Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.

No conflicts of interest to disclose.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, wie eine grundlegende experimentelle Infektion durchzuführen mit der EGD Stamm von L. monocytogenes 25 bei männlichen oder weiblichen C57BL / 6J - Mäuse. Dieses Protokoll wurde für die Zwecke der Untersuchung der Wirkung eines neuartigen niedermolekularen IS001 auf IFN-γ Produktion von angeborenen und adaptiven Lymphozyten in vivo 31 eingerichtet. Bakterien-Clearance und das Überleben nach der Infektion Durch die Überwachung wurden Erkenntnisse gewonnen, wie sich diese Veränderungen in der IFN-γ die Host-Fähigkeit beeinflusst, die Infektion zu kontrollieren. Kritische Überlegungen im Protokoll Eine wichtige Überlegung bei der Konstruktion dieser Art von Studie ist, dass jedes Experiment angemessen angetrieben sein und in geeigneter Weise gesteuert. Durch biologische Veränderung der Immunantwort auf eine Infektion (siehe 4 und 6), wird empfohlen , dass N = 4 - 5 Mäuse pro Gruppe für die ersten Immununtersuchungen verwendet werden sollte. Wenn einfter diese Studien gibt es einen Trend in den Daten, aber keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen ersichtlich, könnte eine Leistungsberechnung durchgeführt werden, um die geringste Anzahl von Tieren in nachfolgenden Studien erforderlich, um zu bestimmen statistische Signifikanz zu erreichen. In Bezug auf Kontrollen, ist es wichtig, nicht infizierten Kontrollen zur Bestimmung der Baseline-IFN-γ-Antworten für Immun Studien und Fahrzeug umfassen steuert die Wirkung der Behandlung von Stress bei Verabreichung der Behandlung verbunden sind, um zu unterscheiden. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist der Zeitpunkt der Behandlung. Da der angeboren Antwort auf L. monocytogenes sehr schnell ist, wird empfohlen , dass die erste Behandlung am Tag verabreicht werden , vor oder zur gleichen Zeit wie der Inokulation , damit therapeutische Mengen des Reagens sicherzustellen dem Stand erreicht werden Initiierung der angeborenen Immunantwort. Noch ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Dosis des Erregers für infectio verwendet werdenn. Eine subletalen Dosis wird für die Messung der Bakterienbelastung zu empfehlen, da es die Chance erhöht, dass der Erreger wird in der Milz und Leber konzentriert werden, so dass für die genauere Zählung der Bakterien. Einer subletalen Dosis ist auch für Aufzählen IFN-γ-Antworten von Lymphozyten adaptive empfohlen, um sicherzustellen, dass die Tiere unterliegen nicht vor dem Zeitpunkt der maximalen T-Zell-Expansion Listeriose. Im Gegensatz dazu wird es empfohlen, daß eine höhere Infektionsdosis zur Messung der frühen NK und NKT-Zell-Antwort bei 24 Stunden, um die IFN-γ Produktion durch diese Zellen zu maximieren, verwendet werden. Die klassische LD 50 ist die Dosis des Erregers , die in 50% Letalität von Mäusen führt. Da der Tod an unserer Hochschule keine akzeptable Endpunkt war und da viele Symptome der Listeriose kann vorhersagen, ob ein Tier wahrscheinlich zu einer Infektion zu erliegen ist, haben wir eine definierte Liste von klinischen Zeichen anstelle von Tod als Endpunkt in unseren Studien. Using dieses Verfahren wurde festgestellt , dass das modifizierte LD 50 10 5 CFU für 8 Wochen alten männlichen und 1,5 x 10 5 CFU für 8 Wochen alte weibliche 31 C57BL / 6J - Mäusen war. Diese LD 50 Dosen durch Messung der prozentualen Überlebenszeit von Mäusen zu Endpunkten in stufenweisen Dosiseskalationsstudien ermittelt wurden (N = 5 Studien insgesamt) , die jeweils enthaltenen N = 8 Mäuse pro Gruppe (zB Mäuse wurden infiziert zunächst mit 10.000 CFU , dann eine zweite Charge mit 20.000 CFU, etc.). Userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit: die LD 50 Berechnung wurde aus einer Regressions Auftragung des log (CFU) (x-Achse) gegen die Probit der prozentualen Überlebens - Werte (y-Achse) (Internet bestimmt /ProbitAnalysis.pdf). Beachten Sie, dass die modifizierte LD 50 -Dosis bestimmt in unserem Labor aus , dass auch in einem anderen Labor unterschiedlich sein können , wenn Mäuse mit dem gleichen Stamm von L. monocytogenes infiziert. Ein Teil dieser Variabilität können sich auf die subjektive Natur of Überwachung klinischer Symptome der Listeriose im Vergleich zu den mehr absolute Endpunkt des Todes. Zusätzliche Variabilität kann aus Unterschieden in Umweltfaktoren, wie Ernährung der Maus oder der Mikrobioten oder Unterschiede in der Herstellung von Inokulum zwischen labs führen. Daher wird empfohlen, bevor sie auf irgendwelchen Überlebensstudien zu einsteigen, eine Pilotstudie durchgeführt werden , in denen weibliche Mäuse (N = 8 Mäuse / Gruppe) mit 1,5 × 10 5 CFU des gleichen Stammes von L. monocytogenes in diesem verwendete infiziert sind studieren und Symptome überwacht, um festzustellen, ob diese Dosis tatsächlich in 50% Überleben Endpunkte führt. Wenn das Überleben in dieser CFU niedriger oder höher als 50% ist, schrittweise Dosissteigerung oder Dosis Deeskalation Studien konnten schnell durchgeführt werden , auf der LD 50 -Dosis zu verengen in. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist der Stamm oder Unterstamm von Mäusen für Infektionsstudien verwendet. Dieses Protokoll beschreibt Infektion der allgemein verwendeten Inzuchtmausstamm C57BL / 6J. Dies<html> Stamm ist gut geeignet für die Messung des IFN-γ - Antworten , da diese Maus eine Th1 neigende Stamm 33 zu sein , und als Ergebnis betrachtet wird, ist relativ widerstandsfähig gegen L. monocytogenes - Infektion ( im Vergleich zu Th2 neigende Mausstämme wie BALB / c) 34,35. dieses Protokoll auf andere Mausstämme Anpassung wird die Kenntnis der infektiösen Dosis des Erregers für die besonderen Belastungen erfordern. Es wird auch die Menge der Fehlersuche in diesem Protokoll zu verwenden, um Mäuse im gleichen Alter, Geschlecht und Anbieter wie skizziert empfohlen bei der Einrichtung des Modells beteiligt zu reduzieren. So bestellte C57BL / 6 - Mäuse von einem Anbieter (zB C57BL / 6J) genetische Unterschiede als C67BL / 6 - Mäuse zeigen kann von einem anderen Anbieter bestellt (zB C57BL / 6NTac) 36. Darüber hinaus unterscheidet sich die Darmflora zwischen C57BL / 6 Subkulturen von verschiedenen Anbietern erhalten, die das Gleichgewicht der Th1 und Th17 - Antworten in der Maus 37 beeinflussen können. ove_title &quot;&gt; Mögliche Änderungen an Technik Mäuse werden am häufigsten ip inokuliert oder intravenös über den natürlichen Weg der Infektion beim Menschen gegenüber, die durch den Gastrointestinaltrakt ist. Orale Infektionen sind weniger häufig , weil Standard - Stämme von L. monocytogenes ineffizienten das Darmepithel der Mäuse 38 infizieren. Dies ist , weil es eine einzige Aminosäureaustausch in der Sequenz der Maus E-Cadherin aus humanen E-Cadherin ist, die durch die Invasion listeriellen Protein in Verlust der Erkennung von E-cadherin - Ergebnisse Internalinfamilie A (INIA) 39. Um diese Barriere zu überwinden, nutzen die Forscher Mäuse , die für die menschliche Protein E-Cadherin transgen sind oder Listeria verwenden , die entwickelt wurden , um eine mutierte Sequenz von Inia (Inia mut) zum Ausdruck bringen , dass E-Cadherin mit der gleichen Affinität wie WT EGD Maus bindet für humanen E-Cadherin - 40. Somit ist eine mögliche Modifikation dieser Technik Mäusen auf oralem Wege infizieren. Der Leser wird auf eine andere JoVE Veröffentlichung bezeichnet , die orale Impfung Methoden 38 beschreibt. Beachten Sie, dass die Art der Infektion verändert die infektiöse Dosis sowie die Kinetik der Verbreitung des Erregers beeinflussen. Dieses Protokoll beschreibt Hitze abgetöteten Listeria Verwendung zur IFN-γ - Produktion durch CD4 + und CD8 + T - Zellen hervorzurufen. Durch Hitze getötete L. monocytogenes wurde als Anregung in unseren Studien gewählt, weil dieses Antigen billig ist und weil unser Labor war in erster Linie interessiert an CD4 + T - Zell - Reaktionen gegen den Erreger. Eine Einschränkung besteht darin , dass durch Hitze abgetötete Bakterien nicht effizient prime CD8 + T - Zell - Antworten entweder in vitro oder in vivo 41 42,43 Infektion. Somit kann die CD8 + T - Zell - IFN-γ Produktion , die wir von Splenocyten beobachtet auf dem Höhepunkt der Infektion geerntet (dh 6) wahrscheinlich als Reaktion auf die Restlebenden Bakterien , die in den Splenozyten Kulturen oder wurde als Folge der Zytokin-induzierte Zytokinfreisetzung 41 ausgelöst. Als Alternative abgetöteten Wärme Listeria, könnte man auch IFN-γ - Antworten ex vivo auslösen durch T - Zellen auf Peptide Belichten Epitope auf listeriellen Proteine kodieren. Tatsächlich immunodominant MHC Klasse II-restringierten Epitopen für Listeriolysin O und dem p60 - Hydrolase und haben für C57BL / 6 und BALB / C - Mäuse und immunodominant MHC Klasse I - Epitope wurden beschrieben für BALB / c 44 beschrieben. Noch ein weiterer Ansatz ist , Mäuse mit Stämmen von L. monocytogenes zu infizieren , die konstruiert wurden , Modell - Antigene wie Ovalbumin oder virale Antigene , um die Vorteile der bestehenden MHC Klasse I- und MHC Klasse II-Tetramer - Reagenzien zu exprimieren antigenspezifischen aufzuzählen T - Zellen in infizierten Mäusen 45,46. Weitere Einschränkungen des Protokolls Eine weitere Einschränkung dieses Modells ist, dass es only Maßnahmen IFN-γ-Produktion durch Immunzellen in der Milz. Neben der Verwendung von Tetrameren Antigen - spezifischen T - Zellen (von Ovalbumin-exprimierenden Varianten von L. monocytogenes), Durchflusszytometrie Anfärbung Platten beschrieben Hier kann leicht modifiziert zur Messung der Produktion von anderen Cytokinen, wie TNF oder IL-2 oder aufzuzählen Effektor-Moleküle, die in CD8 T-Zellen oder NK-vermittelte Abtötung des Erregers wie Perforin Granzym oder B. Zusätzlich teilnehmen könnte dieses Protokoll auch durch Immunzellen in der Leber zu untersuchen, IFN-γ angepasst werden. Zukünftige Anwendungen Sobald dieses Protokoll beherrscht wird, kann es als ein einfaches In - vivo - Modell dienen die Effekte verschiedener Wirkstoffe oder Gene auf Th1 und zelluläre Immunität zu screenen.

