Nos gustaría dar las gracias a Alex Hitchen y Meg stand por su ayuda con los ensayos de apareamiento. Este trabajo fue apoyado por NERC subvención NE / H015604 / 1 al TP.

1. Preparación de Alimentos Fly con colorante de alimentos <ol><li> Tomar un vial estándar Drosophila con aproximadamente 20 ml de la comida en la parte inferior (Figura 1). Utilice la siguiente receta para la mezcla de alimentos utilizando 1 L de agua hirviendo: 10 g de agar, 85 g de dextrosa, 60 g de harina de maíz, 40 g de levadura, y se agita durante 5 min de cocer a fuego lento. Añadir 25 ml de 10% nipagen una vez que la mezcla se ha enfriado a 75 ° C. </li><li> Después de la comida se ha enfriado y solidificado añadir dos gotas (aproximadamente 0,5 a 1 ml) de colorante azul de la parte superior de la comida y se extienden por toda la superficie del vial (Figura 1). Utilice un tinte de color diferente, si se prefiere. </li><li> Deje la comida durante dos días en la nevera para que el colorante es absorbido por la capa superior de los alimentos; esto evita el exceso de humedad dañar las moscas durante el período de maduración. Añadir un pequeño trozo de papel de seda, si la humedad excesiva sigue siendo un problema para secar la humedad extra y, posteriormente,removerlo. </li><li> Transferencia vuela sobre el alimento, ya sea de forma individual o en grupos. Nota: Las moscas ganarán tinción intestinal dentro de 1 día de ser colocado en la comida. Alternativamente, madurar plenamente las moscas en la comida teñido antes del experimento (aumento de la mortalidad durante el período de maduración no se observó a partir de la exposición al colorante alimenticio). </li><li> Compruebe que las moscas teñidos pueden distinguirse fácilmente de las moscas no teñidos. Si no pueden distinguirse, repita los pasos 1.1 a 1.4 utilizando una mayor concentración de colorante, o un colorante diferente. </li></ol> 2. Dos ensayos de apareamiento masculino el uso de alimentos para colorear <ol><li> Para la producción de progenie, configurar varios viales que contienen pares de moscas hembras y machos (pequeños grupos de hombres y mujeres también son adecuadas, aunque tenga cuidado para evitar el hacinamiento de las larvas). Permita que las hembras pongan huevos y se mueven las moscas a los nuevos viales cada 5-7 días. Guarde los viales a una temperatura adecuada para la especie de interés (22 ° C fo D. pseudoobscura y D. subobscura y 25 ° C para D. melanogaster). </li><li> Antes de recoger las moscas experimentales eliminan todas las moscas de los viales de concentración en un tiempo determinado antes de recoger los machos y hembras para asegurar que serán vírgenes (D. melanogaster - 6 horas a 25 ° C, D. pseudoobscura - 18 horas a 22 ° C, y D. subobscura - 24 horas a 22 ° C). Nota: si las moscas no son virgen este sesgo voluntad de su comportamiento en los ensayos de apareamiento 15. <ol><li> Tienda y macho maduro individualmente en 75 x 20 mm viales de plástico estándar (que contiene ~ 20 ml de alimento). Esto evita los impactos negativos en el comportamiento de apareamiento masculino y fitness visto en algunas especies cuando los machos se mantienen en grupos de 16. </li><li> Exponga la mitad de los varones para el tratamiento deseado (CO 2 anestesia en este caso). Use un tapete CO 2 o toque para exponer las moscas durante el tiempo requerido. Media tienda del males en cada tratamiento en los alimentos de color hasta que el apareamiento tiene lugar. Esto hará que sean visualmente distinguibles durante los ensayos de apareamiento. </li><li> Para la transferencia de moscas utilizan un aspirador 17. Etiqueta de cada vial para identificar tanto el tratamiento y el estado de color de la masculina. Aquí, utilizar cuatro tratamientos (anestesia, no coloreado = G-NC, anestesia, color = GC, sin anestesia, no coloreado, NG-NC, y sin anestesia, coloreado, NG-C). </li></ol></li><li> Traslado hembras recién emergidas en viales de alimentos frescos a madurar como grupos de 10. </li><li> Permitir moscas maduren a la edad de apareamiento (D. melanogaster - 3 días, D. pseudoobscura - 5 días, D. subobscura - 7 días 18 tienda moscas a una temperatura adecuada para la especie en estudio (por ejemplo, 22 ° C para D. . pseudoobscura y D. subobscura y 25 ° C para D. melanogaster). </li><li> Mueva las hembras a viales individuales (containing ~ 20 ml de alimento) 1 día antes de la prueba de apareamiento para la aclimatación al vial de apareamiento. Marque estos viales a fin de que los viales se pueden diferenciar. Tenga cuidado para cegar el experimento mediante el uso de etiquetado neutro (es decir, de 1 - 150) por lo que no es posible adivinar la identidad de las moscas en cualquier vial. Nota: La persona que ponga las moscas en cada vial tendrá que conocer la identidad de las moscas colocados en cada vial, ya que se tenga en cuenta que el tratamiento estaba manchada. Sin embargo, el observador que mira el apareamiento no debe conocer su identidad. Para ello se necesitarán esto por lo menos dos experimentadores, uno de