El autor desea agradecer a Mateo Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer y Zoe Mann y para su evaluación crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por el Premio Sofja Kovalevskaya (Fundación Humbodlt) y la Universidad Johannes Gutenberg, Mainz, Alemania.

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The author declares no competing financial interests.

Cuando se prepara el tejido coclear para el análisis, hay algunos puntos clave a tener en cuenta. En primer lugar, las diferencias en el fondo genético puede modificar el fenotipo coclear, por lo que es necesario analizar y comparar sólo los controles de la misma camada. En segundo lugar, se requiere la eliminación completa de la membrana tectorial para obtener las mejores imágenes con inmunohistoquímica y es esencial para SEM. La membrana tectorial es una estructura opaca y puede oscurecer las células del epitelio sensorial directamente debajo de ella, lo que hace más difícil de formación de imágenes. De vez en cuando durante el proceso, la membrana tectoria puede contraerse de nuevo, el descubrimiento de las células ciliadas. Incluso en estos casos es muy recomendable la eliminación. Este paso requiere paciencia y práctica. En tercer lugar, la inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra las proteínas ciliares, en particular los que se localizan a la basal del cuerpo muy compactado, puede ser difícil y requerir optimización. Considere la posibilidad de llevar a cabo la recuperación de antígenos, la intensificación de la permeabilzación pasos, o la disminución de la concentración o la hora de la fijación. Por último, cuando se generan imágenes del cinocilio (el cilio primario que se encuentra en las células ciliadas de la cóclea) tener en cuenta que comienza a retraerse de P0 - P1 en adelante en un gradiente-ápex. Por lo tanto, cuando se mide la longitud de la cinocilio es importante comparar las células ciliadas de la misma región de la cóclea y en los animales de edad coincidente. Las células de apoyo intercaladas también tienen cilios primarios, que no se retraiga. Se debe tener cuidado de distinguir entre el apoyo cilios celular y cinetocilios célula de pelo. Como los ratones maduran, se hace cada vez más difícil aislar limpiamente el epitelio sensorial coclear, debido a la calcificación de los huesos temporales y laberintos óseas. Se requiere Descalcificación del tejido, que no siempre es compatible con otras técnicas de inmunolocalización pero permite el examen del fenotipo bruto y también es compatible con la preparación de SEM. str ratones consanguíneosAINS a menudo presentan defectos auditivos tales como pérdida de células ciliadas o respuestas auditivas del tronco cerebral (ABR) elevados, debido a mutaciones en genes auditivos conocidos o genes modificadores. Por lo tanto, es esencial para comparar los controles de la misma camada emparejados por edad o raza sobre un fondo genético alternativo. Una de las limitaciones de este análisis es que, en ratones, la cinocilio comienza a retraer poste nacimiento y ya no está presente en células de pelo adultos. Por esta razón mediciones cinetocilios sólo se puede hacer en el desarrollo de tejido. También es necesario seleccionar cuidadosamente los controles emparejados por edad para las comparaciones entre las muestras mutantes y de control. Otra limitación es que los ratones mutantes ciliares analizados hasta el momento no muestran disfunción auditiva severa (es decir., Respuestas auditivas del tronco cerebral, ABR o emisiones otoacústicas, OAE), incluso cuando se altera el desarrollo coclear. En consonancia con esto, los defectos de audición no son un fenotipo común ciliopathy humano. Excepcionalmente, la pérdida de hearing es una de las características principales del síndrome de Alström, causada por mutaciones en la proteína corporal basal ALMS 1 28,29. Esto sugiere que la morfología haz estereociliar no está necesariamente ligada a la disfunción auditiva en los mutantes cilios, probablemente debido a la reorientación correctivo de los paquetes más adelante en el desarrollo como ha sido reportado para los mutantes Vangl2 CKO 30. Si el espectro ciliopatía se amplió para incluir el síndrome de Usher, la causa congénita más común de ceguera-sordera, a continuación, disfunción auditiva adquiere gran relevancia. Los datos recientes han demostrado que varias proteínas relacionadas con el síndrome de Usher también se localizan en el cilio y están involucrados en procesos relacionados con ciliares-31, pero si estas proteínas se refieren a la señalización PCP aún no ha