IFN-γ ist ein Zytokin , das für die Vermittlung von Immunität gegen intrazelluläre Pathogene und zur Steuerung des Tumorwachstums 5 entscheidend. Die Bedeutung dieses Zytokin in bakteriellen Resistenz ist in der Beobachtung offensichtlich , die mit Mutationen in der IFN-γ - Signalweg sind sehr anfällig für eine Infektion mit Mykobakterien und Salmonellen 6 Menschen. In ähnlicher Weise defizienten Mäusen entweder IFN-γ oder die IFN-γ - Rezeptor zeigen Defekte im Widerstand gegen Mykobakterien 7-9 und andere intrazelluläre Pathogene einschließlich L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, S. typhimurium 13 und bestimmte Viren 11. Neben der Bekämpfung von Krankheitserregern, IFN-γ spielt eine entscheidende Rolle bei der Wirtsverteidigung gegen Tumoren 14. Obwohl höhere Produktion von IFN-γ im Rahmen einer Infektion oder Krebs nützlich ist, verlängerte Produktion dieses Zytokins wurde t verknüpfto der Entwicklung von systemischer Autoimmunität 15-17 und der Beschleunigung von Diabetes Typ I in dem nicht-fettleibigen diabetischen Maus - Modell 18. Die Hauptquellen von IFN-γ sind : NK - Zellen, NKT - Zellen, γδ - T - Zellen, T - Helfer 1 (Th1) -Zellen, und zytotoxischen T - Lymphozyten (CTL) 5,19,20. IFN-γ erhöht sowohl angeborenen und erworbenen Immunität durch: (1) Hochregulieren Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I und II-Expression, (2) die Expression von co-stimulatorischen Molekülen auf Antigen-präsentierenden Zellen zu erhöhen, (3) Verbesserung der Makrophagen Phagozytose und die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen und mikrobizide Faktoren (beispielsweise Stickstoffmonoxid und reaktive Sauerstoffspezies), (4) die Förderung der Differenzierung von naiven CD4 + T - Zellen in Th1 - Effektorzellen, (5) Förderung der Antikörperklasse Umschaltung auf Immunglobulin ( Ig) 2a und IgG3 (in der Maus), (6) Induzierung der Produktion von Chemokinen Immunzellen-Stellen von i zu rekrutierennfection und (7) Verbesserung der NK - Zellen und CTL - Antworten 5,19. Aufgrund der entscheidenden Bedeutung der IFN-γ in der Wirtsantwort auf Pathogene und Tumore, rekombinantes IFN-γ wurde als Behandlung für verschiedene Infektionen und Malignitäten (in 19 überprüft) getestet. Da jedoch die systemische Verabreichung von IFN-γ oder Th1 Zytokin Förderung Interleukin-12 (IL-12) mit Nebenwirkungen verbunden ist und dosisabhängige Toxizität 19,21 besteht ein Interesse alternative Strategien bei der Entwicklung von IFN-γ - Produktion zu erhöhen , indem Immunzellen. Entwicklung neuer Biologika und kleinen Molekülen erfordert in vivo Screening - Tools zu testen , ob solche Mittel während einer Immunantwort IFN-γ Produktion zu erhöhen , und ob dies in einer sinnvollen biologischen Wirkungen wie Erhöhung der das Überleben der Tiere. Experimentelle Infektion von Mäusen mit dem grampositiven Bakterium L. monocytogenes ist ein Instrumental - Modell seitEntschlüsselung der Rolle von IFN-γ in Wirtsimmunität gegen intrazelluläre Erreger 1,22. Infektion von Mäusen mit dem Pathogen intravenös oder intraperitoneal (ip) führt zur schnellen Verbreitung der Bakterien an der Milz und der Leber, wo sie von Makrophagen und Hepatozyten mit peak bakterielle Belastungen in der Milz internalisiert zwischen 3 und 4 Tage auftretenden post- Infektion 1,3,22. Produktion von IFN-γ durch NK - Zellen ist wichtig für die Makrophagenaktivierung und frühen Widerstand gegen den Erreger 3; jedoch bei hohen Infektionsdosen, die Produktion von IFN-γ kann auch auf Erreger - Clearance 23 schädlich sein. NKT - Zellen sind auch eine Quelle von IFN-γ in der Milz und Leber während der frühen Kontrolle von Pathogenen 2,24 und diese Produktion wurde 2 gezeigt , IFN-γ - Produktion durch andere Zelltypen , einschließlich NK - Zellen verstärken. Auf der anderen Seite, die später wirkenden adaptive T - Lymphozyten, CD8 + T - Zellen in partidere sind wichtig für das Spiel des Erregers zu vermitteln und den Schutz gegen eine erneute Infektion 1,4,22 bereitstellt. Diese Infektionsmodell wurde für eine Reihe von Gründen für Forscher attraktiv war ( beschrieben in 1). Erstens, eine Infektion mit dem Pathogen ist in hohem Maße reproduzierbar und induziert eine starke Th1 und zellulären Immunantwort. Zweitens, während subletalen Infektion wird bakterielle Belastung in der Leber und der Milz konzentriert, wo es kann leicht gemessen werden. Drittens kann der Erreger sicher unter Biosafety Level 2 (BSL2) Bedingungen behandelt werden. Viertens der Organismus und die Immunantwort, dass es weitgehend charakterisiert worden erzeugt. Schließlich wurde eine Vielzahl von Mutanten und genetisch veränderte Stämme entwickelt, die für die Verwendung zur Verfügung stehen. Beschrieben ist hier ein Basisprotokoll für die Impfung von C57BL / 6J - Mäuse mit dem EGD Stamm von L. monocytogenes und 25 für IFN Messung - γ reAntworten von NK, NKT und adaptive Lymphozyten nach der Infektion. Beschrieben ist , wie bakterielle Belastung in der Milz und Leber nach subletalen Infektion zu messen , und die Überlebensstudien nach der Infektion durchgeführt werden mit einer modifizierten LD 50 -Dosis des Pathogens. Schließlich werden repräsentative Daten gezeigt, wie kann dieses Protokoll verwendet werden , um die Wirkung neuer Therapien auf IFN-γ - Antworten und das Überleben der Mäuse zum Screening von L. monocytogenes Infektion.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="923">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Brain Heart Infusion Broth, Modified</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">299070</td>
			<td style="width:273px;">any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:107px;">214010</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">X100</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1xPBS</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">D8537</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TissueLyser II</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:107px;">85300</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ammonium Chloride (NH3Cl)</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">KHCO3</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">22400089</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">12483</td>
			<td>Before use, heat-inactivate at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25030</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Non-essential amino acids</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">11140</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">554724</td>
			<td>Use 4 &#956;l in 6 ml cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">16% Paraformaledehye</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:353px;">10 x Perm/Wash buffer</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">554723</td>
			<td>Dilute 10x in ddH20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">14-0161</td>
			<td>Dilute 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">65-0866</td>
			<td>Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">15-0041</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">11-0081</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PBS57/mCD1d tetramer-APC</td>
			<td style="width:191px;">NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td>Obtained as a gift from the facility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Mouse TCR&#946;-PE-Cy7 (H56-597)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">25-5961</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">47-3351</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">25-0451</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">12-7311</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">OneComp eBeads</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">01-1111</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Mouse IFN gamma ELISA kit</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td>88-7314</td>
			<td>Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50 mL vented tubes for culture</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">bacterial petri dishes</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">2 ml cyrovials</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">UV spectrometer</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">safety engineered needles</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">C57BL6/J</td>
			<td style="width:191px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:107px;">Stock#000664</td>
			<td>Order for arrival at 7 wks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Bleach</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>For decontamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>For decontamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Glass beads</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>rotor, buckets, bucket covers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Sterile Glycerol</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Pipette Tips</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Pipette</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">70 micron strainers</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">3 ml syringe</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Pipette gun</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Filtration Units</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Round bottomed plates</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">FACs tubes</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">BD LSR II</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Flowjo software</td>
			<td style="width:191px;">Treestar</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Multichannel pipettor (0-300 &#181;l)</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for washing glass beads, any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Microbank Bacterial Preservation System</td>
			<td style="width:191px;">Pro-lab Diagnositics</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental infection with listeria monocytogenes as a model for studying host interferon-&#947; responses