configurar y uno de observar. </li><li> Comience los ensayos de apareamiento entre 10-12 am, o en un momento que coincide con la luz que entra en el ciclo luz / oscuridad de las moscas están expuestos a (&quot;amanecer&quot; para las moscas). Añadir dos moscas macho a cada tubo de acoplamiento (que contiene una sola mosca femenino) utilizando un aspirador. Asegúrese de que los dos hombres son de diferentes tratamientos (anestesia ocontrol) y que uno tiene tinción intestinal para que sea posible diferenciarlos unos de otros, y tenga en cuenta que masculina está manchado. </li><li> Si se produce la cópula, registrar el estado del macho que se acopla (ya sea de color o no - de color). Si los ensayos tienen una duración de 2 horas, asumen la hembra no se acoplará. Nota: 2 horas es adecuado para estas especies, pero aparte de Drosophila puede necesitar más o menos tiempo. </li></ol> 3. Individual Masculino ensayos de apareamiento <ol><li> Para los ensayos individuales masculinos, repita Protocolo 2 con dos cambios: <ol><li> En el paso 2.3 no guarde los hombres en los alimentos de color. </li><li> En el paso 2.7, añadir un solo macho a cada vial. </li></ol></li><li> En el paso 2.8, registrar el tiempo se añade la marcha para el vial, el tiempo de los apareamiento comienza y la hora del apareamiento terminado deben ser registrados. A partir de estos valores, calcular el éxito de apareamiento, la latencia y duración. </li></ol> Análisis 4. Datos <ol><li> Utilice paquete estadístico adecuado para analisis. Si los datos son normales y sólo tienen dos tratamientos, utilizar pruebas t o equivalente Modelo Lineal Generalizado (GLM). Durante dos experimentos masculinos, utilizar pruebas binomiales o un GLM binomio que están disponibles en cualquier paquete básico de estadísticas. Nota: Para obtener los datos de ejemplo, todos los análisis se llevaron a cabo en R versión 3.0.3 19. </li><li> Compruebe los datos de latencia de apareamiento y duración de apareamiento de normalidad, por el trazado de histogramas de frecuencia de latencia y duración para cada tratamiento 20, y el uso de una prueba de normalidad como de Shapiro-Wilk. Si no es normal, transformarlo, o utilizar las estadísticas equivalentes no paramétricas 20. Nota: Para los datos del ejemplo de los experimentos individuales masculinos registran transformación cumplía con los requisitos de la normalidad y la igualdad de las diferencias. </li><li> Si los datos pueden ser normalizada, utilice pruebas t para examinar las diferencias entre la latencia de apareamiento y la duración de los ensayos individuales de apareamiento masculino cuando se utilizan dos tratamientos 21. Si se utilizan varios tratamientos,intentar un análisis de varianza (ANOVA) 20. Si los datos no se pueden normalizar, trate de pruebas no paramétricas equivalentes 21. </li><li> Utilice pruebas binomiales para la prueba de un efecto de cualquiera de colorante de alimentos o de CO 2 anestesia en el éxito de apareamiento de los machos que compiten 20. Si se utilizan varios tratamientos, como es el caso con los datos de ejemplo, utilizar un GLM con estructura de error binomial 21. </li><li> Para los dos ensayos masculinos en los datos de ejemplo, utilice GLM con estructuras de error binomial. Uno GLM examinó color como variable de respuesta (a color = 0 e incoloros = 1) con las especies, estado de gas, y el tratamiento de gas equipada como explicativas variables.One GLM examinado CO 2 como variable de respuesta (gaseados = 0 y no gaseados- = 1) con las especies, estado de color, y el tratamiento de gases instaladas. En cada caso, producir el modelo de máxima, y llevar a cabo la simplificación modelo basado en AIC 20. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Estos datos muestran que el impacto de la anestesia CO 2 es inconsistente entre especies, con dos de las tres especies que muestran poco impacto. Nuestros resultados sugieren etiquetado con colorante de alimentos tuvo un menor impacto en el éxito de apareamiento masculino de CO 2 anestesia para D. melanogaster. Estos experimentos demuestran que los colorantes de alimentos se pueden utilizar fácilmente y barato para las moscas de la etiqueta para ensayos de apareamiento que involucran múltiples machos. De las especies de Drosophila tres modelos examinados, solamente D. melanogaster mostró un efecto del CO 2 anestesia en el rendimiento de apareamiento en una situación de competencia. En contraste, ninguna de las especies mostró un efecto de la colección en el gas en los ensayos de apareamiento individuales en términos de latencia de apareamiento, contrariamente a los resultados previos para D. melanogaster 5. Por tanto, el efecto de la competencia podría destacar aptitud efectos más sutiles de la anestesia de CO 2, que sólo son detectablesen situaciones donde hay competencia entre machos. La exposición a la recolección temprana y un día antes del juicio, tienen un efecto negativo en la capacidad de los machos de D. melanogaster para obtener un apareamiento. Exposición dos días