Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.

No conflicts of interest to disclose.

Qui si descrive un protocollo di come effettuare una infezione sperimentale di base con il ceppo EGD di L. monocytogenes 25 in C57BL 6J maschi o femmine /. Questo protocollo è stato istituito con lo scopo di studiare l&#39;effetto di un romanzo piccola molecola IS001 sulla produzione di IFN-γ da parte dei linfociti innata e adattativa in vivo 31. Monitorando la clearance batterica e la sopravvivenza dopo l&#39;infezione, intuizioni sono state acquisite in modo questi cambiamenti nella IFN-γ influenzato la capacità del padrone di casa per controllare l&#39;infezione. Considerazioni critiche nel protocollo Una considerazione importante nella progettazione di questo tipo di studio è che ogni esperimento sia adeguatamente alimentato e controllata in modo appropriato. A causa di variazione biologica nella risposta immunitaria all&#39;infezione (vedi figure 4 e 6), si raccomanda che N = 4 - 5 topi per gruppo deve essere usato per gli studi immunitarie iniziali. Se unopo questi studi c&#39;è una tendenza nei dati, ma nessuna differenza significativa tra i gruppi apparente, un calcolo di potenza potrebbe essere fatto per determinare il minor numero di animali necessari in studi successivi per raggiungere la significatività statistica. Per quanto riguarda i controlli, è importante includere i controlli non infetti per la determinazione del valore basale risposte IFN-gamma per gli studi immunitarie e veicolo controllo per aiutare a distinguere l&#39;effetto del trattamento da parte lo stress associato con la somministrazione del trattamento. Un&#39;altra considerazione importante è la tempistica del trattamento. Poiché la risposta innata di L. monocytogenes è molto rapida, si raccomanda che il primo trattamento essere somministrato il giorno prima o contemporaneamente come, inoculazione per assicurare che i livelli terapeutici di reagente essere raggiunto prima l&#39;inizio della risposta immunitaria innata. Un&#39;altra considerazione importante è la dose del patogeno da utilizzare per infection. Una dose subletale è raccomandato per la misura della carica batterica, in quanto aumenta la probabilità che il patogeno sarà concentrata all&#39;interno milza e del fegato, consentendo l&#39;enumerazione più accurata dei batteri. Una dose subletale è consigliato anche per enumerare le risposte IFN-gamma da parte dei linfociti adattivi per garantire che gli animali non soccombere alla listeriosi prima del momento di espansione delle cellule T di picco. Al contrario, si raccomanda una dose più alta infettiva essere usato per misurare la risposta cellulare precoce NK e NKT a 24 ore al fine di massimizzare la produzione di IFN-γ da queste cellule. Il LD classica 50 è la dose di agente patogeno che provoca il 50% di mortalità dei topi. Dal momento che la morte non era un endpoint accettabile a nostro istituto e dal momento che molti sintomi di listeriosi possono predire se un animale rischia di soccombere ad una infezione, abbiamo utilizzato un elenco definito di segni clinici, invece della morte come un endpoint nei nostri studi. Using questo metodo, si è stabilito che il LD modificato 50 era 10 5 CFU per 8 settimane di età maschi e 1,5 x 10 5 CFU per 8 settimane di età femminile C57BL / 6J topi 31. Questi LD 50 dosi sono stati determinati misurando la percentuale di sopravvivenza di topi per endpoint in studi di dose-escalation graduale (N = 5 studi in totale) che contenevano N = 8 topi per gruppo (ad esempio, i topi sono stati infettati prima con 10.000 CFU , poi un secondo lotto di 20.000 CFU, ecc). Il calcolo DL 50 è stata determinata da un terreno regressione del log (CFU) (asse x) rispetto al probit dei valori percento sopravvivenza (asse y) (sito: userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit /ProbitAnalysis.pdf). Si noti che la modifica DL 50 dosi determinato nel nostro laboratorio può differire da quello in un altro laboratorio, anche quando infettare i topi con lo stesso ceppo di L. monocytogenes. Parte di questa variabilità può riguardare il soggettivo la natura of monitoraggio segni clinici di listeriosi rispetto al punto finale più assoluto di morte. variabilità aggiuntiva può derivare da differenze nei fattori ambientali come la dieta mouse o il microbiota o le differenze nella preparazione di inoculo tra i laboratori. Pertanto, si raccomanda che prima di intraprendere studi di sopravvivenza, uno studio pilota essere effettuato nel luogo topi femmina (N = 8 topi / gruppo) sono infettati da 1,5 x 10 5 CFU dello stesso ceppo di L. monocytogenes usati in questo studiano e sintomi controllati per accertare se questa dose si traduce infatti nel 50% di sopravvivenza agli endpoint. Se la sopravvivenza è inferiore o superiore al 50% in questa CFU, studi de-escalation graduale aumento della dose o dosi potrebbero essere eseguite