sido examinado. Hasta que sólo se han examinado vagamente ahora la mayoría de los mutantes ciliar ratón analizadas en busca de defectos PCP cocleares. Las técnicas descritas en este manuscrito permiten una extensa detalle de lafenotipo coclear, lo que sin duda dará lugar a una comprensión más precisa de la implicación ciliar en el establecimiento de la señalización PCP vertebrados. A pesar de la gran cantidad de modelos de ratón ciliopatía disponibles, sorprendentemente pocos han sido analizados en términos de defectos PCP cocleares. Un error común asociado con estos modelos es la letalidad embrionaria. Sin embargo, desde el desarrollo de la cóclea se puede examinar embriónicamente el papel de los cilios en el PCP en el oído pueden desarrollar aún por investigar. Por otra parte, la letalidad embrionaria temprana se puede evitar utilizando knockouts condicionales. Foxg1 Cre 32 ratones, disponibles de JacksonLaboratories, se utilizan comúnmente para inactivategenes de interés en thedeveloping oído interno desde la fecha E8.To, los esfuerzos se han centrado principalmente en el examen de los genes causantes de enfermedades ciliopatía Sin embargo, la exploración de otras proteínas relacionados con los cilios y cómo éstos afectan la señalización durante el desarrollo PCP puede proporcionar una mayor comprensión de CILbiología ia y función. Si un fenotipo auditivo se sospecha en los modelos de ratón que se está analizando, posibles análisis adicionales incluyen pruebas de audiometría de ABR 33 o 34 OAE. Ensayos de extensión de explante coclear (como se describe en mayo-Simera et al., 2012 25), también se pueden realizar y permiten la identificación de los defectos de la extensión convergente en los puntos de tiempo de desarrollo anteriores. El cultivo de explantes de cóclea también permite el tratamiento con diversos activadores o inhibidores de la señalización, que pueden modificar la extensión de explante, lo que contribuye a la comprensión mecanicista de los procesos de desarrollo involucradas. Aunque se sabe que el cinocilio retrae después del nacimiento 11,13,14, esta retracción no se ha abordado a fondo en el contexto de mutantes ciliares. Sería de interés para tomar mediciones en tiempo específico de emergencia cinetocilios y retracción de los cilios que mutants.Considering un papel principal para pro ciliarproteínas es el movimiento de la carga a lo largo de los microtúbulos, es muy probable que estas proteínas también pueden regular aspectos del tráfico intracelular a lo largo del citoesqueleto 35-37. Un subconjunto de proteínas cilios se ha demostrado que afectan a la trata y la localización asimétrica de moléculas PCP 8. La localización por inmunohistoquímica de moléculas de PCP, particularmente las proteínas asociadas a la membrana tales como Vangl2, Frz3 y DSH, por lo tanto, se recomienda establecer si se mislocalized moléculas PCP. Establecimiento de la polaridad parece ser un asunto multifacético, y hay una creciente evidencia de una vía adicional de la célula autónoma, que también se requiere para la correcta PCP en las células ciliadas sensoriales 38. Un trabajo reciente mostró que G de señalización dependiente de la proteína controla la migración del cilio en una celda de manera autónoma 39. Consistente con un papel de las proteínas ciliares en la localización de las moléculas de polaridad, heterotrimeric G-proteína alfa-i subunidad 3 (Gαi3) localization se interrumpe en Bbs8 y Bbs6 nocaut cóclea 8,39. Distinguir el papel de los componentes individuales ciliares y sus distintos efectos sobre la señalización PCP nos dará una mayor comprensión de la función de los cilios en el establecimiento de la polaridad correcta. De particular importancia es distinguir entre proteínas ciliares que funcionan en un contexto ciliar, frente a las funciones no ciliares de proteínas ciliares tradicionalmente consideradas, tales como su papel en la regulación de la no-ciliar relacionados con el tráfico intracelular. El alto grado de regularidad en muchos aspectos de la estructura coclear, incluyendo el patrón celular y la orientación haz estereociliar, hace que sea posible detectar cambios sutiles en el desarrollo de PCP en respuesta a cualquiera de perturbaciones genéticas o moleculares en las proteínas relacionadas con cilios. Teniendo en cuenta que hay muchos modelos de ratón ciliar disponibles, y que la cóclea del ratón en desarrollo es uno de los mejores lugares para examinar PCPde señalización, es de gran interés para conocer en qué medida las mutaciones individuales de proteínas interrumpen el desarrollo cóclea.