antes del juicio, sin embargo, no mostró ningún efecto. Tanto D. pseudoobscura y D. subobscura no mostró ningún efecto de la exposición al gas en ninguno de los ensayos. Una explicación es que D. melanogaster era vulnerable a la exposición temprana a CO 2, ya que debe ser recogido antes en la vida (0-6 horas de edad) que las otras especies para asegurar los machos son vírgenes. Por lo tanto masculina D. melanogaster de esta edad puede ser más sensible como la cutícula de la mosca todavía se está endureciendo, en comparación con las otras especies que han tenido más tiempo para su cutícula a endurecerse. En general, esto apoya la idea de que los efectos del CO 2 anestesia son especies específicas y los investigadores deben probar adecuadamente el efecto en sus especies objetivo. Currently, la mayoría de los trabajos sobre el efecto del CO 2 anestesia se ha realizado en Drosophila melanogaster 5,11,22 y por lo tanto pueden no ser apropiados para aplicar a otras especies relacionadas. El método no invasivo alternativa presentada para diferenciar las moscas es colorante alimenticio. Los resultados sugieren que este tratamiento no tuvo efecto en el otro lado de todas las especies examinadas. Sin embargo, aunque su uso ha sido satisfactoria en el suministro de un marcador barato y fácilmente visible para distinguir entre los individuos debe tenerse en cuenta que el colorante era más fácil de distinguir en D. pseudoobscura y D. subobscura que en D. melanogaster. Anterior autores han utilizado varios colores (rojo, verde y azul) 4,6. Encontramos coloración azul que es el más fácil de distinguir en todas las especies, en particular D. pseudoobscura y D. subobscura. El uso de varios colores que potencialmente permitir experimentos más complejos con muchos flie marcados individualmentes. Sin embargo, las pruebas preliminares de diferentes tintes son esenciales, ya que algunos colorantes alimentarios no pueden colorear las moscas, posiblemente, ser digerido cuando se consume. Otros colorantes pueden tener efectos tóxicos y reducir la supervivencia de las moscas, y deben evitarse 14). Métodos de coloración de alimentos alternativos que utilizan las manchas más caras también se han utilizado para examinar la integridad intestinal para D. melanogaster 23. Estos pueden ser una alternativa, aunque más caro, método de teñido 23. El método de tintura es tan rápido como el CO 2 recorte de alas como las moscas se pueden almacenar en la comida teñido de la colección. La absorción de la comida fue rápida (~ 3 h), de modo de almacenamiento de O / N en la comida de color también sería suficiente para marcar moscas, tal como se utiliza en otros estudios 6. Sin embargo, la duración de la coloración es relativamente corto (~ 4 - 5 horas) en comparación con el recorte ala (permanente) o polvo fluorescente marcado (10 - 12 días), 24. Como especie Drosophilavarían en apariencia, diferentes tintes serán más o menos eficaces para las diferentes especies, y como algunas cepas (por ejemplo, los mutantes knock-out) pueden ser vulnerables a los cambios en la dieta, cualquier uso de tinte requiere una prueba preliminar de su eficacia sobre todo si ya La exposición prolongada a los tintes pueden ser tóxicos 14. En contraste con el estudio de Kalaw et al. 14, no encontramos una mortalidad significativa después del almacenamiento durante varios días en los alimentos de colores para D. melanogaster (3 días), D. pseudoobscura (5 días), o D. subobscura (7 días), probablemente debido a la diferencia de colorante utilizado. El paso crítico para el uso con éxito de la técnica de tinte es el paso 1.5, la validación de que el colorante elegido funciona bien con la especie y la cepa que se utiliza. Una técnica alternativa implica la aplicación de polvo de color hacia el exterior de la mosca antes de su uso en experimentos de campo 24. Este método ha sido utilizado para el seguimiento de individuos en el campo debido to la duración de marcado y la facilidad de los medios de marcado moscas 24. Aunque no hemos probado explícitamente este método en los ensayos de apareamiento, sería importante examinar los efectos que el polvo podría tener sobre los sentidos importantes en el apareamiento, particularmente en Drosophila 25, 26. En las especies, sin embargo, donde el teñido intestinal no es posible, estos métodos podrían ser adecuados. En conclusión, se encontró que en dos de las tres especies estudiadas (D. pseudoobscura y D. subobscura) no hubo ningún efecto encontrado de cualquiera de CO 2 anestesia o colorante de alimentos en la capacidad de apareamiento de los machos. Para D. melanogaster un efecto negativo de CO 2 anestesia fue detectado, pero colorante de alimentos no afectó el éxito de apareamiento de esta especie. En general, el método del colorante proporciona un método no invasivo sencillo y barato para la identificación de individuo Drosophila que es equivalente o mejor que los métodos que requieren CO 2 anestesia. Ellaes probable que este método funciona a través de una variedad de especies.