per restringere rapidamente la dose DL 50. Un&#39;altra considerazione importante è il ceppo o sottoceppo di topi utilizzati per gli studi di infezione. Questo protocollo descrive l&#39;infezione del comunemente usato inbred ceppo di topi C57BL / 6J. Questo<html> ceppo è ben adatto per la misurazione delle risposte IFN-y poiché questo mouse è considerato un Th1-inclini ceppo 33 e, di conseguenza, è relativamente resistente alla L. monocytogenes infezione (rispetto ai ceppi Th2 inclini topo come BALB / c) 34,35. Adattamento questo protocollo per altri ceppi di topi richiede la conoscenza della dose infettiva del patogeno per il particolare ceppo. Si raccomanda inoltre di utilizzare i topi della stessa età, il sesso e il venditore, come descritto in questo protocollo, al fine di ridurre la quantità di risoluzione dei problemi coinvolti nella creazione del modello. Ad esempio, C57BL / 6 topi ordinato da un fornitore (ad esempio, C57BL / 6J) può esibire differenze genetiche rispetto C67BL / 6 topi ordinati da un altro fornitore (ad esempio, C57BL / 6NTac) 36. Inoltre, il microbiota intestinale differisce tra C57BL / 6 substrains ottenuti da fornitori diversi, che possono influenzare l&#39;equilibrio delle risposte Th1 e Th17 nel topo 37. ove_title &quot;&gt; Possibili modifiche alla tecnica I topi sono più comunemente inoculati ip o endovenosa in contrasto con la via naturale di infezione nell&#39;uomo, che è attraverso il tratto gastrointestinale. Infezioni orali sono meno comuni a causa ceppi standard di L. monocytogenes inefficiente infettano l&#39;epitelio intestinale di topi 38. Questo è perché c&#39;è un singolo cambiamento aminoacido nella sequenza di topo E-caderina da E-caderina umana che si traduce in perdita di riconoscimento della E-caderina dalla proteina dall&#39;invasione listerial, internalin A (Inia) 39. Per superare questo ostacolo, i ricercatori utilizzano topi che sono transgenici per la proteina E-caderina uso umano o listeria che sono state progettate per esprimere una sequenza mutata di Inia (Inia mut) che si lega al topo E-caderina con la stessa affinità come WT EGD per umano E-caderina 40. Così, una modifica potenziale di questa tecnica è quello di infettare topi per via orale. Il lettore si riferisce a un&#39;altra pubblicazione JoVE che descrive i metodi di inoculazione orale 38. Notare che modificando la modalità di infezione influenzare la dose infettiva e le cinetiche di diffusione del patogeno. Questo protocollo descrive usando listeria calore ucciso a suscitare la produzione di IFN-γ da parte delle cellule CD4 + e CD8 +. Ucciso al calore L. monocytogenes è stato scelto come stimolo nei nostri studi, perché questo antigene è poco costoso e perché il nostro laboratorio era interessato principalmente le risposte delle cellule T CD4 + al patogeno. Una limitazione è che i batteri uccisi al calore non fanno efficiente primi CD8 risposte delle cellule T sia in vitro o in vivo 41 42,43 infezione. Così, la produzione di cellule CD8 + T IFN-γ che abbiamo osservato da splenociti raccolti al picco di infezione (cioè, la figura 6) probabile è in risposta alla residuabatteri vivi presenti nelle colture splenocyte o è stata evidenziata come risultato di citochina citochine indotta rilascio 41. Come alternativa alla listeria ucciso al calore, si potrebbe anche ottenere risposte IFN-gamma ex vivo esponendo le cellule T di peptidi che codificano epitopi sulle proteine listerial. Infatti, epitopi per listeriolysin O e l&#39;idrolasi p60 immunodominante MHC di classe II-limitata e sono stati descritti per immunodominanti epitopi MHC di classe I C57BL / 6 e BALB / C di topo e sono state descritte per BALB / c 44. Un altro approccio è quello di infettare i topi con ceppi di L. monocytogenes che sono state ingegnerizzate per esprimere antigeni modello, come ovalbumina o antigeni virali, al fine di trarre vantaggio da esistente MHC di classe I e reagenti MHC di classe II-tetramero per enumerare antigene-specifica Le cellule T nei topi infettati 45,46. Le limitazioni del protocollo Un altro limite di questo modello è che ola produzione di misure NLY IFN-γ da cellule immunitarie nella milza. Oltre all&#39;uso di tetrameri enumerare specifiche cellule antigene T (di ovalbumina esprimono varianti di L. monocytogenes), citofluorimetria pannelli di colorazione descritti qui può essere facilmente modificato per misurare la produzione di altre citochine quali TNF o IL-2 o molecole effettrici che partecipano a cellule T CD8 o l&#39;uccisione NK-mediata del patogeno, come perforina o granzyme B. inoltre, questo protocollo potrebbero anche essere adattati per esaminare IFN-γ prodotto dalle cellule del sistema immunitario nel fegato. Applicazioni future Una volta che questo protocollo è padroneggiata, può servire come un semplice modello in vivo per lo screening gli effetti dei vari agenti o geni Th1 e immunità cellulare.

