña. Varios informes, en particular los que estudian B. subtilis, reveló variaciones en el rango de concentración en la que D-aminoácidos inhiben la formación de unas películas - las biopelículas bacterianas flotantes 12,17-19. Los resultados presentados aquí sugieren que los siguientes factores explican las diferencias en el rango de concentración activa: las condiciones de pre-cultivo (12,17 logarítmica frente fase de crecimiento del 20-estacionaria tardía), el medio de cultivo utilizado en la condición de pre-cultivo (rico, indefinido [caldo Luria, LB] frente define [glutamato monosódicoglicerol, MSgg]), la relación de la inoculación y, especialmente, la eliminación del medio de pre-cultivo antes de la inoculación. La temperatura de crecimiento de película estática mostró un papel menos importante en la gama de actividad de la inhibidor de molécula pequeña D-leucina, un ácido D-amino representativo utilizado en este estudio. Por último, una vez que las biopelículas son tratados con inhibidores específicos de biopelícula, se requieren métodos robustos e informativas para caracterizar los efectos de estos inhibidores sobre la aptitud de biopelículas. Aquí, se describen dos métodos para caracterizar de forma independiente el efecto de inhibidores de moléculas pequeñas en detalle: (1) El efecto sobre las células individuales dentro de una colonia biofilm y su resistencia a los agentes antimicrobianos. Las células en las biopelículas son típicamente más resistentes a los antibióticos en comparación con bacterias de vida libre 21-23. Aunque este fenómeno es multifactorial, la capacidad de los EPS para reducir la penetración de antibióticos se considera a menudo como una explicación atractiva 24 </sup&gt;. Este método evalúa la supervivencia de las células del biofilm preestablecidos después de la exposición a las sustancias antibacterianas. (2) El efecto sobre la arquitectura colonia biofilm, de la gran a la pequeña escala. colonias Biofilm se caracterizan por su estructura tridimensional y la presencia de los EPS. Utilizando microscopía electrónica de barrido, los cambios en la morfología celular, estructura colonia biofilm y la arquitectura y la abundancia de los EPS se pueden visualizar desde la grande (mm) a la pequeña escala (micras).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="897">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Luria Broth, Lennox</td>
			<td style="width:305px;">Difco</td>
			<td style="width:127px;">240230</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>Sigma, 136.09 g/mol</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potassium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Fisher Scientific, 209.27 g/mol</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnesium chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Merck, 203.30 g/mol&#160;</td>
			<td>1.05833.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride anhydrous</td>
			<td>J.T. Baker, 110.98 g/mol</td>
			<td>1311-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma, 197.91 g/mol</td>
			<td>31422-250G-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iron(III) chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma, 270.30 g/mo)</td>
			<td>F2877-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">zinc chloride anhydrous&#160;</td>
			<td>Acros Organics, 136.29 g/mol</td>
			<td>424592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thiamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma, 337.27 g/mol</td>
			<td>T1270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-tryptophan</td>
			<td>Fisher Scientific, 204.1 g/mol</td>
			<td>BP395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma, 165.19 g/mol</td>
			<td>P5482-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-threonine</td>
			<td>Sigma, 119.12 g/mol</td>
			<td>T8625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol anhydrous</td>
			<td>Bio-Lab Itd</td>
			<td>712022300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamic acid monosodium salts hydrate&#160;</td>
			<td>Sigma, 169.11 g/mol</td>
			<td>G1626-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-leucine</td>
			<td>Sigma, 169.11 g/mol</td>
			<td>855448-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ethanol anhydrous</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>830000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">razor blade</td>
			<td>Eddison</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">circular cellulose filter papers</td>
			<td>Whatman, 90 mm</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glutaraldehyde</td>
			<td>EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>EMS, 16% in water</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium cacodylate</td>
			<td>Merck, 214.05 g/mol&#160;</td>
			<td>8.2067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride 2-hydrate</td>
			<td>Merck, 147.02 g/mol&#160;</td>
			<td>1172113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stub-aluminium mount</td>
			<td>EMS, sloted head</td>
			<td>75230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">carbon adhesive tape</td>
			<td>EMS</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker 37&#176;C</td>
			<td>New Brunswick Scientific Innowa42</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf table top centrifuge 5424</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:301px;">Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip</td>
			<td>Branson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator 30 &#176;C</td>
			<td>Binder</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator 23 &#176;C</td>
			<td>Binder</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter System, 500 ml, polystyrene</td>
			<td>Cornig Incorporated</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S150 Sputter Coater&#160;</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CPD 030 Critical Point Dryer</td>
			<td>BAL-TEC</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Environmental Scanning Electron Microscope</td>
			<td>XL30 ESEM FEG Philips (FEI)</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodologies for studying b. subtilis biofilms as a model for characterizing small molecule biofilm inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