Durante las últimas décadas se ha producido un creciente interés en la forma en la selección sexual y la competencia entre los machos impacto en la evolución 1,2. Los experimentos sobre el comportamiento de apareamiento han jugado un papel importante en el desarrollo y prueba las teorías de la selección sexual 3,4. En particular las especies, investigación usando del género Drosophila, ha contribuido en gran medida a la comprensión de la selección y el comportamiento sexual. Sin embargo, es importante investigar si las técnicas comúnmente utilizadas pueden sesgar artificialmente los resultados de experimentos de apareamiento estándar 5,6. Anestesia se usa a menudo para la manipulación y la identificación en los experimentos 7. Por ejemplo, las moscas se recogen comúnmente antes del apareamiento, o clasifican en genotipos o tratamientos experimentales utilizando dióxido de carbono (CO 2) anestésico. En experimentos en los que hay que distinguir dos o más personas, es una práctica común para anestesiar la flies y clip de parte del ala de identificar cada grupo individual o tratamiento 5,8. Es vital, sin embargo, para entender cómo CO 2 tratamiento afectará el comportamiento. El efecto del CO 2 anestesia ha sido examinado en Drosophila melanogaster en la que machos expuestos a CO 2 tomó mucho más tiempo para aparearse y en general tuvimos éxito de apareamiento más bajo que los hombres o los hombres no anestesiado anestesiado mediante la exposición al frío 5. Este efecto se observó tanto cuando se aplicó anestesia en el día del experimento y cuando las moscas se les dio un día para recuperarse. Sin embargo, este estudio fue limitado en los ensayos que examinaban donde un solo macho se presentó a cada mujer 5. Un escenario más realista es para una mujer encontrar varios machos 9,10, lo que permite la competencia entre los machos, que podrían permitir la detección de pérdidas más sutiles de la aptitud masculina debido a la anestesia. El uso de anestesia CO 2 también ha seres encontrado para reducir la fecundidad y la longevidad de los adultos de D. melanogaster cuando se exponen poco después de la eclosión, como es común en la recogida de virgen vuela 11. Una alternativa a CO 2 anestesia es marcar moscas alimentándolos coloreado con colorante 4,6,10,12,13 alimentos. Este colorante entra en los intestinos de la marcha y es visible a través del abdomen, lo que permite moscas de colores para distinguir de moscas incoloro, o de las moscas marcados con un color diferente. Los métodos difieren en la forma en que esto puede ser aplicado: se añade directamente a la comida 12, a través de teñido de pasta de levadura suplementaria 6, o mediante la exposición a una novela teñido sustrato alimenticio 13. Estas técnicas de marcado parecen mostrar ningún efecto sobre 4,6 capacidad de apareamiento. Sin embargo, un documento de examinar directamente los efectos de la misma colorante de alimentos en adultos de D. melanogaster encontró una fuerte reducción de la vida útil 14. El trabajo previo se ha centrado también almost enteramente en D. melanogaster, tanto con respecto a los efectos de la anestesia de CO 2 5,11 y alimentos para colorear 14 métodos. Actualmente, hay poca información sobre cómo CO 2 anestesia o el uso de coloración intestinal afecta al comportamiento de apareamiento de otra Drosophila. El siguiente estudio evalúa el efecto del CO 2 anestesia en el comportamiento de apareamiento de tres especies de Drosophila (D. melanogaster, D. pseudoobscura y D. subobscura). El efecto de la recolección de moscas en CO 2 fue examinado tanto en dos ensayos de apareamiento masculino individual y. El efecto de CO 2 también se ha encontrado a variar en D. melanogaster 5 y así diferentes períodos de latencia entre la exposición a CO 2 y el apareamiento se pusieron a prueba. Un método para recorte de la anestesia y el ala marcado alternativa: Se evaluó también el uso de los colorantes de alimentos para teñir las moscas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plastic tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TWT-200-061G</td>
			<td>Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine mesh</td>
			<td>Any haberdashery</td>
			<td>-</td>
			<td>Fine curtain mesh is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-376</td>
			<td>Various brands of pipette tips would be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>58.49</td>
			<td>Larger vials or bottles could also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Balls</td>
			<td>Lewis Medical Solutions</td>
			<td>28170</td>
			<td>The size of cotton will vary depending on the size of vials used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Food colouring</td>
			<td>Thesugarcraftcompany</td>
			<td>-</td>
			<td>Other dye colours and brands can have variable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Tank</td>
			<td>BOC</td>
			<td>BOC 40VK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpie Markers</td>
			<td>Steadtler</td>
			<td>Lumocolor 313 S</td>
			<td>Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Salter</td>
			<td>SL3920</td>
			<td>Any stopwatch with a good digital display would be fine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dyeing insects for behavioral assays: the mating behavior of anesthetized drosophila