L. monocytogenes ist ein gram-positive Bakterien , die eine Ursache der durch Lebensmittel übertragenen Krankheiten beim Menschen ist. Experimentelle Infektion von Mäusen mit diesem Erreger hat sich auf die Rolle der angeborenen und adaptiven Immunzellen und spezifische Zytokine in Wirtsimmunität gegen intrazelluläre Erreger sehr informativ gewesen. Produktion von IFN-γ durch angeborene Zellen während der Infektion mit subletalen L. monocytogenes ist wichtig für Makrophagen und frühe Kontrolle des Krankheitserregers 1-3 aktiviert. Zusätzlich kann durch adaptive Speicher Lymphozyten IFN-γ - Produktion ist wichtig zur Grundierung , die Aktivierung von angeborenen Zellen nach Reinfektion 4. Die L. monocytogenes - Infektionsmodell dient somit als großes Werkzeug für die Untersuchung , ob neue Therapien , die IFN-γ Produktion haben einen Einfluss auf die IFN-γ - Antworten in vivo und haben produktive biologische Effekte wie die Erhöhung der bakteriellen Clearance oder die Verbesserung der das Überleben der Mäuse zu erhöhen sind so konzipiert, vonInfektion. Beschrieben ist hier ein Basisprotokoll für den Umgang mit der EGD Stamm von L. monocytogenes intraperitoneale Infektionen von C57BL / 6J - Mäusen zu führen und IFN-γ - Produktion durch NK - Zellen, NKT - Zellen und adaptive Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie zu messen. Außerdem werden Verfahren beschrieben: (1) wachsen, und die Bakterien zur Inokulation herzustellen, (2) Messung der Keimbelastung in der Milz und in der Leber, und (3) das Überleben der Tiere zu messen Endpunkten. Repräsentative Daten sind vorgesehen , um auch veranschaulichen , wie dieses Infektionsmodell verwendet werden kann , um die Wirkung von spezifischen Mitteln auf IFN-γ Reaktionen auf L. monocytogenes und das Überleben der Mäuse aus dieser Infektion zu testen.