cilios primarios son apéndices largos basados ​​en microtúbulos que se extienden desde la superficie de la mayoría de células de mamífero. cilios primarios se confunde a menudo con cilios móviles, de los cuales siempre hay múltiples por célula, y cuya finalidad es mover fluido a través de superficies de la membrana. cilios primarios, por el contrario, adoptar funciones sensoriales y son por consiguiente también se hace referencia como cilios sensorial. Una vez en el olvido, este orgánulo ha sido recientemente &#39;redescubierto&#39; como resultado de su asociación con una multitud de enfermedades genéticas humanas 1. Idealmente posicionado como un orgánulo de señalización, el cilio primaria se ha demostrado que regulan numerosas rutas de señalización, muchas de las cuales son importantes no sólo en la homeostasis del tejido y la enfermedad, sino también durante el desarrollo 2. Una de las primeras vías de señalización demostrado estar asociadas con la disfunción cilios fue la vía de señalización Wnt no canónica, conocido también como vía de la polaridad celular plana (PCP) <sup<html> &gt; 3. Esta cascada de señalización inicialmente identificado en Drosophila, es fundamental para la embriogénesis; en particular para los procesos de convergencia y de extensión y para la orientación correcta de las células en el plano de los epitelios 4. La señalización secuencial de un conjunto básico de proteínas reguladoras traduce las señales direccionales que en última instancia conducen a reordenamientos del citoesqueleto y dan como resultado la polarización coordinada de las células epiteliales en un plano 5. El proceso de convergencia y la extensión es absolutamente necesario para el conducto coclear para alargar y para el correcto patrón celular 6. Como esto se regula a través de la activación de la vía de PCP, uno de los fenotipos más llamativos de mutantes PCP cóclea es un conducto coclear acortado con epitelios sensoriales desorganizado 7. Del mismo modo, los mutantes de ratón, que carecen de cilios, también presentan una convergencia y la extensión fenotipo tan 8,9, aunque precisamente cómo esto está regulado aún no se ha dilucidado. ve_content &quot;&gt; Debido a que los procesos de convergencia y de extensión son críticos para la derivación del conducto coclear, y el patrón celular de los epitelios sensoriales dentro del conducto coclear, la cóclea en desarrollo es un órgano ideal en el que para examinar la señalización de PCP durante el desarrollo de los vertebrados. El órgano de Corti, el término dado al epitelio sensorial especializado que recubre el conducto coclear, está compuesto por células de soporte no sensoriales y las células ciliadas mechanosensory que deben ser orientados de manera uniforme para la cóclea para funcionar 10. las células ciliadas mechanosensory se llama así debido a la manojos estereociliar que se extienden desde la placa cuticular (superficie apical) de cada una de las células ciliadas sensoriales 11. Estos actúan como transductores primarios de mechanosensation ya pesar de su nomenclatura como estereocilios, en realidad están compuestas por microvellosidades a base de filamentos de actina modificado. Dentro de cada pelo en forma de V haz, tres filas de estereocilios se organizan en un pa altamente ordenada y regular,ttern caso de una manera similar a la escalera. Cilios real basado en los microtúbulos, cinetocilios llamados, son necesarios para el desarrollo y orientación de los haces estereociliar 12. Sobre cada célula de pelo, una sola cinocilio está unido físicamente al haz estereocilios, centralmente situada adyacente a la fila más alta de estereocilios. La función precisa de la cinocilio no está claro, y una hipótesis es que la cinocilio &#39;tira&#39; los estereocilios en forma a medida que maduran desde microvellosidades 12. En los vertebrados, cinetocilios en la cóclea solamente están presentes de forma transitoria y se retraen de las células pilosas en los ratones antes de la aparición de la audición 11,13,14. La pérdida completa de los cilios en los resultados en desarrollo cóclea en conductos cocleares acortar gravemente, mal formado y mal orientada haces estereociliar, así como los cuerpos basales mis-posicionado 8,9. Un cilio funcional no es sólo formaba parte del axonema ciliar. Muchas proteínas asociadas con los ciliosse producen en función de los complejos localizados en subdominios cilios afines, como la basal del cuerpo, zona de transición, o axonema ciliar 15. El cuerpo básica, derivada del centríolo madre del centrosoma, es también un centro organizador de microtúbulos por los microtúbulos se extienden lejos del cilio en el cuerpo celular y puede regular el tráfico intracelular, así como el tráfico ciliar. La zona de transición ciliar es otra región donde la función ciliar se regula en función de la organización de importación y exportación de compuestos ciliares 16. Múltiples estudios han identificado una conexión entre los cilios y Wnt no canónica (de señalización PCP), aunque el mecanismo exacto no está claro 17. La redundancia de ciliares y PCP genes y la sensibilidad de la polaridad celular a anormalidades celulares generalizadas, hacen que sea difícil para enlazar directamente a una mutación específica déficit de PCF. Una de las salidas de lectura de la señalización de PCP es el posicionamiento del cuerpo basal y primarcilio y, por lo tanto, la segregación de la primaria de los defectos secundarios es un reto. Algunos estudios en el pez cebra y el ratón mutantes han sugerido ninguna conexión entre cilios y la señalización Wnt 18-20. Las discrepancias en los datos siempre son representativas de las especies, tejidos, o las diferencias temporales que dependen de las contribuciones ciliares hacia la señalización de Wnt. Además, la capacidad de respuesta normal de Wnt podría ser retenida si cuerpos basales siguen siendo funcionales. Una comprensión más profunda de la función de las proteínas ciliares en vías de señalización celular y otros fenómenos biológicos es crucial para nuestra comprensión de la biología celular y del desarrollo, así como para el desarrollo de estrategias de tratamiento dirigidas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tools/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomere - Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028-5EA</td>
			<td>See Note 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors-straight blade</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope.</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uncoated glass microscope slides</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slips (22 mm &#215; 40 mm &#215; 0.15 mm)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins</td>
			<td>&#160;Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM sample holder</td>
			<td>tousimis</td>
			<td>8762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscopy studs</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs: Carbon adhesive</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16084-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe Tissue&#160;</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Paint Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160; (PFA) (EM Grade Required for EM)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 4% solution in 1&#215; PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Glutaraldehyde Grade1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 7.5)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl 2</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting media</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215; Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>14065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide (OsO4 )</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Fluka Analytical</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Arl13b</td>
			<td>Protein Tech</td>
			<td>17711-1-AP</td>
			<td>Suggested concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti acetylated tubulin (611-B1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6793</td>
			<td>Suggested concentration 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti gamma tubulin (GTU-88)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6557</td>
			<td>Suggested concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Zo_1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>40-2300</td>
			<td>Suggested concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin VI</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6791</td>
			<td>Suggested concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin VIIa</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td>Suggested concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Vangl2</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>ABN373</td>
			<td>Suggested concentration 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti G&#945;i3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4040</td>
			<td>Suggested concentration 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Suggested concentration 1:300-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 568 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Suggested concentration 1:300-1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of planar-cell-polarity phenotypes in ciliopathy mouse mutant cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