Experimentos de apareamiento utilizando Drosophila han contribuido en gran medida a la comprensión de la selección y el comportamiento sexual. Los experimentos a menudo requieren métodos sencillos, fáciles y baratas para distinguir entre los individuos en un juicio. Una técnica estándar para esto es CO 2 anestesia y luego etiquetar o ala de recorte cada marcha. Sin embargo, esto es invasivo y se ha demostrado que afecta el comportamiento. Otras técnicas han utilizado coloración para identificar moscas. En este artículo se presenta un método simple y no invasivo para el etiquetado de Drosophila que les permita ser identificados individualmente dentro de experimentos, utilizando colorante de alimentos. Este método se utiliza en los ensayos en los dos machos compiten para aparearse con una hembra. Teñido permitió la identificación rápida y fácil. Hubo, sin embargo, alguna diferencia en la intensidad de la coloración a través de las tres especies ensayadas. Los datos se presentan mostrando el tinte tiene un menor impacto en el comportamiento de apareamiento de CO 2 en Drosophila melanogaster. El impacto de la anestesia CO 2 se muestra a depender de las especies de Drosophila, con D. pseudoobscura y D. subobscura mostrando ningún impacto, mientras que D. machos melanogaster habían reducido el éxito de apareamiento. El método de colorante presentada es aplicable a una amplia gama de diseños experimentales.

