We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG&#180;s laboratory is supported by the University of Z&#252;rich, by a fellowship of the "Deutsche Forschungsgemeinschaft" and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the "Staatssekretariat f&#252;r Bildung und Forschung" in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).

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E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development.">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).</li><li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes:+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing.">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLOS ONE. 7, e29685 (2012).</li><li>Mau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+apomicts+trapped+in+the+ecological+niches+of+their+sexual+ancestors.">Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors.</a> Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).</li><li>Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , 40-104 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El Protocolo es adecuado para diferentes tipos de células y de tejidos LAM combinado con análisis del transcriptoma mediante microarrays o ARN-Sec es una valiosa herramienta para obtener información sobre los patrones específicos de actividad de los genes que regulan los procesos de desarrollo o fisiológicas 7-11,13,14. Sin embargo, la idoneidad de este método para cualquier tipo de célula dada depende críticamente de las cuestiones estructurales. La célula tiene que ser claramente visible e inequívoca en secciones secas utilizadas para LAM. En Boechera divaricarpa, la morfología del gametofito permite una fácil identificación de la célula huevo (Figura 2, Figura 3). Al final, la velocidad de aislamiento de una población celular específica también depende de la frecuencia a la que el tipo de célula se puede encontrar en una diapositiva, como el intercambio de diapositivas y la exploración de nuevas diapositivas son pasos que consumen tiempo. Teniendo en cuenta que depende del tipo de célula, por lo menos 200 a 250 secta célulaiones deben agruparse por muestra, la idoneidad del método para un cierto diseño del estudio depende en gran medida de los requisitos de tiempo para la etapa de LAM. Además, dependiendo de la morfología del tejido, puede ser ventajoso en términos de estructura para reducir el espesor de las secciones a 6 micras. Del mismo modo, las secciones más gruesas de lo ideal ≥ 8 micras típicamente resultan en una mayor cantidad de ARN y ARN de ligeramente más alta calidad a partir de la misma cantidad de secciones de tejido. Además, las células de interés deben tener al menos un diámetro de 8-10 micras para hacer el aislamiento por LAM factible. En principio, el protocolo descrito aquí se puede ajustar para diferentes tipos de células y de tejidos de especies alejadas. Sin embargo, la calidad del ARN puede variar incluso entre diferentes tipos de células de la misma especie 7,10,13. Este protocolo ha sido ajustada en base a los tipos de células pequeñas y críticos. Por lo tanto, ahora se puede aplicar a un broader gama de muestras sin más ajustes. Ligeras modificaciones del protocolo podrían no obstante ser necesario, dependiendo del tipo de célula y de las especies bajo investigación. Se recomienda utilizar primero ambos fijadores alternativos (véase el protocolo 1.1) al configurar el método para una nueva especie o tipo de célula para una comparación de la morfología y la calidad del ARN. En principio, el protocolo se puede adaptar a y se realizó con diferentes instrumentos adecuados para microdisección láser 9. Sin embargo, hay que señalar que los instrumentos varían tanto en la potencia del láser y el ancho mínimo del haz de láser que se puede aplicar, así como en la tecnología de muestreo. En particular, para el aislamiento de células pequeñas y zonas de tejido, los láseres que resulta en un camino estrecho de láser se adaptan mejor. El rayo láser del instrumento que usamos es bastante fino (~ 1 m ancho) y permite la disección de las células pequeñas. La tecnología de muestreo de recoger el cells en una superficie pegajosa tapa por adhesión electrostática es particularmente ventajoso para los tipos de células pequeñas y el aislamiento de secciones de células individuales. Esto minimiza el riesgo de pérdida de la muestra por efectos electrostáticos. La calidad del ARN obtenido es importante