La disección y la cóclea Preparación del tejido Después de la eliminación del cerebro, puesto línea media disección sagital de una cabeza P0 ratón, el laberinto óseo, visto desde atrás, puede ser visualizado (Figura 1A, flecha blanca) y se retira. La Figura 1B muestra los laberintos óseas aisladas con el cabello coclear mirando hacia arriba, ventral, (izquierda) y por detrás, dorsal (derecha). La flecha blanca a la ventana oval de la cual uno puede empezar a retirar el cartílago exterior. Una vez que el cartílago externa se ha eliminado por completo, el conducto coclear expuesta, aún intacto, se puede observar (Figura 1C). se muestra de posicionamiento de un perno a través de la región vestibular para ayudar a la disección. Dos pines, colocados en diferentes ángulos se pueden también utilizar para anclar el tejido. La Figura 1D muestra el conducto coclear después de la eliminación de la Reissner &#39;; S de la membrana y la membrana tectoria (izquierda) y el aislado espiral coclear epitelial una vez que se ha aislado de la región vestibular en preparación para el montaje para inmunohistoquímica (derecha). Para dar una idea general de lo que el pelo cocleares expuestos parece, una preparación SEM intacta se muestra en la Figura 1E. Morfología e inmunofluorescencia en el control de la cóclea Después de la preparación del tejido coclear, la superficie dorsal del conducto coclear que contiene el órgano de Corti se expone y puede sido visto a través de SEM o la tinción de inmunofluorescencia. Visto como todo el montaje en una preparación, las cuatro filas de células ciliadas mechanosensory (una fila de células ciliadas internas y tres hileras de células ciliadas externas) pueden distinguirse. La figura 2A muestra una vista bajo aumento de la espira basal de una cóclea de embriones de ratón , f preparadoo SEM. Observe la orientación uniforme y la alineación de los haces de estereociliar basado en actina. Además la morfología de los haces estereociliar es consistente, cada haz tiene la forma clásica &quot;)&quot; (en las células ciliadas internas) o &quot;W&quot; (en las células ciliadas externas). Tras la ampliación de más cerca a esta edad microvellosidades adicionales se pueden ver no solamente en la superficie apical de las células ciliadas, sino también en medio de las células ciliadas en las células de apoyo (Figura 2B). Estos irán desapareciendo dejando sólo tres filas de haces de estereociliar sobre las células ciliadas externas y dos en las células ciliadas internas en los adultos. Como puede verse en la Figura 2C (flecha blanca), una sola cinocilio basado en microtúbulos (un verdadero cilio primario) se encuentra adyacente a la fila más alta de estereocilios en el vértice de cada haz estereociliar. Estos se adjuntan al paquete a través de enlaces cinetocilios. etiquetado fluorescente con faloidina, que laboratorioels actina, se destaca la orientación y la forma uniforme de los haces de tejido de control (Figura 2D). actina cortical también se etiqueta, que es útil para determinar la circunferencia apical de cada célula de pelo individual. Co-etiquetado con faloidina y un anticuerpo contra la miosina 7a (Figura 2E), un marcador de células de cabello, también ayuda a diferenciar entre células pilosas y células de soporte. La miosina 7a es también un marcador útil para la medición de la extensión del conducto coclear (véase la Figura 3A). Un anticuerpo contra acetilada-α-tubulina se utiliza comúnmente para identificar la cinocilio basado en microtúbulos (Figura 2F). Como las células de apoyo también albergan cilios primarios, es importante distinguir entre los cilios que emanan de las células ciliadas vs. intercalantes células de apoyo. Un marcador de membrana adicional, como anticuerpos contra ZO-1 (Zona occludens 1), que describe claramente el patrón de mosaico de la membrana apical del conducto coclear, es por lo tanto útil (&lt;strong&gt; Figura 2F). De mayor consideración es que los anticuerpos contra acetilado-α-tubulina también etiquetar los microtúbulos internos y por lo tanto se debe tener cuidado al tomar las imágenes para centrarse en la superficie apical de las células ciliadas. Los microtúbulos en las células pilares son particularmente densa (Figura 2G, asterisco blanco). Una combinación de faloidina y etiquetado anti-acetilada-α-tubulina a menudo se utiliza para identificar simultáneamente haces estereociliar y cinetocilios vecinos (Figura 2G, flecha blanca). Fenotipo coclear en Cilia Mutantes Alargamiento del conducto coclear es una de las mejores salidas de lectura de la convergencia y de extensión defectos, y los conductos cocleares acortadas se observan comúnmente en mutantes PCP clásicos. La cóclea en los mutantes ciliares a menudo han acortado conductos cocleares y muestran una marcada ampliación de la epithe sensoriallia en el vértice, como se puede observar en IFT20 cko / cko ratones (Figura 3A). Otro defecto PCP clásica es la interrupción de la orientación uniforme de las células ciliadas cocleares, como puede verse en las Bbs8 - / - ratones tanto con inmunohistoquímica (Figura 3B, flecha derecha) y con SEM (Figura 3C). Además de los paquetes mis-orientados, aplanados y paquetes deformes también son comúnmente observados (Figura 3B, flecha central; Figura 3D). Muchas veces circulares haces, como se puede ver en la Figura 3E, están presentes, especialmente en células de pelo completamente desprovisto de cinetocilios. Mala localización de la cinocilio también es común. El cinocilio mis-localizada puede o no puede estar unido al haz estereociliar (Figura 3B, flecha hacia la izquierda; la Figura 3F). Los ejemplos de la forma de cuantificar buorientación y cinetocilios ndle o posicionamiento haz se muestran en la Figura 3G y 3H. La orientación de cada haz individuo entonces se puede evaluar mediante la determinación de la rotación de la de relativa paquete a una línea que se extiende perpendicular a la fila de celdas pilar que separa las células ciliadas internas y externas. Las células con una orientación normal están alineados a lo largo de este eje perpendicular y así tener una rotación de 0 ° (Figura 3G). La posición de la cinocilio, o centro del haz estereociliar, se