Esta investigación está financiada por el MRC y las subvenciones BBSRC. Damos las gracias a Agata Zieba y Pardalis Katerina en el Laboratorio de Ulf Landegren de la Universidad de Uppsala para ayudar con la creación de la técnica y consejos útiles. Olink Biosience para la ayuda técnica y la presentación.

1. Revestimiento de las células y el tratamiento con BMP <ol><li> Cultivo de células en Neuro2a GMEM suplementado con FBS al 10%, 1x no aminoácidos esenciales (NEAM), 1x piruvato sódico y 1 de L-glutamina. División de las células con tripsina (0,05%-EDTA) y la placa de 15.000-20.000 células por pocillo en una diapositiva de cámara de 16 también. Cultura HEK293T o células COS7 en DMEM suplementado con FBS al 10%, 1x L-glutamina y 1 de penicilina / estreptomicina. Esterilizar diapositivas Polysine por inmersión en etanol al 70% y el uso de la pluma Immedge dibujar 1 cm 2 pozos. División de las células con tripsina (0,05%-EDTA) y la placa de 20.000 a 25.000 células por pocillo en medio de 50 microlitros. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C en un humidificado 5% incubadora de CO 2. </li><li> Después de 24 h reemplazar el medio con suero libre GMEM (suplementado con 0,1% de albúmina, 1x NEAM, 1x piruvato sódico y 1 de L-glutamina) para Neuro2a o con DMEM libre de suero (suplementado con L-glutamina y 1 de penicilina / estreptomicina) para HEK293T / COS7 e incubar las células durante 2-3 h. Mantener tres pozos con células bajo condiciones de cultivo normal (es decir, 10% de SFB) para utilizar como controles. </li><li> Tratar las células con dorsomorphin (inhibidor de la vía BMP, 2 M) o BMP4 (25 ng / ml) durante el tiempo deseado (por ejemplo, durante 10 min-1 h) 5. </li></ol> 2. Fijación y permeabilización <ol><li> Preparar el fijador, el 4% PFA. Pesar 4 g de PFA para preparar una solución al 4% en 100 ml de PBS. Calentar la solución a 50 ° C hasta que quede claro. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 micras y se almacenan a 4 ° C hasta su uso. Use fijador fresco (no se almacenan por más de 2 días). </li><li> Aspirar el medio de los pocillos y lavar con 1XPBS. No pipetear las soluciones directamente sobre las células ya que esto puede resultar en el desprendimiento de las células. Antes de ir al siguiente paso, si la cámara de diapositivas se utilizan quitar las cámaras, pero deja el silicio alrededor de los pozos. </li><li> Añadir 50 l PFA al 4% e incubar durante 10 minutos, a temperatura ambiente, sin agitación. </li><li> Se lavan las células con PBS durante 3 x 5 minutos en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente. </li><li> Tratar las células con 0,5% Triton X-100 en PBS durante 10 minutos sin agitación a temperatura ambiente. </li><li> Lavan las células con el 0,05% de Tween 20 en TBS (TBS-T) de 3 x 5 minutos en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Bloqueo de <ol><li> Toque de la TBS-T. Añadir una gota de solución de bloqueo Duolink II (1x) por pocillo. </li><li> Incubación los portaobjetos en una cámara húmeda precalentada durante 1 hora a 37 ° C. </li></ol> 4. Anticuerpos primarios <ol><li> Mezclar y diluir aP-Smad1/5/8 (policlonal de conejo) a 1:100 y un Smad4 (monoclonal de ratón) a 1:100 en el diluyente de anticuerpos Duolink II (1x). Prepare también aP-Smad1/5/8 y solo uno-Smad4 en las mismas concentraciones que se utiliza para los controles. </li><li> Elimine la solución de bloqueo de las diapositivas. Retire como una solución mucho más el bloqueo como sea posible, pero tenga cuidado de no dejar que las células seco antes de añadir el anticuerpo. Añadir 40 ml de las soluciones de anticuerpos a los pozos. En un bien agregar diluyente de anticuerpos sólo como un control negativo adicional. </li></ol> 5. PLA sondas <ol><li> Diluir las dos sondas de PLA (Duolink II anti-ratón de menos y Duolink II anti-conejo PLUS) 1:05 en diluyente de anticuerpos. </li><li> Elimine la solución de anticuerpo primario de las diapositivas. Este lavado 2 veces 5 minutos cada uno con 1x buffer Duolink II Lavado A en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente. </li><li> Elimine la solución de lavado A partir de las diapositivas y añadir la solución de PLA de la sonda (40 l / pocillo). Incubación los portaobjetos en una cámara húmeda precalentada durante 1 hora a 37 ° C. </li></ol> 6. La ligadura <ol><li> El vórtice Duolink II Ligadura de valores (5 veces) y se diluye 1:5 en agua de alta pureza