para una mayor análisis de la transcripción Uno de los puntos más críticos para el éxito de la preparación de la biblioteca de ARN-Sec es la calidad del ARN. Mientras que varios proveedores de kits de amplificación optimizan su tecnología para el ARN de la integridad incluso más baja, la calidad de los datos obtenidos tras el análisis del transcriptoma por cualquiera de microarrays o RNA-Seq aumenta típicamente con la calidad del ARN de entrada. El uso de este protocolo establecido, se obtuvieron buenos y altamente reproducible ARN de calidad para diferentes etapas de desarrollo de los tejidos reproductivos femeninos y de la línea germinal en Arabidopsis y Boechera (por ejemplo, la Figura 4). Mientras que el método es aplicabletambién para las especies más alejadas (por ejemplo, tomate, no publicado), que debe ser tenido en cuenta que las pequeñas optimizaciones o modificaciones pueden ser requeridos dependiendo de la especie, tipo de tejido, e incluso el ambiente de laboratorio como, por ejemplo, una elevada humedad pudiera comprometer la integridad del ARN durante la preparación de diapositivas y LAM. Un paso crítico durante el protocolo es el montaje de las tiras de cera que contienen las muestras seccionadas a las diapositivas. Aquí, en particular, el contacto con el agua es un paso crítico. Mientras que la sustitución de agua por EtOH no da como resultado ninguna mejora significativa de la integridad del ARN después del aislamiento (no publicado), la sustitución de agua por metanol hace. Sin embargo, el metanol solo debe ser manejado bajo el capó química y con gran cuidado. Dependiendo del tipo de muestra, como una alternativa a la utilización de metanol, los tiempos de secado después del montaje con agua se pueden reducir a ~ 2 hr (véase 3.3.3.1), dando como resultado igualmente bueno calidad del ARN.Realización de un ensayo para probar la calidad de ARN obtenido mediante el montaje, ya sea en agua o metanol para el tipo celular y la especie de interés se recomienda en el comienzo de un nuevo proyecto. LAM es una tecnología de gran alcance para el Análisis de la transcripción En conclusión, hemos optimizado con éxito y se aplica la combinación de LAM y el análisis del transcriptoma tipo de células específicas por microarrays y RNA-Seq a diferentes células del linaje germinal sexual y apomictic en Arabidopsis thaliana, y en Boechera spp., Lo que permite el análisis de la transcripción comparativos (véase también la Figura 5) 7,11,13,14. El método descrito tiene una serie de ventajas en comparación con otras tecnologías que permiten el análisis de la transcripción específica del tipo celular. Es importante destacar que, dependiendo de la reconocibilidad de los tipos o tejidos de interés en la sección de células, se puede aplicar a tipos de células raras tanto de modeloy especies no modelo, tales como las células del gametofito femenino maduro en Boechera spp., o puede incluso ser utilizados para aislar dominios celulares, por ejemplo, mitades polares de las células 19. Aplicaciones similares no serían posibles con otros métodos que se basan en fluorescente activadas por la clasificación de células o núcleos (FACS / FANS) 10. Un inconveniente importante del método es el requisito de tiempo. Mientras que la fijación e inclusión no requiere disponer de manos sobre el Extended tiempo y al mismo tiempo se ha hecho para una gran cantidad de flores, LAM como tal es muy lento y, para un análisis específico del tipo celular, típicamente 3 días a 3 semanas de LAM (en promedio 5 horas por día en el microscopio láser) tiene que ser planificado. A este respecto, es útil hacer algunas pruebas previas para la velocidad de aislamiento del tipo celular específico dirigido a diseñar adecuadamente el estudio. Además, incluso cuando se utiliza este protocolo optimizado, los ensayos para probar la calidad del ARN son altamente resobresaliente. En resumen, LAM es una herramienta poderosa para el análisis de la transcripción en la resolución de los tipos de células individuales o incluso subdominios de células, lo que no se puede lograr usando métodos alternativos existentes. En este sentido, lleva un enorme potencial para permitir los análisis, por ejemplo, de los procesos de desarrollo, con una muy alta resolución temporal y espacial. Esto fue ejemplificado por los análisis de los transcriptomes de células en todos los pasos clave de la reproducción sexual y la apomixis en Arabidopsis y Boechera 7,11,13,14.