puede trazar mediante la superposición de una cuadrícula de posición en la superficie luminal de las células ciliadas y luego determinar la localización de los cinetocilios o paquete dentro de la red (Figura 3I). Las mutaciones en genes cilios a menudo afectan a la longitud cilios, y así la longitud de la cinocilio se pueden evaluar. En CEP290 mutantes rd16 / rd16, cinetocilios son más largos que en los controles (Figura 3J). A medida que se retrae la cilio,es fundamental contar con emparejados por edad compañeros de camada y tomar mediciones de la misma región de la cóclea. Para obtener buenas imágenes para el análisis y la cuantificación, por tanto inmunohistoquímica y SEM, es fundamental para eliminar la membrana tectoria. Figura 3F muestra una micrografía SEM en la que la membrana tectoria no se ha eliminado por completo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53559/53559fig1.jpg" /> Figura 1. Disección de un desarrollo del ratón cóclea (P0). (A) de la línea media sagital disección de la cabeza del ratón P0 con el cerebro removido. La flecha blanca indica la posición del laberinto óseo. (B) ventral (izquierda) y dorsal (derecha) puntos de vista de laberintos óseas disecados. La cóclea está situado hacia la parte superior con la parte vestibular en los puntos de flecha blanca inferiores a la ventana oval. (C) La popa laberinto óseoeliminación er del cartílago exterior de la cóclea. Un pasador se ha colocado a través del sistema vestibular. (D) Izquierda, misma vista que en C después de la eliminación de la membrana de Reissner la membrana y tectoria. Derecha, aislado conducto coclear listo para el montaje. Micrografía electrónica (E) de exploración de una espiral coclear intacto, expuesta exponiendo el piso del conducto coclear, incluyendo el epitelio sensorial. La barra de escala es de 100 micras. . (A - D) adaptado de mayo-Simera et al, 2012 25 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53559/53559fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53559/53559fig2.jpg" /> Figura 2. Morfología e inmunofluorescencia en el control de la cóclea (A - C). Micrografías electrónicas de barrido de la tur basaln en embrionaria (E18.5) cochleae salvaje tipo. Una fila de células internas del pelo (abajo) y tres hileras de células ciliadas externas (arriba) se separan y se intercala por las células de apoyo. haces estereociliar en forma de Chevron uniformemente orientan hacia el borde lateral de cada célula de pelo (borde superior de la imagen). En E18.5 microvellosidades adicionales cubren las superficies apicales de las células ciliadas, por debajo de los haces de estereociliar, y células de apoyo intercaladas (B). (C) A cinocilio única basada en microtúbulos (flecha blanca), se encuentra en el vértice del haz, que se muestra aquí desde el borde lateral. (D - G) tinción de inmunofluorescencia de vuelta basal postnatal día 1 (P1) de tipo salvaje cócleas. Faloidina etiquetas de actina filamentosa en los estereocilios y la actina cortical en la periferia de la célula (D, E, G). Miosina 7a es un marcador para las células ciliadas internas y externas (E). Zo_1 etiquetas de las uniones estrechas entre las células en, por lo que es un buen marcador para distinguir bounda celularRies (F). Acetilado α-tubulina se utiliza como un marcador para la cinocilio en el vértice del haz (F, G flecha blanca). Microtúbulos internos también son etiquetados por acetilado α-tubulina, que son especialmente abundantes en las células pilar (G asterisco blanco). Barras de escala A: 10 m, B: 5 micras, C: 1 m, DG:. 5 micras <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53559/53559fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53559/53559fig3.jpg" /> Figura 3. coclear fenotipo de los mutantes Cilia. (A) marcado acortamiento de IFT20 cko / cko conductos cocleares en comparación con el control. conductos cocleares disecados en E18.5 teñidas con tubulina acetilada. (B </strong&gt;) Total de montaje de imágenes a su vez coclear basal en Bbs8 - / - mutante (P0). Faloidina marcada con actina filamentosa, estereocilios (rojo), la tubulina acetilada, cinetocilios (verde). Manojos estereociliar en Bbs8 - / - cócleas se giran de forma variable (flecha derecha), aplanados y / o mislocalized (flecha central). Cinetocilios se mislocalized o axonemes faltan (flecha izquierda). (C - F) Mayor aumento SEM de paquetes estereociliar y cinetocilios en Bbs8 - / - CCE. En C, giran paquetes, en D, aplanados paquete, en E, haces circulares y en fa mislocalized cinetocilios. (G - I) Las representaciones esquemáticas de cuantificación anormalidad paquete. (G) Izquierda, Bulto convexidad (altura); la distancia más corta entre el vértice del haz y la línea que se extiende a través de ambos extremos del haz de &quot;brazos&quot;. como depicted por la línea de negro sólido. Derecho, el área bajo el bulto; la zona. (H) Las representaciones esquemáticas de los criterios utilizados para cuantificar la orientación de los haces estereociliar. El ángulo de rotación del haz se calcula en relación a una línea que se extiende perpendicular a la fila de celdas pilar. (I) Representación esquemática de los criterios para el análisis posicional de cinetocilios y haces de estereociliar. Una rejilla segmentado se coloca sobre la circunferencia de la célula de pelo y la posición observó. (J) la imagen a mayor aumento de los haces con faloidina marcada con estereocilios (rojo) y cinetocilios tubulina acetilada marcada con (verde) de las células ciliadas externas de la cóclea P0. En el panel monocromática adyacente, líneas rojas identifican los cinetocilios, que son más largos en Cep29 mutantes rd16 / rd16 comparación con el control (flechas blancas). (K) Micrografía SEM de la cóclea embrionaria con la eliminación incompleta de la membrana tectoria. EscalaUn bares: 100 m, B: 5 micras, C - F: 2,5 m, I: 5 micras, J: 50 micras. (A - F)... Modificada a partir de mayo-Simera et al, 2015 8, J Reimpresión con permiso de Rachel y col, 2012 27 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53559/53559fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Evaluación de planar-Cell-polaridad fenotipos en ciliopatía ratón mutante cóclea