y mezcla. Al calcular el volumen del agua, tener en cuenta el volumen de la ligasa, que se añadirá a una dilución final de 1:40 justo antes de la adición de la mezcla de los pozos. </li><li> Elimine la solución de la sonda PLA de las diapositivas. Lavar los portaobjetos en el tampón de lavado 1 x 2 veces por 5 minutos cada uno en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente. </li><li> Saque la ligasa del congelador con un bloque de congelación (-20 ° C). Añadir la ligasa a la solución de ligación (preparado en el punto 6.1) a una dilución 1:40 y agitar. </li><li> Elimine la solución de lavado A partir de las diapositivas y añadir la solución de ligación-ligasa a cada pocillo (40 l / pocillo). Incubación los portaobjetos en una cámara húmeda precalentada durante 30 minutos a 37 ° C. </li></ol> 7. Amplificación Nota: La luz reactivos sensibles. Mantenga las diapositivas de la luz. <ol><li> Diluir el stock Duolink II de amplificación (5 veces) 1:5 en agua de alta pureza y mezcla. Al calcular el volumen del agua en cuenta el volumen de la polimerasa, que se añadirá a una dilución final de 1:80 justo antes de la adición de la mezcla de the pozos. </li><li> Elimine la solución de ligación-ligasa de las diapositivas. Lavar los portaobjetos en tampón de lavado 1X con una de 2 por 2 minutos cada uno en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente. </li><li> Saque la polimerasa del congelador con un bloque de congelación (-20 ° C). Añadir la polimerasa para la solución de amplificación (preparado en 7.1) a una dilución 1:80 y agitar. </li><li> Elimine la solución de lavado A partir de las diapositivas y añadir la solución de amplificación de la polimerasa a cada pocillo (40 l / pocillo). Incubación los portaobjetos en una cámara húmeda precalentada a 100 minutos a 37 ° C. </li></ol> 8. Preparación para la imagen Nota: La luz reactivos sensibles. Mantenga las diapositivas de la luz. <ol><li> Elimine la solución de amplificación de la polimerasa a partir de las diapositivas y de lavado de 2 veces 10 minutos cada uno en 1x Wash Buffer Duolink II B en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente. </li><li> Sumergir los portaobjetos en el tampón de lavado de 0,1 x B. </li><li> Quitar la silicona de la diapositiva 16, así por completo. Añadir ~ 40μl de la II Duolink medio de montaje con DAPI en el cubreobjetos y suavemente a cabo sobre las muestras presionando ligeramente para que no queden burbujas de aire bajo el cubreobjetos. Fijar y sellar el cubreobjetos sobre el portaobjetos con esmalte de uñas. Espere por lo menos 15 minutos antes de proceder a la imagen. </li><li> Analizar las muestras con un microscopio confocal o de fluorescencia. La obtención de imágenes digitales. </li></ol> 9. Cuantificación Nota: La luz reactivos sensibles. Mantenga las diapositivas de la luz. <ol><li> Use Duolink ImageTool contar las señales en las imágenes para obtener una medida del nivel de señalización. </li><li> Comparar las mediciones y realizar un gráfico. </li></ol> 10. Resultados representante El resultado de un experimento in situ PLA muestra manchas fluorescentes como discretos. La ubicación de la señal depende de las proteínas específicas de estudio. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" /> Figura 1. In situ del EPL en las células después de la estimulación Neuro2a BMP4. Las células fueron tratadas con M dorsomorphin 2 (inhibidor de la vía BMP) (A) o 25 BMP4 ng / ml (B) durante 60 minutos o se deja sin tratar (CE). Los anticuerpos contra P-Smad1/5/8 Smad4 y se utiliza para detectar los complejos activos en A y B. Los anticuerpos primarios aP-Smad1/5/8 solo (C) y un Smad4 solo (D) o la omisión de la primaria anticuerpos (E) se utilizaron como controles. Azul: DAPI; Rojo: señal de PLA. Imágenes fueron obtenidas con un microscopio Leica SP5 confocal. (F) Las señales de PLA se contó con el software Duolink ImageTool y el número promedio de puntos en el núcleo de cada célula se presenta en el gráfico. (G), las células Neuro2a se deja sin tratar o tratados con Dorsomorphin (2 mM) o BMP4 (25 ng / ml) durante 60 min. Se usaron las células y las proteínas fueron sometidas a SDS-PAGE y se analizaron por inmunotransferencia con aP-Smad1/5/8 y PCNA como control de carga. (*) No específica de banda. Tenga en cuenta que el anticuerpo aP-Smad1/5/8 no puede distinguir entre los tres diferentes proteínas presentes en el complejo con Smad4.