Abbildung 3 zeigt eine typische Durchflusszytometrie Färbung von IFN-γ in Milz- NK und NKT - Zellen bei 24 Stunden nach der Infektion mit 10 5 CFU des Erregers. Diese Figur zeigt auch die Gating - Strategie für die Färbung Tafel in Tabelle 2 beschrieben. Figur 4 zeigt einige repräsentative Daten , die in einem Experiment erhalten wurden , in denen männliche Mäuse mit dem PPAR &amp; agr; Antagonist IS001 oder Vehikelkontrolle behandelt wurden, infiziert mit 10 5 CFU L. monocytogenes und dann für IFN-γ in NK und NKT - Zellen nach 24 h analysiert . Diese Figur zeigt, dass die Behandlung mit IS001 verstärkte IFN-γ-Antworten von NKT-Zellen, aber nicht NK-Zellen nach Infektion mit dem Erreger. Figur 5 zeigt repräsentative Färbung für IFN-γ in der Milz CD4 + und CD8 + T - Zellen nach 7 Tagen nach der Infektion nach einer erneuten Stimulation ex vivo mit durch Hitze abgetöteten pathogen. Diese Figur zeigt auch die Gating - Strategie für die Anfärbung Tafel in Tabelle 3 beschrieben. 6 zeigt repräsentative Daten , die in einem Experiment erhalten wurden , in denen männliche Mäuse täglich behandelt wurden mit dem PPAR &amp; agr; Antagonist IS001 oder Fahrzeugsteuerung, mit einer subletalen Dosis von L. monocytogenes infiziert und analysiert bei 7 Tage nach der Infektion. Dieses Experiment zeigt , dass die Behandlung mit IS001 verbesserten IFN-γ - Antworten sowohl von CD4 + und CD8 + Lymphozyten. Abbildung 7 zeigt repräsentative Daten aus einer Studie, die die Wirkung des PPAR &amp; agr; Antagonist IS001 auf das Überleben der Mäuse zu Endpunkte nach der Infektion mit dem modifizierten LD 50 -Dosis des Pathogens untersucht. Aufgetragen ist die prozentuale Überleben von Mäusen gegen die Zeit nach der Infektion. Diese Abbildung zeigt, dass die Behandlung mit IS001 das Überleben der männlichen Mäuse Endpunkte erhöht. Zusammen stellen diese Daten veranschaulichen, wie dieses Modell angewendet werden kann, zu untersuchen,die Auswirkungen neuer Medikamente oder Behandlungen auf IFN-γ - Antworten in vivo und zu untersuchen , wie diese Immun Veränderungen das Überleben der Tiere vor einer Infektion auswirken. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Milzen von infizierten Mäusen Sezieren. Diese Reihe von Fotos zeigt, wie die Milz von einer toten Maus zu sezieren. (a) Legen Sie die Maus auf der rechten Seite und sprühen Sie die Haut mit 70% Ethanol. (b) Verwendung von aseptischen oder sterilen Pinzette und zäh-schneiden Schere, einzuschneiden die Haut direkt unter der Unterseite des Brustkorbs. (c) Sprühen Sie die freiliegenden Muskelschicht mit 70% Ethanol nach unten. Die Milz sollte unterhalb der Muskelschicht (offenen Pfeil) sichtbar sein. (d) Verwendung von aseptischen oder sterilen Pinzette und einer feinen Schere, einzuschneiden die Muskelschicht der Milz zu offenbaren. (e) greifen Sie vorsichtig die Milz mit der Zange und use einer feinen Schere die Milz entfernt zu schneiden das Bindegewebe aus umgibt. (f) Legen Sie die Milz in einem 15 ml konischen Röhrchen mit steriler 1x PBS. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig2.jpg" /> Abbildung 2. Zählen Splenocyten eine Zählkammer. (a) zeigt das zentrale Netz des Hämozytometer. (b) zeigt eine vergrößerte Ansicht des zentralen Gitter , das 25 große Quadrate enthält (die jeweils 16 kleinere Quadrate enthalten). Die fünf großen Plätzen zum Zählen verwendet werden grau (4 Eckquadrate plus der Mitte Platz im zentralen Netz) hervorgehoben. (c) zeigt eine vergrößerte Ansicht eines der großen grauen Quadrate. Zur Bestimmung der Zellvolumen in 10 6 / ml, erste Zählungalle lebenden Zellen innerhalb der fünf großen grauen Quadrate. In dem gezeigten Beispiel ist diese Zählung 215. Bei der Zählung, stellen Sie sicher, dass alle den klaren (nicht blau) Zellen nur zählen, einschließlich derjenigen, die die Doppellinien auf der rechten und unteren Rand des Gitters zu berühren. Sie nicht die Zellen zählen die doppelten Linien auf der linken und oberen Rand des Gitters zu berühren. Nehmen Sie die insgesamt fünf Quadratzahl und teilen sie durch 10 die Anzahl der Zellen in 10 6 / ml zu erhalten. Im Beispiel durch 10 geteilt 215 ist 21,5 x 10 6 Zellen / ml. Beachten Sie, dass nur diese Berechnungen arbeiten, wenn Sie 5 der großen Plätzen zählen als hervorgehoben und verdünnen Sie Ihre Zellen 1: 1 in Trypanblau. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig3.jpg" /> Abbildung 3. Gating - Strategie zum Nachweis von IFN-γ Produktion in NK und NKT-Zellen. Erste Tor auf Lymphozyten auf FSC-A von SSC-A-Plot. Dann Tor auf jene Ereignisse, die auf dem FSC-H / FSC-A Plot auf der Diagonalen sind. Dies sind die Singuletts. Dann Tor auf Live (AmCyan -) und CD8 - Zellen. Dann zeichnen Sie die Tetramerfärbung gegen TCR &amp; bgr;. Die NKT-Zellen sind innerhalb der doppelt positiven Bevölkerung und die NK-Zellen sind innerhalb der doppelten negativen Bevölkerung. Tor auf der doppelt positiven Zellen und Plot NKp46 gegen FSC. Tor auf der NKp46 negativen Bevölkerung, die die NKT-Zellen sind (dieses Tor kann von der Suche nach dem Punkt der Teilung in den beiden Populationen aus der NK-Zell-Plot eingestellt werden). Die NK - Zellen sind die Tetramer - TCR &amp; bgr; - NKp46 + Bevölkerung. Innerhalb von NK und NKT - Zell - Tore, die IFN-γ + Zellen in der PE - Kanal werden nach dem Setzen eines Tor auf der FMO Steuerung basiert identifiziert. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig3large.jpg" target="_blank">bitte klicken</a>hier, um eine größere Version dieser Figur sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig4.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentative Daten , die für die Frequenzen von IFN-γ + NK und NKT - Zellen bei 24 Stunden nach der Infektion. In diesem Experiment wurden männliche C57BL / 6J - Mäusen (N = 3 - 4 / Gruppe) wurden infizierte ip mit 10 5 CFU von L. monocytogenes oder wurden un-infizierten verlassen. Mäuse wurden auch die Droge IS001 oder Vehikel (0,5% Carboxymethylcellulose) gleichzeitig Zeitpunkt der Inokulation und 12 Stunden später verabreicht. Vierundzwanzig Stunden nach der Beimpfung wurden die Mäuse getötet und die Milzen wurden entfernt und wurden einzeln und gefärbt für die Durchflusszytometrie verarbeitet. Gezeigt sind die Mittelwerte ± SEM Häufigkeit von IFN-γ + -Zellen in der NK sind (a) oder NKT - Zelle - Gattern (b) in nicht - infizierten oder infizierten Mäusen nach der Behandlung mit einem Fahrzeug oder dem Medikament IS001. *Zeigensa Unterschied (p &lt;0,05) von Fahrzeugkontrolle durch zweiseitigen T-Test. Die Daten werden neu gedruckt von 31 mit freundlicher Genehmigung aus dem Journal of Immunology (Band 195, S.. 5189-5202, 2015). Copyright 2015 der American Association of Immunologen, Inc. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig5.jpg" /> Abbildung 5. Gating - Strategie zum Nachweis von IFN-γ Produktion in CD4 und CD8 - Zellen. Erste Tor auf Lymphozyten auf FSC-A von SSC-A Plots. Dann Tor auf jene Ereignisse, die auf dem FSC-H / FSC-A Plot auf der Diagonalen sind. Dies sind die Singuletts. Innerhalb dieses Tor, Tor auf Live (AmCyan -) CD45 + Zellen. Dann Tor auf entweder CD8 + oder CD4 + Populationen. Innerhalb jedes Tor, das IFN-γ +Zellen in dem PE-Kanal werden durch Vergleich der Färbung der FMO Steuerung identifiziert. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig6.jpg" /> Abbildung 6. Repräsentative Daten , die für die Frequenzen von IFN-γ + CD4 + und CD8 + T - Zellen bei 7 Tage nach Infektion mit L. monocytogenes (EGD - Stamm). In diesem Experiment wurden männliche C57BL / 6J - Mäuse infiziert ip mit 2 x 10 &amp; sup4 ; CFU L. monocytogenes (n = 7 / Gruppe) wurden nicht - infizierte oder links (N = 3 / Gruppe). Mäuse wurden auch die Droge IS001 oder Vehikel (0,5% Carboxymethylcellulose) zweimal täglich ab dem Tag der Impfung verabreicht. Sieben Tage später wurden die Mäuse getötet und die Milzen wurden entfernt und wurden einzeln verarbeitet, umZellkultur. Splenozyten mononukleären Zellen wurden für 24 h mit durch Hitze abgetöteten