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

evaluation-planar-cell-polarity-phenotypes-ciliopathy-mouse-mutant

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.3K vistas.  Johannes Gutenberg-Universität Mainz. Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Video: Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold standard" method for assessing insulin action in vivo. During an insulin clamp, hyperinsulinemia is achieved by a constant insulin infusion. Euglycemia is maintained via a concomitant glucose infusion at a variable rate. This variable glucose infusion rate (GIR) is determined by measuring blood glucose at brief intervals throughout the experiment and adjusting the GIR accordingly. The GIR is indicative of whole-body insulin action, as mice with enhanced insulin action require a greater GIR. The insulin clamp can incorporate administration of isotopic 2[14C]deoxyglucose to assess tissue-specific glucose uptake and [3-3H]glucose to assess the ability of insulin to suppress the rate of endogenous glucose appearance (endoRa), a marker of hepatic glucose production, and to stimulate the rate of whole-body glucose disappearance (Rd).
The miniaturization of the insulin clamp for use in genetic mouse models of metabolic disease has led to significant advances in diabetes research. Methods for performing insulin clamps vary between laboratories. It is important to note that the manner in which an insulin clamp is performed can significantly affect the results obtained. We have published a comprehensive assessment of different approaches to performing insulin clamps in conscious mice1 as well as an evaluation of the metabolic response of four commonly used inbred mouse strains using various clamp techniques2. Here we present a protocol for performing insulin clamps on conscious, unrestrained mice developed by the Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu/mmpc). This includes a description of the method for implanting catheters used during the insulin clamp. The protocol employed by the Vanderbilt MMPC utilizes a unique two-catheter system3. One catheter is inserted into the jugular vein for infusions. A second catheter is inserted into the carotid artery, which allows for blood sampling without the need to restrain or handle the mouse. This technique provides a significant advantage to the most common method for obtaining blood samples during insulin clamps which is to sample from the severed tip of the tail. Unlike this latter method, sampling from an arterial catheter is not stressful to the mouse1. We also describe methods for using isotopic tracer infusions to assess tissue-specific insulin action. We also provide guidelines for the appropriate presentation of results obtained from insulin clamps.

The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is the gold standard for assessing insulin action in vivo. A method for performing insulin clamps in mice is described. This includes a method for arterial catheterization that permits experiments to be performed in conscious, unrestrained mice with minimal stress.

Hiperinsulinémico euglucémico abrazaderas en ratones conscientes, sin freno

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold ...