El ensayo de película es un método para estudiar los procesos altamente regulados y dinámicas de B. pluricelularidad subtilis. Además de esto, el ensayo de película es adecuado para ensayar una serie de cualquiera de las condiciones pre-arranque o pequeñas concentraciones de moléculas en una placa única multiplaca de cultivo celular en un experimento. Sin embargo, B. formación de película subtilis es sensible a las condiciones de pre-cultivo (por ejemplo, medio de crecimiento de la pre-cultivo y su fase de crecimiento), la relación de la inoculación y la eliminación del medio de pre-cultivo. por lo tanto, que exhibió por primera vez para un montaje experimental que nos ha permitido reproducir la inhibición película de D-leucina. Nuestros resultados muestran que la inhibición de película reproducible por D-leucina se puede obtener si las células son pre-cultivaron en medio definido, rico LB a una fase de crecimiento semilogarítmica (sola colonia en 3 ml de LB a 37 ° C durante 4 horas con agitación ), se centrifugaron y se resuspendieron en medio MSgg definido antes de un 1: 1000 inoculadosion (Figura 3A). Cuando las células se cultivaron en medio MSgg a la semilogarítmica fase de crecimiento (una sola colonia en 1 ml de LB durante 2 horas, re-diluido 1: 100 a 3 ml MSgg, y se cultivaron durante 5 horas a 37 ° C con agitación a 200 rpm), la eliminación del medio de pre-cultivo no tenía un efecto sobre la actividad D-leucina. Las células cultivadas a la fase de crecimiento estacionario (sola colonia en 1 ml de LB durante 2 horas, re-diluidos 1: 100 a 3 ml MSgg, y cultivadas durante un máximo de 20 horas en un rodillo a temperatura ambiente) y se lavaron en medio MSgg antes de la inoculación fueron menos sensibles. Sin embargo, este aumento de la resistencia hacia el efecto de inhibición de película de D-leucina podría ser debido a la mayor densidad de células de la pre-cultivo, el aumento de la relación de la inoculación. La relación de inoculación de la pre-cultivo para el crecimiento en un medio estático MSgg, es decir, 1: 500 o 1: 1000, influyó en el rango de actividad de D-leucina y el tiempo de desarrollo de película (Figura 3B). la inhibición película de D-leucina se produjoa diferentes temperaturas de crecimiento (23 ° C y 30 ° C, Figura 3C). Es importante destacar que, mientras que la sensibilidad de las células a D-leucina depende de las condiciones de pre-cultivo, la reproducibilidad de los fenómenos a diferentes temperaturas demuestra que la inhibición de película por la pequeña molécula de D-leucina tiene características robustas. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig3.jpg" /> . Figura 3. Ejemplo resultados que muestran los efectos de varias condiciones pre-cultivo sobre la inhibición película de D-leucina Varios parámetros tienen que ser evaluados para obtener una configuración experimental robusta, incluyendo: extracción (A) de los contaminantes del crecimiento anterior a la cultura medio (no lavado frente a lavado), medio de crecimiento de la pre-cultivo (, medio LB indefinido o definido rica biofilm inductor medio MSgg), y el estado de crecimiento de la pre-cultivo (logarítmica frente fase de crecimiento estacionario), (B) Relación de inoculación (1: 1000 frente a 1: 500) de la pre-cultivo en el medio de crecimiento película final, y (C de temperatura) el crecimiento (23 ° C frente a 30 ° C) B.. células subtilis NCIB 3610 se cultivaron en el medio indicado (LB o MSgg) durante 4 horas a 37 ° C o a temperatura ambiente durante la noche (o / n) con agitación, y medio de pre-cultivo se reemplazó por MSgg si está indicado (lavados o no lavado). Por último, el cultivo iniciador se inoculó 1: 1.000 si no se indica lo contrario, y unas películas fueron cultivadas bajo condiciones estáticas a 23 ° C durante tres días. fotografías de arriba hacia abajo fueron adquiridas con una cámara. Así diámetro es de 22 