IFN-γ è una citochina che è cruciale per mediare l&#39;immunità contro i patogeni intracellulari e per il controllo della crescita tumorale 5. L&#39;importanza di questa citochina nella resistenza batterica è evidente nell&#39;osservazione che gli esseri umani con mutazioni nel percorso di segnalazione di IFN-γ sono altamente suscettibili all&#39;infezione con micobatteri e salmonelle 6. Allo stesso modo, i topi carenti di entrambi IFN-γ o difetti del recettore espositive IFN-γ nella resistenza alla micobatteri 7-9 e altri agenti patogeni intracellulari, tra cui L. monocytogenes 10,11, Leishmania importante 12, Salmonella typhimurium 13, e alcuni virus 11. Oltre agli agenti patogeni Lotta contro, IFN-γ gioca un ruolo cruciale in Host-difesa contro i tumori 14. Sebbene maggiore produzione di IFN-γ è utile nel contesto di infezione o tumore, la produzione prolungata di questa citochina è stato collegato to lo sviluppo di autoimmunità sistemica 15-17 e l&#39;accelerazione del diabete di tipo I nei diabetici non obesi modello di topo 18. Le principali fonti di IFN-γ includono le cellule NK, cellule NKT, γδ cellule T helper, le cellule T 1 (Th1), e linfociti T citotossici (CTL) 5,19,20. IFN-γ migliora sia innata e adattativa per: (1) up-regolazione complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) classe I e II espressione, (2) aumentare l&#39;espressione di molecole co-stimolatorie sulle cellule presentanti l&#39;antigene, (3) macrofagi migliorare fattori fagocitosi e la produzione di citochine pro-infiammatorie e microbicidi (ad esempio, l&#39;ossido di azoto e le specie reattive dell&#39;ossigeno), (4) promuovere la differenziazione delle cellule T CD4 + naive in cellule effettrici Th1, (5) promuovere il passaggio di classe di anticorpi di immunoglobuline ( Ig) 2a e IgG3 (nel topo), (6) inducendo la produzione di chemochine reclutare cellule immunitarie di siti di infection, e (7) miglioramento delle cellule NK e le risposte CTL 5,19. Data l&#39;importanza cruciale di IFN-γ in risposta dell&#39;ospite agli agenti patogeni e tumori, ricombinante IFN-γ è stato testato come trattamento per varie infezioni e neoplasie (recensito in 19). Tuttavia, a causa somministrazione sistemica di IFN-γ o citochina Th1 promuovere l&#39;interleuchina-12 (IL-12) è associato ad effetti collaterali e dose-correlati tossicità 19,21, vi è interesse a sviluppare strategie alternative per aumentare la produzione di IFN-γ by cellule immunitarie. Sviluppo di nuovi farmaci biologici e piccole molecole richiede in strumenti di screening vivo per verificare se tali agenti aumentare la produzione di IFN-γ durante una risposta immunitaria e se questo si traduce in effetti biologici significativi come l&#39;aumento della sopravvivenza degli animali. Infezione sperimentale di topi con i gram-positivi batterio L. monocytogenes è stato un modello strumentale perdecifrare il ruolo di IFN-γ in host-immunità contro patogeni intracellulari 1,22. L&#39;infezione dei topi con l&#39;agente patogeno per via endovenosa o per via intraperitoneale (ip) porta alla rapida diffusione dei batteri alla milza e nel fegato, dove diventano internalizzati dai macrofagi residenti e epatociti con cariche batteriche picco nella milza che si verificano tra il 3 e 4 giorni post infezione 1,3,22. La produzione di IFN-γ da parte delle cellule NK è importante per l&#39;attivazione dei macrofagi e la resistenza precoce contro l&#39;agente patogeno 3; tuttavia a dosi elevate infettive, la produzione di IFN-γ può anche essere dannoso alla clearance dei patogeni 23. Cellule NKT sono anche una fonte di IFN-γ nella milza e nel fegato durante il controllo precoce di agenti patogeni 2,24 e questa produzione è stato dimostrato per amplificare la produzione di IFN-γ da altri tipi di cellule, tra cui le cellule NK 2. D&#39;altra parte, in seguito ad azione adattativi linfociti T, cellule T CD8 + in partilare, sono importanti per mediare il gioco del patogeno e della protezione contro reinfezione 1,4,22. Questo modello di infezione è stato interessante per i ricercatori per una serie di ragioni (rivisto in 1). Innanzitutto, l&#39;infezione con il patogeno è altamente riproducibile e induce una forte Th1 e cellulare risposta immunitaria. In secondo luogo, durante l&#39;infezione subletali, carica batterica è concentrata nel fegato e nella milza dove può essere facilmente misurata. In terzo luogo, l&#39;agente patogeno può essere tranquillamente gestita sotto biosicurezza di livello 2 (BSL2) condizioni. In quarto luogo, l&#39;organismo e la risposta immunitaria che genera sono stati ampiamente caratterizzati. Infine, una varietà di ceppi mutanti e geneticamente modificati sono stati sviluppati che sono disponibili per l&#39;uso. Qui descritto è un protocollo di base per l&#39;inoculazione di C57BL 6J topi / con il ceppo EGD di L. monocytogenes 25 e per la misura di IFN - γ resposte da NK, NKT e linfociti adattivi post-infezione. Inoltre descritto è come misurare carica batterica nella milza e nel fegato dopo l&#39;infezione subletali e di effettuare studi di sopravvivenza dopo infezione con un modificata LD 50 dose del patogeno. Infine, dati rappresentativi sono mostrati di come questo protocollo può essere usata per selezionare l&#39;effetto di nuovi trattamenti sulle risposte IFN-gamma e la sopravvivenza mouse dalla L. monocytogenes infezione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="923">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Brain Heart Infusion Broth, Modified</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">299070</td>
			<td style="width:273px;">any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:107px;">214010</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">X100</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1xPBS</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">D8537</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TissueLyser II</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:107px;">85300</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ammonium Chloride (NH3Cl)</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">KHCO3</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">22400089</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">12483</td>
			<td>Before use, heat-inactivate at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25030</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Non-essential amino acids</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">11140</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">554724</td>
			<td>Use 4 &#956;l in 6 ml cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">16% Paraformaledehye</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:353px;">10 x Perm/Wash buffer</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">554723</td>
			<td>Dilute 10x in ddH20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">14-0161</td>
			<td>Dilute 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">65-0866</td>
			<td>Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">15-0041</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">11-0081</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PBS57/mCD1d tetramer-APC</td>
			<td style="width:191px;">NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td>Obtained as a gift from the facility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Mouse TCR&#946;-PE-Cy7 (H56-597)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">25-5961</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">47-3351</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">25-0451</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">12-7311</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">OneComp eBeads</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">01-1111</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Mouse IFN gamma ELISA kit</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td>88-7314</td>
			<td>Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50 mL vented tubes for culture</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">bacterial petri dishes</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">2 ml cyrovials</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">UV spectrometer</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">safety engineered needles</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">C57BL6/J</td>
			<td style="width:191px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:107px;">Stock#000664</td>
			<td>Order for arrival at 7 wks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Bleach</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>For decontamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>For decontamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Glass beads</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>rotor, buckets, bucket covers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Sterile Glycerol</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Pipette Tips</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Pipette</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">70 micron strainers</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">3 ml syringe</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Pipette gun</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Filtration Units</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Round bottomed plates</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">FACs tubes</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">BD LSR II</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Flowjo software</td>
			<td style="width:191px;">Treestar</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Multichannel pipettor (0-300 &#181;l)</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for washing glass beads, any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Microbank Bacterial Preservation System</td>
			<td style="width:191px;">Pro-lab Diagnositics</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental infection with listeria monocytogenes as a model for studying host interferon-&#947; responses