En transcripcional estudios realizados a nivel tisular, la transcriptomes de tipos de células altamente especializadas, pero raras son a menudo enmascarados por las células circundantes más abundantes. Un ejemplo de tales tipos de células altamente especializadas son las células del linaje reproductivo femenino (línea germinal) en las plantas. La línea germinal femenina se especifica dentro de óvulos en desarrollo, los precursores de las semillas en el interior del gineceo del 1,2 flor. La célula madre megaspora (MMC) es la primera célula de la línea germinal femenina. Se somete a la meiosis para formar una tétrada de megaesporas reducidos. Típicamente, sólo uno de estos megasporas sobrevive y divide mitóticamente sin citocinesis, es decir, en un sincitio. Estos son seguidos por mitosis cellularization para formar el gametofito maduro, que normalmente consiste en cuatro tipos de células: tres antípodas, dos células synergid, el huevo, y la célula central. Los óvulos y centrales son los gametos femeninos que consiguen fertilizados por dos espermatozoides durante Doula fertilización ble para dar lugar al embrión y el endospermo de la semilla en desarrollo 1,2. En el sistema modelo Arabidopsis thaliana sexual, sólo ~ 50 semillas se desarrollan por flor, mientras que alrededor de 50 - 80 semillas por flor se desarrollan en el género estrechamente relacionado Boechera. Por lo tanto, la línea germinal femenina consta de sólo unos pocos tipos de células altamente especializadas, por lo que es un excelente modelo para estudiar los procesos de desarrollo, tales como la especificación y diferenciación celular. Por otra parte, una visión de los procesos de regulación de genes que regulan la reproducción de plantas pueden ser de valor aplicada. En las plantas, puede ocurrir tanto en la reproducción sexual y asexual a través de semillas (apomixis). Mientras que la reproducción sexual genera diversidad genética en una población, la apomixis conduce a la formación de la progenie clonal que es genéticamente idéntico a la planta madre. Por lo tanto, la apomixis tiene un gran potencial para aplicaciones en la agricultura y la producción de semillas, como los genotipos maternos incluso complejos puedenmantenerse inalterada durante varias generaciones 3,4,5. Debido a que la apomixis no se produce de forma natural en cualquier especie vegetal importante, la ingeniería de la apomixis en los cultivos es de gran interés 3,4,5. Sin embargo, este objetivo a largo plazo es difícil de lograr debido a que la base genética y molecular subyacente de la apomixis no se entiende con el suficiente detalle 6. Para hacerse una idea de la base de la transcripción que regulan la reproducción apomictic, específica del tipo celular transcripcional de perfiles mediante microdisección asistida por láser (LAM) y la secuenciación de próxima generación (NGS) representa un enfoque muy potente 7,8. LAM primera se ha establecido para los animales y la investigación biomédica. En los últimos años LAM también se ha aplicado a la biología vegetal 6,9,10. En contraste con otros métodos que permiten perfiles de tipos de células y tejidos individuales, LAM no requiere la generación de líneas de marcador 6,9,10. Por lo tanto, puede ser la aplicaciónmentido a cualquier tipo de célula o tejido sin conocimiento previo molecular. Otra ventaja de LAM es que se puede aplicar a cualquier tipo de célula, siempre que la célula se puede reconocer en las secciones secas basada en la posición y / o características estructurales. LAM tiene la ventaja adicional de que se utilizan tejidos fijados, lo que impide cambios del perfil transcripcional durante el procesamiento. El tejido de interés, por ejemplo, tejido floral, se fija en un fijador no reticulante antes de la incrustación en cera de parafina. Incrustación en cera de parafina se puede hacer manualmente, siguiendo los protocolos establecidos 9,11. Sin embargo, el uso de un procesador de tejido automatizado para la deshidratación y la infiltración con la cera generalmente da como resultado una mayor reproducibilidad en términos de la conservación de la calidad del ARN y la morfología del tejido. La estrategia alternativa de la incrustación de tejidos en resina también se ha utilizado con éxito para el análisis de tipos específicos de células por LAM 8. Sin embargo, el uso de un automprocesador de tejidos ado para incrustar en cera es muy eficiente en el tiempo, ya que muchas muestras se pueden procesar a la vez que requiere un mínimo de manos a tiempo. Aunque normalmente no hay pérdida significativa de la calidad del ARN se produce durante la fijación y la incrustación, la preparación de secciones delgadas con el microtomo y, en particular, el montaje en los frameslides utilizados para LAM sigue siendo un paso crítico para la conservación de la calidad del ARN. Esta ha sido previamente señalado