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Después de la identificación de las condiciones pre-cultivo y un montaje experimental que permitió un intervalo de actividad reproducible de Dleucina en la formación de película (precultivo crecido en LB a una fase de crecimiento semilogarítmica, se lavaron en MSgg, se diluyó 1: 1000 y se cultivaron a 23 ° C durante tres días), el efecto fue probado por su robustez. Para ello, la actividad de D-leucina en la formación de película se evaluó en varios medios MSgg modificado (Figura 4). El intervalo de actividad de D-leucina en la inhibición película fue consistente en los cinco medios ensayados, y muestra que el efecto de la D-leucina en la formación de película es robusto. Una tendencia similar se observó con D-tirosina, donde la inhibición de película en el rango de concentración de hasta 2 M fue consistente en varios medios de comunicación MSgg modificado (menor concentración de hierro y la sustitución de la fuente de nitrógeno con cloruro de amonio o la fuente de carbono con glucosa, los datos no mostrado). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig4.jpg" /> Figura 4. Sensibilidad a la D-leucina se produce endiversos medios de crecimiento. Se muestran fotografías de arriba hacia abajo de B. subtilis NCIB 3610 unas películas, que se cultiva en condiciones estáticas a 23 ° C en medio definido, biofilm inductor de MSgg o en diferentes medios MSgg modificado (fuente de carbono glucosa al 0,5%; fuente de nitrógeno 0,5% (NH 4) 2 SO 4; alto contenido de hierro de 250 M FeCl 3; bajo glicerol 0,125% de glicerol) durante tres días, excepto para el medio de fuente de nitrógeno alternativa (donde se cultivaron las unas películas durante cinco días), ya sea sin o con D-leucina a las concentraciones indicadas. cultivos iniciadores se cultivaron durante 4 horas a 37 ° C con agitación en un medio definido, rico LB. Antes de la inoculación, las células se lavaron por centrifugación y se resuspendieron en el medio de crecimiento película correspondiente. El cultivo iniciador se diluyó 1: 1.000, el diámetro del pozo es de 22 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </a&gt; Un método alternativo para el estudio de B. subtilis pluricelularidad es el ensayo de colonias de biopelícula en medio MSgg sólido. Al igual que unas películas, este ensayo permite el estudio de los procesos espacio-temporales. Una vez que el rango activo de los inhibidores de moléculas pequeñas se determina en el sistema de película, su efecto sobre la formación de colonias biofilm puede ser estudiado. En este estudio, se utilizaron colonias biofilm para evaluar el efecto de la D-leucina en la resistencia de las colonias de biopelícula a agentes esterilizantes, porque colonias biofilm son menos frágiles y en el fondo sólido, son más fáciles de manipular. Cuando las colonias biofilm tratados con D-leucina están expuestos a 50% de etanol durante 10 min, el porcentaje de células supervivientes gotas drásticamente en comparación a la fracción no tratado (Figura 5). Este método puede seguir desarrollándose para evaluar los efectos de otros inhibidores de moléculas pequeñas y sus efectos sobre la resistencia a los agentes bactericidas (sterilagentes izing o antibióticos). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig5.jpg" /> Figura 5. Ejemplo de resultados de resistencia colonia biofilm no tratada o tratada contra un agente de esterilización. Biofilm colonias de B. subtilis NCIB 3610 se cultivaron en medio sólido, que se define por 68 horas a 30 ° C, con o sin 0,5 mM D-leucina. Después de cortar las colonias en dos mitades iguales, una mitad se trató con PBS (control interno) y el otro medio con 50% de etanol o PBS (control). Después de sonicación suave, dilución en serie, placas y el recuento de las unidades formadoras de colonias, se calculó el porcentaje de supervivientes en comparación con el control interno. Se muestran los resultados de tres experimentos independientes con los promedios de dos (A) o tres (B, C) se replica y sus desviaciones estándar. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí t</a>o ver una versión más grande de esta figura. Microscopía electrónica de barrido (SEM) es una herramienta poderosa que se puede utilizar para centrarse en la arquitectura espacial de las arrugas de colonias biofilm, la abundancia y localización de la EPS y la morfología de células individuales 31. imágenes SEM requiere muestras que se pueden obtener imágenes con alto vacío. Para investigar muestras bajo condiciones de alto vacío, todas las moléculas de agua a granel que se han eliminado, y por lo tanto, las imágenes SEM requiere la deshidratación de la muestra antes de la imagen. Alternativamente, las muestras se pueden obtener imágenes en condiciones de bajo vacío en el modo de mojado por microscopía electrónica de barrido ambiental (ESEM), donde la muestra hidratada se seca suavemente en la cámara del microscopio. Para evaluar los efectos de los inhibidores de moléculas pequeñas de arquitectura colonia biopelícula, la organización celular y la morfología EPS, se compararon tres tipos diferentes de deshidratación de la muestra: secado en el microscopio bajo mo húmedade condiciones (ESEM), se secó al aire a partir de un punto de disolvente o crítica (CP) -dried utilizando dióxido de carbono como fluido de transición. En sin tratar y tratada D-leucina-B. se pudieron observar subtilis colonias biofilm diferentes etapas de hidratación de acuerdo con el método utilizado. Formación de imágenes en condiciones de bajo vacío en el modo mojado por ESEM preserva el estado muy natural de la colonia biopelícula. Sin embargo, la información sobre la morfología celular individual y EPS abundancia y la arquitectura era escasa, ya que los EPS estaban todavía completamente hidratado y las células se incrusta en el EPS (datos no mostrados). En cuanto a la deshidratación, CP-secado fue el procedimiento más riguroso. Se eliminó la mayor parte estructuralmente moléculas de agua unida y a granel a partir del tejido, lo que representa una pérdida de volumen de 30 a 70%, dependiendo del tejido 32. Por el contrario, de secado al aire conserva las moléculas de agua unidas. Un tejido embrionario por ejemplo perdió 18% de su volumen después de secado al aire de la etanol disolvente volátil y 59% después de secado CP-32 </sup&gt;. A medida que las EPS retener el agua y son muy hidratado, se recomienda considerar la pérdida completa del agua en el método CP-seca. Cuando las muestras de este estudio se deshidrataron en etanol y se secó al aire, se conservó la estructura tridimensional de la colonia biofilm, aparecieron células individuales, y se aplana los EPS, pero todavía conectada y cubría las células individuales (Figura 6A) . Colonias de biopelícula que se deshidrataron con etanol y se secaron CP-también conservan su estructura tridimensional, y las EPS se presentaron como una tela de araña (Figura 6C). En las muestras secadas al aire y CP-secado, los efectos de la inhibidor de molécula pequeña D-leucina en la arquitectura colonia biofilm, la estructura única morfología celular y EPS fueron aparentes (Figura 6B y D). Las colonias de biopelículas cultivadas en presencia de D-leucina eran más pequeñas y las arrugas fueron menos pronunciadas. se alargaron Las células tratadas con D-leucina, un fenotipo que es OBSErved en las células tratadas con moléculas dirigidas a la pared celular 33. Además, las células fueron claramente menos cubiertas con las EPS y no conectados firmemente a sus células vecinas a través de los EPS como se ve en las colonias de biopelícula no tratados. Los resultados presentados muestran que los dos métodos de biofilm deshidratación colonia, a partir de etanol o secado al aire CP-secaron usando dióxido de carbono como fluido de transición dan información valiosa sobre el efecto de pequeñas moléculas