L. monocytogenes è un batterio gram-positivo che è una causa di origine alimentare malattie negli esseri umani. infezione sperimentale di topi con questo agente patogeno è stato molto istruttivo sul ruolo delle cellule immunitarie innate e adattative e citochine specifiche immunità dell&#39;ospite contro gli agenti patogeni intracellulari. La produzione di IFN-γ da parte delle cellule innate durante l&#39;infezione subletale con L. monocytogenes è importante per l&#39;attivazione di macrofagi e il controllo precoce del patogeno 1-3. Inoltre, la produzione di IFN-γ da linfociti memoria adattativi è importante per l&#39;innesco l&#39;attivazione delle cellule innate upon reinfezione 4. La L. monocytogenes modello di infezione quindi serve come un ottimo strumento per indagare se le nuove terapie che sono progettati per aumentare la produzione di IFN-γ avere un impatto sulle risposte IFN-γ in vivo e hanno effetti biologici produttivi come l&#39;aumento gioco batterica o migliorare la sopravvivenza del mouse da parte diinfezione. Qui descritto è un protocollo di base per il modo di condurre le infezioni intraperitoneale di C57BL / 6J topi con il ceppo EGD di L. monocytogenes e per misurare la produzione di IFN-γ da parte delle cellule NK, cellule NKT e linfociti adattivi mediante citometria di flusso. Inoltre, le procedure sono descritte a: (1) crescere e preparare i batteri per l&#39;inoculazione, (2) misurare carica batterica nella milza e nel fegato, e (3) la sopravvivenza misura animale endpoint. Dati rappresentativi sono inoltre forniti per illustrare come questo modello infezione può essere utilizzato per testare l&#39;effetto di agenti specifici sulle risposte IFN-y a L. monocytogenes e la sopravvivenza di topi da questa infezione.