Dos ensayos de apareamiento masculino - El efecto del CO 2 anestesia en la conducta de apareamiento El mejor modelo encontrado para explicar la variación en el efecto de CO 2 anestesia contenía especies como un factor (con D. pseudoobscura y D. subobscura fusionado ya que no mostraron diferencias entre sí). En D. pseudoobscura y D. subobscura no hubo un efecto significativo de CO 2 anestesia en el éxito de apareamiento en dos pruebas masculinas (Z 1589 = 0,087, P = 0,931). Para D. melanogaster, machos expuestos a CO 2 anestesia tuvieron éxito en el apareamiento significativamente menor (Z1,589 = 2,467, P = 0,014). También hubo una interacción significativa entre las especies y tratamiento (χ 2 1589 = 6,83, P = 0,009) con un mayor efecto ser visto cuando D. melanogaster fueron expuestos a gas en la colección o 1 día antes de los ensayos (Tabla 1). Sin embarer, D. machos melanogaster expuestas a CO 2 dos días antes de la prueba experimental no mostró un efecto de CO 2. Dos ensayos de apareamiento masculino - El efecto de coloración intestinal en la conducta de apareamiento Modelo simplificación no mostró efectos significativos de colorante de alimentos se encuentra en cualquiera de las tres especies (P&gt; 0,1). Cuando el tratamiento o el estado de gas se incluyeron en el análisis también estos no fueron significativos (P&gt; 0,1). Las proporciones de apareamientos exitosos para moscas de colores a través de los tratamientos se muestran en la Tabla 2. La diferencia de coloración entre las moscas mantiene en color y la comida sin color se puede ver en la Figura 1. La intensidad de la coloración de alimentos intestinal fue mayor en D. pseudoobscura y D. subobscura que en D. melanogaster. Ensayos de apareamiento individuales - El efecto del uso de CO 2 anestesia en mcomportamiento CIONES No hubo diferencia en la latencia de apareamiento para cualquiera de las tres especies cuando se utilizó CO 2 anestesia para recoger recientemente surgido adultos. Un efecto se encontró para la duración de apareamiento en D. subobscura cuando se expuso a CO 2 dos días antes de los ensayos de apareamiento (Figuras 2 y 3, Tabla 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig1.jpg" /> Figura 1. Fotografía que muestra viales de color y no color Mosca de Alimentos (A) y la Fortaleza de Intestinal coloración en Male D. Subobscura (B). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig2.jpg" /> Figura 2. La media y el 95% intervalos de confianza para Cópula Latencia para las tres especies investigado en ensayos individuales masculinos, cuando los machos eran Anestesiard (barras claras) o no anestesiados (barras oscuras) cuando se cobran como vírgenes antes de la madurez sexual. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig3.jpg" /> Figura 3. La media y el 95% intervalos de confianza para la cópula Duración de las tres especies investigado en ensayos individuales masculinos, cuando los machos fueron anestesiados (barras claras) o no Anestesiados (barras oscuras) cuando se cobran como vírgenes antes de la madurez sexual. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tratamiento </td><td> Especies </td><td> Ensayos No. </td><td> No. moscas de color que se aparearon </td><td> p-valor </td><td> No. moscas gaseados que se aparearon </td><td> p-valor </td></tr><tr><td rowspan="3"> Colección de CO 2 </td><td> D. mel </td><td> 73 </td><td> 36 </td><td> 1 </td><td> 27 </td><td> 0.0344 </td></tr><tr><td> D. pse </td><td>79 </td><td> 41 </td><td> 0.8221 </td><td> 44 </td><td> 0.3682 </td></tr><tr><td> D. sub </td><td> 71 </td><td> 40 </td><td> 0.3425 </td><td> 33 </td><td> 0.6353 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Expuestos a CO 2 18 horas antes </td><td> D. mel </td><td> 57 </td><td> 28 </td><td> 1 </td><td> 19 </td><td> 0.0163 </td></tr><tr><td> D. pse </td><td> 65 </td><td> 32 </td><td> 1 </td><td> 31 </td><td> 0.8043 </td></tr><tr><td> D. sub </td><td> 68 </td><td> 38 </td><td> 0.3961 </td><td> 35 </td><td> 0.9036 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Expuestos a CO 2 2 días. </td><td> D. mel </td><td> 56 </td><td> 19 </td><td> 0.0222 </td><td> 32 </td><td> 0.3497 </td></tr><tr><td> D. pse </td><td> 70 </td><td> 32 </td><td> 0.5504 </td><td> 33 </td><td> 0.7202 </td></tr><tr><td> D. sub </td><td> 56 </td><td> 29 </td><td> 0.8939 </td><td> 26 </td><td> 0,6889 &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table> Tabla 1. Los resultados de dos experimentos Hombre Choice para todas las especies y tratamientos examinados. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Especies </td><td> Rasgo </td><td> df </td><td> t-valor </td><td> p-valor </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. melanogaster </td><td> Estado latente </td><td> 58 </td><td> 1,379 </td><td> 0,174 </td></tr><tr><td> Duración </td><td> 58 </td><td> 1,243 </td><td> 0,221 </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. pseudoobscura </td><td> Estado latente </td><td> 109 </td><td> 0,419 </td><td> 0,676 </td></tr><tr><td> Duración </td><td> 109 </td><td> 0,436 </td><td> 0,664 </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. subobscura </td><td> Estado latente </td><td> 83 </td><td> 0,098 </td><td> 0,922 </td></tr><tr><td> Duración </td><td> 83 </td><td> 1,767 </td><td> 0,081 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Los resultados de experimentos de apareamiento individuales examinar el efecto de la colección de CO 2 anestesia en la latencia de acoplamiento y duración. Las pruebas se llevaron a cabo en tres especies de Drosophila (D. melanogaster, D. pseudoobscura y D. subobscura).