Investigación

Medicina

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

Spinal cord injury (SCI) is often accompanied by osteoporosis in the sublesional regions of the pelvis and lower extremities, leading to a higher frequency of fractures 1. As these fractures often occur in regions that have lost normal sensory function, the patient is at a greater risk of fracture-dependent pathologies, including death. SCI-dependent loss in both bone mineral density (BMD, grams/cm2) and bone mineral content (BMC, grams) has been attributed to mechanical disuse 2, aberrant neuronal signaling 3 and hormonal changes 4. The use of rodent models of SCI-induced osteoporosis can provide invaluable information regarding the mechanisms underlying the development of osteoporosis following SCI as well as a test environment for the generation of new therapies 5-7 (and reviewed in 8). Mouse models of SCI are of great interest as they permit a reductionist approach to mechanism-based assessment through the use of null and transgenic mice. While such models have provided important data, there is still a need for minimally-invasive, reliable, reproducible, and quantifiable methods in determining the extent of bone loss following SCI, particularly over time and within the same cohort of experimental animals, to improve diagnosis, treatment methods, and/or prevention of SCI-induced osteoporosis.
An ideal method for measuring bone density in rodents would allow multiple, sequential (over time) exposures to low-levels of X-ray radiation. This study describes the use of a new whole-animal scanner, the IVIS Lumina XR (Caliper Instruments) that can be used to provide low-energy (1-3 milligray (mGy)) high-resolution, high-magnification X-ray images of mouse hind limb bones over time following SCI. Significant bone density loss was seen in the tibiae of mice by 10 days post-spinal transection when compared to uninjured, age-matched control (na&iuml;ve) mice (13% decrease, p&lt;0.0005). Loss of bone density in the distal femur was also detectable by day 10 post-SCI, while a loss of density in the proximal femur was not detectable until 40 days post injury (7% decrease, p&lt;0.05). SCI-dependent loss of mouse femur density was confirmed post-mortem through the use of Dual-energy X-ray Absorptiometry (DXA), the current "gold standard" for bone density measurements. We detect a 12% loss of BMC in the femurs of mice at 40 days post-SCI using the IVIS Lumina XR. This compares favorably with a previously reported BMC loss of 13.5% by Picard and colleagues who used DXA analysis on mouse femurs post-mortem 30 days post-SCI 9. Our results suggest that the IVIS Lumina XR provides a novel, high-resolution/high-magnification method for performing long-term, longitudinal measurements of hind limb bone density in the mouse following SCI.

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

A longitudinal examination of bone loss in the femurs and tibiae of adult mice was performed following spinal cord injury using sequential low-dose X-ray scans. Tibia bone loss was detected throughout the study, while bone loss in the femur was not detected until 40 days post injury.

Evaluación longitudinal de ratón posteriores pérdida de masa ósea del miembro después de una lesión de la médula espinal utilizando Novel, En vivo Metodología

Spinal cord injury (SCI) is often accompanied by osteoporosis in the sublesional regions of the pelvis and lower extremities, leading to a higher ...

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Stroke is the third cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic stroke accounts for approximately 80% of all strokes. However, the thrombolytic tissue plasminogen activator (tPA) is the only treatment of acute ischemic stroke that exists. This led researchers to develop several ischemic stroke models in a variety of species. Two major types of rodent models have been developed: models of global cerebral ischemia or focal cerebral ischemia. To mimic ischemic stroke in patients, in whom approximately 80% thrombotic or embolic strokes occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), the intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is quite relevant for stroke studies. This model was first developed in rats by Koizumi et al. in 1986 1. Because of the ease of genetic manipulation in mice, these models have also been developed in this species 2-3.
	Herein, we present the transient MCA occlusion procedure in C57/Bl6 mice. Previous studies have reported that physical properties of the occluder such as tip diameter, length, shape, and flexibility are critical for the reproducibility of the infarct volume 4. Herein, a commercial silicon coated monofilaments (Doccol Corporation) have been used. Another great advantage is that this monofilament reduces the risk to induce subarachnoid hemorrhages. Using the Zeiss stereo-microscope Stemi 2000, the silicon coated monofilament was introduced into the internal carotid artery (ICA) via a cut in the external carotid artery (ECA) until the monofilament occludes the base of the MCA. Blood flow was restored 1 hour later by removal of the monofilament to mimic the restoration of blood flow after lysis of a thromboembolic clot in humans. The extent of cerebral infarct may be evaluated first by a neurologic score and by the measurement of the infarct volume. Ischemic mice were thus analyzed for their neurologic score at different post-reperfusion times. To evaluate the infarct volume, staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) was usually performed. Herein, we used cresyl violet staining since it offers the opportunity to test many critical markers by immunohistochemistry. In this video, we report the MCAO procedure; neurological scores and the evaluation of the infarct volume by cresyl violet staining.

The intraluminal middle cerebral occlusion model in mice is herein presented. The extent of cerebral infarct is evaluated by a neurologic score and cresyl violet staining, an alternative staining to TTC, offering the great advantage to test in parallel many interest markers.