La figura 3 presenta alcune tipico flusso citometria colorazione di IFN-γ in cellule NK e NKT milza a dopo l&#39;infezione 24 ore con 10 CFU 5 del patogeno. Questa figura illustra anche la strategia di gating per il pannello colorazione descritto nella Tabella 2. La figura 4 mostra alcuni dati rappresentativi che sono stati ottenuti in un esperimento in cui i topi maschi sono stati trattati con la IS001 o il veicolo di controllo PPARa antagonista, infettati con 10 CFU 5 L. monocytogenes, e poi analizzato per IFN-γ in cellule NK e NKT dopo 24 ore . Questo dato dimostra che il trattamento con IS001 potenziato le risposte IFN-gamma da parte delle cellule NKT, ma le cellule NK non dopo l&#39;infezione con l&#39;agente patogeno. La Figura 5 mostra colorazione rappresentante per IFN-γ in cellule T CD8 + milza CD4 + e 7 giorni dopo l&#39;infezione dopo la ri-stimolazione ex vivo con pa ucciso al calorethogen. Questa figura mostra anche la strategia di gating per il pannello colorazione descritta nella Tabella 3. La figura 6 mostra i dati rappresentativi che sono stati ottenuti in un esperimento in cui i topi maschi sono stati trattati giornalmente con l&#39;antagonista IS001 o di un veicolo di controllo PPARa, infettati con una dose subletale di L. monocytogenes, e analizzati a 7 giorni dopo l&#39;infezione. Questo esperimento dimostra che il trattamento con IS001 migliorato risposte IFN-gamma da parte sia CD4 + e CD8 + linfociti. La Figura 7 mostra i dati rappresentativi di uno studio che ha studiato l&#39;effetto dell&#39;antagonista IS001 PPARa sulla sopravvivenza mouse per endpoint dopo l&#39;infezione con il modificata DL 50 dose del patogeno. Tracciata è la sopravvivenza per cento dei topi contro il tempo dopo l&#39;infezione. Questo dato dimostra che il trattamento con IS001 ha aumentato la sopravvivenza dei topi maschi agli endpoint. Insieme, questi dati dimostrano come questo modello può essere applicato per indagaregli effetti di nuovi farmaci o trattamenti sulle risposte IFN-γ in vivo e per esplorare come questi cambiamenti immunitari impatto sopravvivenza degli animali dall&#39;infezione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig1.jpg" /> Figura 1. Dissezione la milza di topi infetti. Questa serie di foto mostra come sezionare la milza da un topo morto. (a) Lie il mouse sul lato destro e spruzzare giù la pelle con il 70% di etanolo. (b) Utilizzando pinze asettiche o sterili e forbici difficili taglio, incidere la pelle appena sotto il fondo della gabbia toracica. (c) Spray giù lo strato muscolare esposta con il 70% di etanolo. La milza dovrebbe essere visibile sotto lo strato muscolare (aperto punta di freccia). (d) Utilizzando pinze asettiche o sterili e forbici sottili, incise lo strato muscolare per rivelare la milza. (e) afferrare delicatamente la milza con le pinze e uSE forbici sottili per tagliare la milza dal circostante tessuto connettivo. (f) Posizionare la milza in un tubo da 15 ml contenente sterile PBS 1x. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig2.jpg" /> Figura 2. splenociti di conteggio con un emocitometro. (a) mostra la griglia centrale del emocitometro. (b) mostra una vista ingrandita della griglia centrale che contiene 25 grandi piazze (che contengono ciascuno 16 quadrati più piccoli). I cinque grandi piazze utilizzati per il conteggio sono evidenziate in grigio (4 piazze d&#39;angolo, più il quadrato centrale nella griglia centrale). (c) mostra una vista ingrandita di uno dei grandi quadrati grigi. Per determinare il volume della cella in 10 6 / ml, primo conteggiotutte le cellule vitali all&#39;interno dei cinque grandi quadrati grigi. Nell&#39;esempio illustrato, questo conteggio è 215. Quando il conteggio, assicurarsi di contare solo tutti i (non-blu) cellule chiare, comprese quelle che toccano il doppie linee a destra e inferiore della griglia. Non contare le cellule che toccano le doppie linee a sinistra e la parte superiore della griglia. Prendere totale cinque conteggio quadrata e dividerlo per 10 per ottenere il numero di cellule in 10 6 / ml. Nell&#39;esempio, 215 diviso 10 è 21,5 x 10 6 cellule / ml. Si noti che questi calcoli funzionano solo se si contano 5 delle grandi piazze come evidenziato e diluire le cellule 1: 1 in trypan blu. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig3.jpg" /> Figura 3. strategia di gating per il rilevamento di IFN-γ Produzione in cellule NK e NKT. Prima porta sui linfociti in FSC-A di SSC-Una trama. Poi cancello a quegli eventi che sono sulla diagonale sul FSC-H / FSC Una trama. Queste sono le canottiere. Poi cancello dal vivo (AmCyan -) e CD8 - cellule. Poi tracciare la colorazione tetramero contro TCRβ. Le cellule NKT sono all&#39;interno della popolazione doppia positivo e le cellule NK sono all&#39;interno della popolazione doppia negazione. Porta sulle cellule doppio positive, e la trama NKp46 contro FSC. Porta sulla popolazione negativo NKp46, che sono le cellule NKT (questa porta può essere impostato trovare il punto di divisione nei due popolazioni di trama cellule NK). Le cellule NK sono tetramero - TCRβ - NKp46 + popolazione. All&#39;interno NK e NKT porte delle celle, le celle + IFN-gamma nel canale PE sono identificati dopo aver impostato un cancello basato sul controllo FMO. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic</a>qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig4.jpg" /> Figura 4. Rappresentante dati ottenuti per le frequenze di cellule NK e NKT IFN-γ + a 24 ore dopo l&#39;infezione. In questo esperimento, maschi C57BL / 6J (N = 3 - 4 / gruppo) sono stati infettati con ip 10 5 CFU di L. monocytogenes o sono stati lasciati non-infetti. I topi sono stati somministrati anche il IS001 farmaco o veicolo (0,5% carbossimetilcellulosa) allo stesso tempo di inoculazione e 12 ore più tardi. Ventiquattro ore dopo l&#39;inoculazione, i topi sono stati sacrificati e le milze sono stati rimossi e sono stati elaborati singolarmente e colorate per citometria a flusso. Vengono mostrati la media ± SEM di frequenza delle cellule NK IFN-γ + (a) o cancelli cellule NKT (b) nei topi non infetti o infetti dopo il trattamento con un veicolo o IS001 droga. *Indicaredifferenza sa (P &lt;0.05) dal controllo del veicolo da T-test a due code. I dati sono ri-stampati da 31 con il permesso del Journal of Immunology (volume 195, pp. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. L&#39;associazione americana degli immunologi, Inc. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig5.jpg" /> Figura 5. strategia di gating per il rilevamento di IFN-γ produzione nelle cellule CD4 e CD8. Prima porta sui linfociti in FSC-A di trame SSC-A. Poi cancello a quegli eventi che sono sulla diagonale sul FSC-H / FSC Una trama. Queste sono le canottiere. All&#39;interno di questa porta, cancello a (AmCyan -) dal vivo le cellule CD45 +. Poi porta sulle popolazioni sia CD8 + e CD4 +. All&#39;interno di ogni porta, la IFN-γ +cellule nel canale PE sono identificate confrontando la colorazione al controllo FMO. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig6.jpg" /> Figura 6. Rappresentante dati ottenuti per le frequenze di cellule CD4 + e CD8 + IFN-γ + a 7 giorni dopo l&#39;infezione da L. monocytogenes (ceppo EGDS). In questo esperimento, maschio / 6J C57BL sono stati infettati con ip 2 x 10 4 CFU L. monocytogenes (N = 7 / gruppo) o sono stati lasciati non infetti (N = 3 / gruppo). I topi sono stati somministrati anche il IS001 farmaco o veicolo (0,5% carbossimetilcellulosa) due volte al giorno a partire dal giorno di inoculazione. Sette giorni dopo, i topi sono stati sacrificati e le milze sono stati rimossi e sono stati trattati singolarmente percoltura cellulare. Cellule mononucleate splenocyte sono state stimolate per 24 ore con calore ucciso L. monocytogenes con il trasporto di proteine inibitore per