sobre la morfología de células individuales, así como en la abundancia EPS y la arquitectura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig6.jpg" /> Figura 6. Las moléculas pequeñas pueden cambiar la escala grande y pequeña de la arquitectura colonia biopelícula. Biofilm colonias de B. subtilis NCIB 3610 adulto (A y D) en ausencia o (B y D) en presencia de 0,5 mM D-leucina durante 72 horas a 30 ° Cen medio MSgg sólido se fijaron como se describe en el protocolo y se seca a partir de etanol de la siguiente manera: (A y B) se secó al aire y (C y D) CP-seca utilizando dióxido de carbono como fluido de transición. Se muestran las imágenes de arriba hacia abajo binocular de las colonias de biopelícula (izquierda, paneles superiores), de arriba hacia abajo fotografías de las colonias de biopelícula secos montado en trozos de microscopía electrónica antes de oro-paladio-recubrimiento (izquierda, paneles inferiores), de baja y alta magnificación imágenes obtenidas por SEM que muestran la arquitectura 3D de las arrugas de colonias biopelícula o la organización única morfología celular / EPS. Las barras de escala de izquierda a derecha: 5 mm., 100 m, 2 micras <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.925 mM </td><td> macetafosfato monobásico assium </td></tr><tr><td> 3.075 mM </td><td> fosfato dibásico de potasio </td></tr><tr><td> 100 mM </td><td> 3- (morfolino N) propanosulfónico, pH 7,1 </td></tr><tr><td> 2 mM </td><td> cloruro de magnesio hexahidratado </td></tr><tr><td> 700 M </td><td> cloruro de calcio anhidro </td></tr><tr><td> 50 M una </td><td rowspan="2"> de hierro (III) hexahidrato de cloruro de </td></tr><tr><td> 125 M b </td></tr><tr><td> 1 M </td><td> cloruro de zinc anhidro </td></tr><tr><td> 2 micras </td><td> clorhidrato de tiamina </td></tr><tr><td> 50 mg / ml </td><td> triptófano </td></tr><tr><td> 50 mg / ml </td><td> fenilalanina </td></tr><tr><td> 50 mg / ml </td><td> treonina </td></tr><tr><td> 0,5% (v / v) </td><td> glicerol anhidro </td&gt; </tr><tr><td> 0.5% (w / v) </td><td> sales monosódica del ácido L-glutámico hidrato </td></tr><tr><td colspan="2"> una para el ensayo de película; b para el ensayo de biopelícula </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Composición final 1x MSgg utilizado en este estudio.

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Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologías para el estudio<em&gt; B. subtilis</em&gt; Las biopelículas como modelo para la caracterización de Pequeño Biofilm inhibidores de moléculas

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

methodologies-for-studying-b-subtilis-biofilms-as-model-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

15.0K vistas.  Weizmann Institute of Science. This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

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Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modelo murino de CD40-activación de las células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Investigación

Inmunología e Infección

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

En la formación de biofilm in vitro en una diapositiva Cámara de 8 pocillos

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Utilización del modelo de EpiAirway para la caracterización de largo plazo Interacciones Huésped-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Sola célula de análisis de Bacillus subtilis Las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Queratitis herpética estromal recurrente en ratones, un modelo para el estudio HSK Humanos

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

La infección experimental con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como un modelo para el estudio de host Respuestas interferón gamma

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonización vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...