L. monocytogenes mit den Proteintransport stimuliert Inhibitor für die endgültige 4 Stunden der Kultur zugegeben. Die Zellen wurden dann für die Durchflusszytometrie gefärbt. Gezeigt sind die Mittelwerte ± SEM Häufigkeit von IFN-γ + -Zellen in den CD4 + (a) oder CD8 + Zelle Gatter sind (b) in nicht - infizierten oder infizierten Mäusen nach der Behandlung mit einem Vehikel (0,5% Carboxymethylcellulose) oder das Medikament IS001. * Zeigt einen Unterschied (P &lt;0,05) von dem Fahrzeugsteuergegenstück, wie durch zweiseitigen T-Test bestimmt. Die Daten werden neu gedruckt von 31 mit freundlicher Genehmigung aus dem Journal of Immunology (Band 195, S.. 5189-5202, 2015) .Copyright 2015 der American Association of Immunologen, Inc. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 7. Repräsentative Daten während eines Experiments erreicht , dass die Wirkung eines PPARalpha - Antagonist 1S001 auf das Überleben der Mäuse zu Endpoints nach der Infektion der männlichen C57BL / 6J - Mäuse , die mit L. monocytogenes (EGD - Stamm) verglichen. In diesem Experiment wurden männliche C57BL / 6J - Mäuse (N = 10 Mäuse / Gruppe) wurden ip infizierte mit dem modifizierten LD 50 -Dosis des Erregers (10 5 CFU) von L. monocytogenes. Mäuse wurden auch die Droge IS001 oder Vehikel (0,5% Carboxymethylcellulose) zweimal täglich ab dem Tag der Impfung verabreicht. Die Mäuse wurden anschließend täglich auf klinische Anzeichen und wurden eingeschläfert, wenn humane Endpunkte erreicht wurden. Dargestellt ist die prozentuale Überleben von Mäusen zu Endpunkten über die Zeit anzeigt, * einen Unterschied in der Überlebenszeit zwischen den Gruppen bestimmt, wie von Log-Rank-Test (P &lt;0,05). Die Daten werden neu gedruckt von 31 mit freundlicher Genehmigung der Zeitschrift of Immunologie (Volumen 195, S.. 5189-5202, 2015). Copyright 2015 der American Association of Immunologen, Inc. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig7large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54554/54554table1.jpg" /> Tabelle 1: Zeigt einige repräsentative Berechnungen zur Bestimmung der CFU in einem aliquoten Teil des Tages Kultur. In diesem Beispiel wurde ein Aliquot der Kultur entnommen und Tag wurde 1: 1 mit BHI-Medien. Die OD 600 dieser verdünnten Probe wurde bestimmt 0,84 sein. Außerdem wurde ein 100 ul Aliquot für CFU Bestimmung entnommen. Diese Probe wurde mit 900 &amp; mgr; l BHI - Medien (10 -1) verdünnt und in 1 ml BHI gewaschen und resuspendiert. Eine 10-fache Verdünnungsreihe dieser Probe wurde hergestellt (10 -2 bis 10 -9) und verdünnten Proben wurden auf BHI aga plattiertr Platten (nur Werte für 10 -4 bis 10 -9 gezeigt sind). Am nächsten Tag wurden Kolonien gezählt. Nur jene Platten , die Koloniezahlen zwischen 30-300 hatten , wurden für die Berechnung nicht berücksichtigt (dh 10 -6 Platte, gelb markiert). Die Anzahl der Kolonien, die auf dieser Platte (70) wurde dann von 0,1 (Volumen in ml plattiert) geteilt, um die CFU / ml der verdünnten Probe zu erhalten. Dieser Wert wurde dann mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert (10 6) , um die CFU / ml Lesen der unverdünnte Kultur zu erhalten. TMTC = zu viele zu zählen. <img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/54554/54554table2.jpg" /> Tabelle 2: Die Färbung Feld zum Nachweis von IFN - γ in NK und NKT - Zellen. Beachten Sie, dass entweder Kompensations Perlen gefärbt mit den Strömungs verwendeten Antikörper in der Platte oder Splenozyten gefärbt mit verschiedenen Fluorochrom Versionen von CD4-Antikörper Klon GK1.1 können als einzelne positive Kontrollen verwendet werden. <img alt="Tabelle 3" src="/files/ftp_upload/54554/54554table3.jpg" /> Tabelle 3: Anfärben - Panel zum Nachweis von IFN - γ in CD4 + und CD8 + Zellen. Beachten Sie, dass entweder Kompensations Perlen gefärbt mit den Strömungs verwendeten Antikörper in der Platte oder Splenozyten gefärbt mit verschiedenen Fluorochrom Versionen von CD4-Antikörper Klon GK1.1 können als einzelne positive Kontrollen verwendet werden.