la finale 4 ore della cultura. Le cellule sono state poi colorate per citometria a flusso. Vengono visualizzati i media ± SEM di frequenza di IFN-γ + cellule CD4 in (a) + o cancelli delle cellule CD8 + (B) nei topi non infetti o infetti dopo il trattamento con un veicolo (carbossimetilcellulosa 0,5%) o la IS001 di droga. * Indica una differenza (P &lt;0.05) dalla controparte controllo del veicolo, come determinato mediante il test T a due code. I dati sono ri-stampati da 31 con il permesso del Journal of Immunology (volume 195, pp. 5189-5202, 2015) .Copyright 2015. L&#39;associazione americana degli immunologi, Inc. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig6large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 7. Rappresentante dati ottenuti nel corso di un esperimento che ha confrontato l&#39;effetto di un antagonista PPARa 1S001 sul mouse sopravvivenza agli endpoint dopo l&#39;infezione di Male C57BL / 6J con L. monocytogenes (ceppo EGDS). In questo esperimento, maschi C57BL / 6J (N = 10 topi / gruppo) sono stati infettati con il ip modificato DL 50 dosi del patogeno (10 CFU 5) di L. monocytogenes. I topi sono stati somministrati anche il IS001 farmaco o veicolo (0,5% carbossimetilcellulosa) due volte al giorno a partire dal giorno di inoculazione. I topi sono stati seguiti tutti i giorni per i segni clinici e sono stati sottoposti ad eutanasia se gli endpoint umane sono state soddisfatte. Viene mostrato la sopravvivenza per cento dei topi per endpoint nel tempo * indica una differenza nella sopravvivenza tra i gruppi come determinato dal log-rank test (P &lt;0,05). I dati sono ri-stampati da 31 con il permesso del Journal of Immunologia (volume 195, pp. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. L&#39;associazione americana degli immunologi, Inc. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig7large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54554/54554table1.jpg" /> Tabella 1: mostra alcuni calcoli rappresentativi per la determinazione CFU in una frazione della cultura Giorno. In questo esempio, una aliquota della coltura giorno è stata presa e fu diluito 1: 1 con BHI media. La OD 600 di questo campione diluito è stato determinato per essere 0,84. Inoltre, un&#39;aliquota di 100 microlitri è stata presa per la determinazione CFU. Questo campione è stato diluito con 900 ml di BHI supporti (10 -1) e fu lavato e risospeso in 1 ml BHI. Una serie di diluizioni di 10 volte di questo campione è stato preparato (10 -2 a 10 -9) e campioni diluiti sono stati placcati in BHI agapiastre r (valori solo per 10 -4 a 10 -9 sono mostrati). Le colonie giorno dopo sono stati contati. Solo i piatti che avevano i numeri di colonie tra 30-300 sono stati considerati per il calcolo (ad esempio, 10 -6 piatto, evidenziato in giallo). Il numero di colonie su questa piastra (70) è stato poi diviso per 0,1 (volume in ml placcato) per ottenere il CFU / ml del campione diluito. Questo valore è stato quindi moltiplicato per il fattore di diluizione (10 6) per ottenere la lettura / ml CFU della coltura non diluito. TMTC = troppi per contare. <img alt="Tabella 2" src="/files/ftp_upload/54554/54554table2.jpg" /> Tabella 2: Pannello di colorazione per il rilevamento di IFN-γ in NK e NKT cellule. Si noti che entrambi sfere di compensazione colorate con gli anticorpi di flusso utilizzati nel pannello o splenociti macchiati con le varie versioni di fluorocromi CD4 anticorpi clone GK1.1 possono essere utilizzati come singoli controlli positivi. <img alt="Tabella 3" src="/files/ftp_upload/54554/54554table3.jpg" /> Tabella 3: Pannello di colorazione per il rilevamento di IFN-γ in CD4 + e CD8 + cellule. Si noti che entrambi sfere di compensazione colorate con gli anticorpi di flusso utilizzati nel pannello o splenociti macchiati con le varie versioni di fluorocromi CD4 anticorpi clone GK1.1 possono essere utilizzati come singoli controlli positivi.