y el uso de un sistema de transferencia de la cinta se ha descrito para dar lugar a una mejor calidad de RNA en este paso 12. Sin embargo, esto añade una etapa que consume tiempo adicional durante la preparación de los portaobjetos y también requiere un equipo especial. El protocolo optimizado se describe a continuación de forma reproducible produce ARN que es de calidad suficiente para el perfil transcripcional con GeneChips y Next Generation Sequencing (NGS) se acerca 7,11,13,14. Además, con el microscopio de microdisección láser utilizado, una alta pureza de los tipos de células aisladas es goleadainely produjo 7,11,13,14. El género Boechera es un excelente sistema modelo para el estudio de los pasos clave de la reproducción apomictic. En Boechera, una variedad de diferentes adhesiones sexuales y apomícticas han sido identificados y se puede utilizar para los análisis comparativos 15,16,17. En una comparación de transcriptomes tipo de células específicas de las células de la línea germinal femenina de Arabidopsis sexual y apomictic Boechera, hemos identificado los genes y las vías que son expresados ​​diferencialmente, identificando de este modo nuevos aspectos de los procesos de regulación que rige la apomixis 7. Además, este estudio verificó la idoneidad de LAM para la célula de la transcripción de tipo análisis específicos de tipos de células pequeñas y raras. Ya hemos utilizado este protocolo para el análisis de los diferentes tipos de células en una variedad de especies de plantas, pero en las especies y las modificaciones específicas de tejido en el protocolo pueden ser necesarios en algunos casos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1,009,861,000</td>
			<td>absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml falcon centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3686,2500</td>
			<td>100% Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Nuclease free water</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASP200 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048043624</td>
			<td>tissue processor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>black cardboard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be purchased in special paper shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA- and RNAse-free Frame Slides</td>
			<td>Micro Dissect GmbH</td>
			<td></td>
			<td>1,4 &#181;m PET-membrane; can also be purchased from Leica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumond Forceps</td>
			<td>Actimed</td>
			<td>0208-5SPSF-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exsiccator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z354074-1EA</td>
			<td>Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60010</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1000&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60010</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60020</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60200</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps precision</td>
			<td>VWE</td>
			<td>232-1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide holder</td>
			<td>Huber &#38; Co.AG</td>
			<td>10.0540.01</td>
			<td>F&#228;rbek&#228;sten nach Hellendahl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass staining trough</td>
			<td>Huber &#38; Co.AG</td>
			<td>10.0570.01</td>
			<td>F&#228;rbekasten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module Leica</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica EG 1150 H</td>
			<td>blocking station, similar devises are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Drying Table</td>
			<td>Medax</td>
			<td>15501</td>
			<td>other models and/or suppliers are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket</td>
			<td>VWR ice bucket with lid&#160;</td>
			<td>10146-184</td>
			<td>similar buckets equally suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light table</td>
			<td>UVP An Analytical Jena Company</td>
			<td>TW-26&#160;</td>
			<td>white light transluminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10143562CE</td>
			<td>cut edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtome blade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FEAHS35</td>
			<td>S35 microtome blade disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI Cell Cut Plus Instrument</td>
			<td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM12475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast X-TRA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X882.2</td>
			<td>for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic balancing trays</td>
			<td>Semadeni AG</td>
			<td>2513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic box</td>
			<td>Semadeni AG</td>
			<td>2971</td>