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Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Dieses Protokoll beschreibt , wie C57BL / 6J - Mäuse mit dem Stamm EGD von Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) und zur Messung der Interferon-γ (IFN-γ) Antworten , die durch natürliche Killer (NK) Zellen, natürliche Killer - T (NKT) -Zellen zu inokulieren, und adaptive T-Lymphozyten nach der Infektion. Dieses Protokoll beschreibt auch , wie Überlebensstudien bei Mäusen mit einer modifizierten LD 50 Dosis des Erregers nach der Infektion zu führen.

Experimentelle Infektion mit<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als Modell für die Untersuchung Host-Interferon-γ Antworten

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

experimental-infection-with-listeria-monocytogenes-as-model-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K Aufrufe.  University of Toronto.  Dieses Protokoll beschreibt , wie C57BL / 6J - Mäuse mit dem Stamm EGD von Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) und zur Messung der Interferon-γ (IFN-γ) Antworten , die durch natürliche Killer (NK) Zellen, natürliche Killer - T (NKT) -Zellen zu inokulieren, und adaptive T-Lymphozyten nach der Infektion. Dieses Protokoll beschreibt auch , wie Überlebensstudien bei Mäusen mit einer modifizierten LD 50 Dosis des Erregers nach der Infektion zu...

Serie: Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

Die<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Studieren Erreger und Wirt Beiträge zur Infectious Colitis

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the gastrointestinal phase of listeriosis due to the lack of a small animal model that closely mimics human disease. This paper describes a novel mouse model for oral transmission of L. monocytogenes. Using this model, mice fed L. monocytogenes-contaminated bread have a discrete phase of gastrointestinal infection, followed by varying degrees of systemic spread in susceptible (BALB/c/By/J) or resistant (C57BL/6) mouse strains. During the later stages of the infection, dissemination to the gall bladder and brain is observed. The food borne model of listeriosis is highly reproducible, does not require specialized skills, and can be used with a wide variety of bacterial isolates and laboratory mouse strains. As such, it is the ideal model to study both virulence strategies used by L. monocytogenes to promote intestinal colonization, as well as the host response to invasive food borne bacterial infection.

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

This paper describes a novel method for oral infection of mice using Listeria monocytogenes-contaminated food. The protocol can readily be adapted for use with other food borne bacterial pathogens.

Mündliche Übertragung von<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Mäusen über die Aufnahme von kontaminierten Speisen

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Die Verwendung von<em&gt; Galleria mellon</em&gt; Als Modellorganismus zum Studium<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA-Reinigung aus intrazellulär Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Makrophagenzellen

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Methodologien für das Studium<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.