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Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Questo protocollo descrive come inoculare topi C57BL / 6J con il ceppo EGD di Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) e per misurare l&#39;interferone-γ (IFN-γ) risposte da parte delle cellule natural killer (NK), cellule T natural killer (NKT), e adattiva linfociti T dopo l&#39;infezione. Questo protocollo descrive anche come condurre studi di sopravvivenza in topi dopo l&#39;infezione con una versione modificata del DL 50 dosi del patogeno.

Infezione sperimentale con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Come modello per lo studio Host Interferone-gamma Risposte

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

experimental-infection-with-listeria-monocytogenes-as-model-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K Views.  University of Toronto.  Questo protocollo descrive come inoculare topi C57BL / 6J con il ceppo EGD di Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) e per misurare l'interferone-γ (IFN-γ) risposte da parte delle cellule natural killer (NK), cellule T natural killer (NKT), e adattiva linfociti T dopo l'infezione. Questo protocollo descrive anche come condurre studi di sopravvivenza in topi dopo l'infezione con una versione modificata del DL 50 dosi del patogeno. 

Video: Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Misurazione della carica batterica e Risposte immunitarie in topi infettati con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

Il<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Studiare Contributi degli agenti patogeni e Host alla colite infettiva

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the gastrointestinal phase of listeriosis due to the lack of a small animal model that closely mimics human disease. This paper describes a novel mouse model for oral transmission of L. monocytogenes. Using this model, mice fed L. monocytogenes-contaminated bread have a discrete phase of gastrointestinal infection, followed by varying degrees of systemic spread in susceptible (BALB/c/By/J) or resistant (C57BL/6) mouse strains. During the later stages of the infection, dissemination to the gall bladder and brain is observed. The food borne model of listeriosis is highly reproducible, does not require specialized skills, and can be used with a wide variety of bacterial isolates and laboratory mouse strains. As such, it is the ideal model to study both virulence strategies used by L. monocytogenes to promote intestinal colonization, as well as the host response to invasive food borne bacterial infection.

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

This paper describes a novel method for oral infection of mice using Listeria monocytogenes-contaminated food. The protocol can readily be adapted for use with other food borne bacterial pathogens.

Trasmissione orale di<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Nei topi tramite ingestione di alimenti contaminati

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC secrezione per Indagare infezione Cellular dalla batterica patogeni<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la Valutazione Interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA Purificazione da nella cellula Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In macrofagi

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologie per lo studio<em&gt; B. subtilis</em&gt; I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.

Listeria monocytogenes Infezione del cervello

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.