			<td>Plastikdose PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic lid for heating plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preparation needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-7159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free microfuge tubes</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse ZAP Decontamination Solution</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automated Rotary Microtome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2245</td>
			<td>similar devises are equally suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Loc&#160; Histo Screen Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C-1000_AQ</td>
			<td>similar cassettes of other suppliers are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 &#181;l&#160;</td>
			<td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td>
			<td>50204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylol (Isomere) ROTIPURAN</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4436.2</td>
			<td>min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>process embedding cassettes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14039440000</td>
			<td>Leica Jet Cassette I without lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF55</td>
			<td>other models and/or suppliers are suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted microdissection (lam) as a tool for transcriptional profiling of individual cell types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Preparación de la muestra y LAM se realizan en pasos consecutivos Es necesaria una serie de pasos consecutivos para preparar ARN para el análisis de la transcripción de determinados tipos de células por LAM (Figura 1). Esto comienza con la recolección de las flores y fijación inmediata para asegurar que la población de ARN se mantiene sin cambios después de la cosecha. El tejido está incrustado, se seccionaron y se montaron en portaobjetos. Esto permite el aislamiento de las células por LAM y la puesta en común de las secciones específicas del tipo de células en una o varias tapas (Figura 1). El material se puede congelar después o directamente procesada por la extracción de RNA. Aparte de la ventaja de LAM sea aplicable para tipo de células específicas análisis en ambas especies modelo y no modelo, el método sigue siendo bastante tiempo. Por lo menos una semana de tiempo de trabajo, a veces más, es necesario para los pasos de tiN ú mero de la cosecha para la extracción de RNA (Figura 1). Hay que tener en cuenta que a menudo secciones cosechadas durante varios días de LAM se agrupan en una extracción de la muestra y el ARN biológica. Para las células de huevo Boechera, el uso de al menos ~ 200 secciones por muestra es muy recomendable, con hasta ~ 100 secciones aisladas por día. El aislamiento de la celda Tipos de interés depende de su visibilidad en las secciones secas El aislamiento de las secciones específicas del tipo de células es el paso más lento del protocolo. Hasta el momento, no incluye la automatización de este paso se ha desarrollado debido a la naturaleza compleja de las muestras. La identificación de las células de interés utilizando una herramienta de software no es factible debido a que las secciones secas tienen bajo contraste y el plano de sección varía entre las muestras debido al hecho de que los óvulos están orientados en diferentes ángulos wentro del tejido (Figura 2). Sin embargo, la morfología única del gametofito hembra madura con las sinérgidas, óvulo y la célula central (células antípodas degeneran antes de la fertilización) permite la identificación inequívoca de los óvulos por el investigador (Figura 2 B, C, Figura 3). De hecho, en Boechera divaricarpa, la célula huevo a menudo se reduce un poco durante la preparación y por lo tanto se separa de los tejidos circundantes, una característica ventajosa para el aislamiento de poblaciones de células huevo a alta pureza (Figura 2B, C; Figura 3). Inspección visual de la PAC después LAM es Recomendaciones La inspección visual de la superficie de la tapa después de LAM permite la identificación de cualquier posible contaminación de la muestra, por ejemplo, por el polvo. Además, es útil para asegurar que el secciones se adhieren a la tapa, ya que ocasionalmente secciones se pierden durante el procedimiento. Por lo general, muchas secciones seleccionadas, por ejemplo, células de huevo, se pueden ver en una tapa después de varias horas de LAM. El flujo de trabajo de la empresa de forma reproducible redundará en la buena calidad del ARN De tipo de células específicas de aislamientos LAM gametofitos femeninos, las cantidades totales de ARN son sólo en el orden de ng baja. Esta cantidad limitante de RNA hace que sea necesario el uso de un control representativa aislada de tejidos más grandes de cada diapositiva como una aproximación para el control de la calidad del