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Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Teñido Insectos de la Conducta ensayos: el comportamiento de apareamiento de anestesiada<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

dyeing-insects-for-behavioral-assays-mating-behavior-anesthetized

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

9.8K vistas.  University of Liverpool. This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Video: Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Investigación

Neurociencias

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those leg movements that result from passive forces and interactions with other legs through the common contact with the substrate. If we want to understand, which part of a given movement is produced by nervous system motor output, kinematic analysis of stepping movements, therefore, needs to be complemented with electrophysiological recordings of motor activity. The recording of neuronal or muscular activity in a behaving animal is often limited by the electrophysiological equipment which can constrain the animal in its ability to move with as many degrees of freedom as possible. This can either be avoided by using implantable electrodes and then having the animal move on a long tether (i.e. Clarac et al., 1987; Duch &amp; Pfl&uuml;ger, 1995; B&ouml;hm et al., 1997; Gruhn &amp; Rathmayer, 2002) or by transmitting the data using telemetric devices (Kutsch et al, 1993; Fischer et al., 1996; Tsuchida et al. 2004; Hama et al., 2007; Wang et al., 2008). Both of these elegant methods, which are successfully used in larger arthropods, often prove difficult to apply in smaller walking insects which either easily get entangled in the long tether or are hindered by the weight of the telemetric device and its batteries. In addition, in all these cases, it is still impossible to distinguish between the purely neuronal basis of locomotion and the effects exerted by mechanical coupling between the walking legs through the substrate. One solution for this problem is to conduct the experiments in a tethered animal that is free to walk in place and that is locally suspended, for example over a slippery surface, which effectively removes most ground contact mechanics. This has been used to study escape responses (Camhi and Nolen, 1981; Camhi and Levy, 1988), turning (Tryba and Ritzman, 2000a,b; Gruhn et al., 2009a), backward walking (Graham and Epstein, 1985) or changes in velocity (Gruhn et al., 2009b) and it allows the experimenter easily to combine intra- and extracellular physiology with kinematic analyses (Gruhn et al., 2006).
We use a slippery surface setup to investigate the timing of leg muscles in the behaving stick insect with respect to touch-down and lift-off under different behavioral paradigms such as straight forward and curved walking in intact and reduced preparations.