Modelo de ratón de MCAO intraluminal: Evaluación del infarto cerebral mediante tinción con violeta de cresilo

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Un sencillo método de intubación ratón de pulmón

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Evaluación de pulmón metástasis en el ratón mamarias modelos tumorales mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, primarily in the hip and knee joints, which results in significant impacts on patient mobility and quality of life. To date, there are no existing curative therapies for OA able to slow down or inhibit cartilage degeneration. Presently, there is an extensive body of ongoing research to understand OA pathology and discover novel therapeutic approaches or agents that can efficiently slow down, stop, or even reverse OA. Thus, it is crucial to have a quantitative and reproducible approach to accurately evaluate OA-associated pathological changes in the joint cartilage, synovium, and subchondral bone. Currently, OA severity and progression are primarily assessed using the Osteoarthritis Research Society International (OARSI) or Mankin scoring systems. In spite of the importance of these scoring systems, they are semiquantitative and can be influenced by user subjectivity. More importantly, they fail to accurately evaluate subtle, yet important, changes in the cartilage during the early disease states or early treatment phases. The protocol we describe here uses a computerized and semiautomated histomorphometric software system to establish a standardized, rigorous, and reproducible quantitative methodology for the evaluation of joint changes in OA. This protocol presents a powerful addition to the existing systems and allows for more efficient detection of pathological changes in the joint.

The current protocol establishes a rigorous and reproducible method for quantification of morphological joint changes that accompany osteoarthritis. Application of this protocol can be valuable in monitoring disease progression and evaluating therapeutic interventions in osteoarthritis.

Evaluación histomorfométrica estandarizada de la osteoartritis en un modelo de ratón quirúrgico

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining endocochlear potential, ion transport, and fluid balance. Different forms of hearing disorders are reported to involve abnormal microcirculation in the cochlea. Investigation of how cochlear blood flow (CoBF) pathology affects hearing function is challenging due to the lack of feasible interrogation methods and the difficulty in accessing the inner ear. An open vessel-window in the lateral cochlear wall, combined with fluorescence intravital microscopy, has been used for studying CoBF changes in vivo, but mostly in guinea pig and only recently in the mouse. This paper and the associated video describe the open vessel-window method for visualizing blood flow in the mouse cochlea. Details include 1) preparation of the fluorescent-labeled blood cell suspension from mice; 2) construction of an open vessel-window for intravital microscopy in an anesthetized mouse, and 3) measurement of blood flow velocity and volume using an offline recording of the imaging. The method is presented in video format to show how to use the open window approach in mouse to investigate structural and functional changes in the cochlear microcirculation under normal and pathological conditions.

An open vessel-window approach using fluorescent tracers provides sufficient resolution for cochlear blood flow (CoBF) measurement. The method facilitates the study of structural and functional changes in CoBF in mouse under normal and pathological conditions.

Medición del flujo sanguíneo auricular en cóclea de ratón utilizando una ventana de vaso abierto y microscopía de fluorescencia intravital

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. Dysregulated glucose metabolism is an important manifestation of the disease and is the key to its pathogenesis. Therefore, studies involving evaluation of glucose metabolism in PCOS are of utmost importance. Very few studies have quantified hepatic glucose production directly in PCOS models using non-radioactive glucose tracers. In this study, we discuss step-by-step instructions for the quantification of the rate of hepatic glucose production in a PCOS mouse model by measuring M+2 enrichment of [6,6-2H2]glucose, a stable isotopic glucose tracer, via gas chromatography - mass spectrometry (GCMS). This procedure involves creation of stable isotopic glucose tracer solution, use of tail vein catheter placement and infusion of the glucose tracer in both fasting and glucose-rich states in the same mouse in tandem. The enrichment of [6,6-2H2]glucose is measured using pentaacetate derivative in GCMS. This technique can be applied to a wide variety of studies involving direct measurement of the rate of hepatic glucose production.

This study describes the direct measurement of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model by using a stable isotopic glucose tracer via tail vein in both fasting and glucose-rich states in tandem.

Evaluación de la producción hepática de glucosa en un modelo de ratón con síndrome de ovario poliquístico

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

Evaluación fisiopatológica de la retina en un modelo de rata

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to detect drug exposure. The rat blood sampling method determines the quality of the plasma and further affects the precision of the test results. The subclavian vein blood collection method described in this protocol collects blood samples repeatedly in the conscious state of animals to meet the needs of PK and TK tests. The skills of restraint handling and appropriate procedure of needle incision ensure the success rate of blood collection. It is easy to operate while ensuring the quality of plasma and at the same time catering to animal welfare. However, this method requires skilled operation, and an improper one may cause animal weakness, pain, lameness, and even mortality. The current method has been used in the testing facility for a 4-week oral toxicity study in Sprague Dawley (SD) rats with TK. The maximum amount of blood collected within 24 h did not exceed 20% of the animal's total blood. The animals' body weight was more than 200 g for males and females. The data showed that the animals' bodyweight increased steadily every week, and the clinical observation was normal after repetitive sample collection.

The present protocol describes a simple and efficient method for collecting blood from the subclavian vein in rats. It enables rapid, timely, and easily identifiable sampling without anesthesia and obtains high-quality blood through repetitive sample collection.

Muestreo repetitivo de sangre de la vena subclavia de rata consciente

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...