ARN después de LAM. Esto se demuestra por una comparación de ARN tipo de células específicas de B. células divaricarpa huevo como comparación con los controles de las áreas de tejido más grandes aisladas a partir de los mismos se desliza, lo que indica la calidad del ARN similares (Figura 4A, B). Usando este método, un buen a la alta calidad de ARN con números Rin &amp; #8805; 7 se obtiene de forma reproducible. La calidad del ARN obtenido era adecuado para tipo de células específicas de ARN-Seq, lo que lleva a la identificación de 236 genes expresados ​​en la célula huevo apomictic pero no en la célula apomictic central, célula synergid, o célula inicial apomíctica, ni en las células o la gametofito sexual madura de Arabidopsis thaliana (Figura 5) 7. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig1.jpg" /> Figura 1:. Esquema de las etapas del protocolo, indicando el tiempo requiere un mínimo por cada etapa de fijación de las flores o los tejidos de interés se realiza durante la noche. Al día siguiente, se inicia la incrustación, que se ejecuta durante la noche, lo que resulta en el material incrustado en el día 3 del protocolo. En el día se pueden generar 3 secciones de micrótomo a partir de muestras incluidas en bloques de cera. Las cintas de las secciones de parafina finos se montan en portaobjetos y se dejan secar durante la noche. EnSe requerirá de correo a varios días de mecanismos de palanca para obtener material suficiente para una biológica replicar. Después del aislamiento de ARN y control de calidad, la preparación de la biblioteca de ARN-Seq puede llevar a cabo para preparar el análisis del transcriptoma. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig2.jpg" /> Figura 2: Los óvulos son claramente identificables en las secciones delgadas, debido a la morfología característica del gametofito femenino (A) Dibujo esquemático del gametofito femenino maduro (tipo Polygonum) (B - C) Las secciones finas a través de óvulos que albergan gametofitos femeninos en.. divaricarpa Boechera. Los óvulos son claramente visibles. Debido a la morfología del gametofito femenino a menudo no todos los tipos de células (células de huevo: E, sinérgidas: s, Célula central: cc) son visibles en una sola sección. Las barras de escala = 50 micras. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig3.jpg" /> Figura 3. LAM de óvulos de Boechera divaricarpa. A y C. En la sección del gametofito madura de B. divaricarpa a 7 micras antes y, B y D, después de microdisección con el dispositivo de láser (óvulo: e, sinérgidas: s, célula central: cc). Las barras de escala = 50 micras. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig4.jpg" /> &lt;strong&gt; Figura 4. ARN de calidad de óvulos láser disecado y secciones de control. (A) la calidad del ARN como se analiza a partir de secciones de óvulos en comparación con (B) las áreas de tejido más grandes cosechadas a partir de las mismas diapositivas como controles. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig5.jpg" /> Figura 5. Identificación de genes expresados ​​Sólo en la célula huevo apomícticos en comparación con las células de apomícticos y sexuales gametofitos maduros o la célula inicial apomícticos. Mapa de calor de 236 genes expresados ​​en el óvulo apomictic pero ni en la célula central apomictic, célula synergid o célula inicial de apomictic B. gunnisoniana ni las células del gametofito sexual madura de A. thaliana 7 jerárquicaagrupamiento de las muestras y los genes se basa en la distancia euclídea y la agrupación de aglomeración jerárquica. El rojo denota una expresión elevada y baja expresión negro. Los colores son escaladas por fila. apo:. apomictic <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Asistida por láser microdisección (LAM) como herramienta para la transcripción de perfiles de distintos tipos de células

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

9.2K vistas.  University of Zürich & Zürich-Basel Plant Science Center. Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera. 

Video: Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Láser microdisección de captura de tejidos de mamíferos

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Investigación

Biología

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Perfiles de transcripción de los organismos unicelulares de los cardiomiocitos de ratón adulto

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Bioensayo electroantenográfico como herramienta de detección de compuestos volátiles de las plantas hospederas

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Estrategias para Anastasis Seguimiento, una célula de supervivencia Fenómeno que Invierte Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Perfilado Redox Celular Utilizando Microscopía de Alto Contenido

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...