We describe a method to record motor activity, timed to the electrically recorded tarsal contact signal in a tethered insect, walking on a slippery surface. This is used to study the neural basis of adaptive behavior under reduced influence of mechanical interaction between legs through the substrate.

Estudiar la base neural de la conducta adaptativa Locomotor en insectos

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de ensayo a Drosophila Comportamiento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

Un ensayo de una sola mosca por el comportamiento de forrajeo en<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

A Simple Flight Mill for the Study of Tethered Flight in Insects

Flight in insects can be long-range migratory flights, intermediate-range dispersal flights, or short-range host-seeking flights. Previous studies have shown that flight mills are valuable tools for the experimental study of insect flight behavior, allowing researchers to examine how factors such as age, host plants, or population source can influence an insects' propensity to disperse. Flight mills allow researchers to measure components of flight such as speed and distance flown. Lack of detailed information about how to build such a device can make their construction appear to be prohibitively complex. We present a simple and relatively inexpensive flight mill for the study of tethered flight in insects. Experimental insects can be tethered with non-toxic adhesives and revolve around an axis by means of a very low friction magnetic bearing. The mill is designed for the study of flight in controlled conditions as it can be used inside an incubator or environmental chamber. The strongest points are the very simple electronic circuitry, the design that allows sixteen insects to fly simultaneously allowing the collection and analysis of a large number of samples in a short time and the potential to use the device in a very limited workspace. This design is extremely flexible, and we have adjusted the mill to accommodate different species of insects of various sizes.

Flight in insects is influenced by a number of factors and the propensity to disperse is an important variable in understanding insect ecology and biological control strategies. We describe the construction and use of a simple, relatively inexpensive, and flexible flight mill for measuring parameters of tethered flight in insects.

Un simple molino de Vuelo para el Estudio de Atado en vuelo Insectos

Flight in insects can be long-range migratory flights, intermediate-range dispersal flights, or short-range host-seeking flights. Previous studies have ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

De alta resolución de cuantificación del comportamiento guiado Olor en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uso de la<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigma

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Un ensayo de conducta para Mechanosensation de clones en MARCM-basa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their worlds when trying to understand their behavior and ecology. Sensitivity to the ultraviolet spectrum (UV; 300 - 400 nm) is found across multiple genera of birds, fish, reptiles, amphibians, and even mammals. This protocol describes a technique for examining organisms for the presence of UV-reflecting structures and a method for testing whether these cues are used as social signals in the context of mate choice. A spectrophotometer is used to detect the presence of UV reflectance and variation in reflective intensity between individuals and sexes. An example of this technique is presented in which a dichotomous mate choice test exposes sexually receptive individuals to opposite sex individuals whose visual appearance can be manipulated by filters that either transmit full spectrum or block UV wavelengths. This system allowed for the determination that female, but not male, sailfin mollies (Poecilia latipinna) were using UV markings as part of their mating decisions. These types of studies serve to expand our knowledge of the range of organisms that utilize UV and provide insight into how UV plays a role in their lives.

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

This protocol outlines the use of spectrophotometry to detect ultraviolet-reflecting structures on organisms (in this example, the sailfin molly Poecilia latipinna) and describes dichotomous choice tests for fish that allow inferences to be made on the role of ultraviolet cues during mate selection.

Los ensayos para detectar estructuras que refleja los rayos UV y determinar su importancia en la selección del compañero usando el Sailfin Molly<em&gt; Poecilia Poeci</em

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Una manera sencilla de medir alteraciones en el comportamiento de búsqueda de recompensa Uso<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Cuantificación de la Drosophila Grooming Comportamiento

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...