<ol>
	<li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. o. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction.">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li><li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses.">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism.">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li><li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun/AP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun/Fra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo.">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 .</li><li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia.">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li><li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor/retinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids.">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li></ol>

La producción de este video-artículo fue patrocinado por OLINK que hace un reactivo utilizado en el procedimiento de ensayo de la ligadura de proximidad.

La visualización de los complejos de proteínas in situ está en gran demanda, sobre todo para los estudios en donde la interacción de proteínas de señalización y modificación de proteínas son los medios que las células usan para enviar una señal de su superficie al núcleo. No ha sido posible visualizar y cuantificar los complejos entre dos proteínas endógenas in situ con inmunofluorescencia antes. Co-localización de anticuerpos muestra de baja resolución y no se puede utilizar para visualizar una verdadera interacción. PLA es una nueva técnica que los investigadores han empezado a utilizar en diferentes sistemas con gran éxito 6, 7. En este sentido, se muestra cómo utilizar PLA no sólo para visualizar, sino también cuantificar los complejos endógenos entre efectores Smad activado aguas abajo de la estimulación BMP con el tiempo. Hemos utilizado diferentes células de cultivo de tejidos incluyendo Neuro2a y se basó en anticuerpos comerciales planteadas en las diferentes especies (ratón y conejo-Smad4 aP-Smad1/5/8) para lograr esto (fig 1). Este método nos permitió, por primera vez, para ver la activación de los efectores BMP-complejos con el tiempo y no sólo la presencia de la fosforilado Smad1/5/8, que no todos pueden participar en complejos activos con Smad4. Contamos con las señales (Fig. 1F) y se comparó la medida con la cuantificación obtenidos de inmunoblot de las mismas células 8 (Figura 1G). Llegamos a la conclusión de que el número de puntos de proporcionar una medición precisa comparativo de los niveles de señalización a través del tiempo. La técnica se aplicó también en otras líneas celulares (HEK293T y COS7) con resultados similares (datos no mostrados). El principio de la tecnología se basa en dos sondas únicos incluidos en el kit Duolink. Cada sonda PLA consiste en un anticuerpo secundario unido a un oligonucleótido sintético único, que actúa como un periodista. La proximidad de las sondas permite la ligadura de ADN en el lugar exacto donde estas sondas se unen en la proximidad. La distancia de los oligonucleótidos, que permite la hibridación de ADN y la ligadura es pequeño (40 nm &lt;) y por lo tanto, sólo las proteínas que interactúan puede permitir que la ligadura. El ADN ligado entonces puede ser amplificado y detectado con la hibridación de los oligonucleótidos etiqueta de la secuencia amplificada. La amplificación es específica, ya que depende de los principios de hibridación ADN-ADN y también proporciona una alta sensibilidad como el ADN ligado se amplifica varias veces que resulta en la mejora de la ligadura de evento inicial. El ADN amplificado se detecta por hibridación con oligonucleótidos marcados y produce un lugar visible y bastante grandes. Medida que los puntos se puede contar, la señal de PLA no sólo proporciona la información exacta espaciales (la ubicación de los eventos de interacción), sino también una manera objetiva de cuantificar estos eventos 4.2. Otras técnicas que se emplean para la detección de interacciones de proteínas incluyen co-inmunoprecipitación, inmunofluorescencia y la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET). Co-immunoprecipitation ensayos son ampliamente utilizados que permite el aislamiento de los complejos de proteínas. El método se acompaña de inmunotransferencia lo que significa que las proteínas se expresan en niveles relativamente altos a fin de detectar. Los problemas de fondo de alta o de la unión no específica de algunas proteínas de los granos son a veces difíciles de superar en co-inmunoprecipitación. Además, co-immunoprecipitation ensayos permiten la detección de proteínas que pueden formar parte de un complejo de proteínas, pero no pueden distinguir aquellos que están en una proximidad muy cercana interactuar físicamente con los demás. Además, co-inmunoprecipitaciones no puede proporcionar la cuantificación en la resolución de celda o de información sobre la localización de los complejos de proteínas en la célula. La detección de co-existencia de complejos de proteínas en una célula o un compartimento de células por inmunofluorescencia se basa en la superposición de las señales de difusión y por lo tanto, tiene una resolución espacial baja y no puede proporcionar información precisa sobre las interacciones de las proteínas. La cuantificación de la señal de inmunofluorescencia se puede hacer por estimación visual sólo si la diferencia es de varias veces, y no puede ser exacta o medibles como las manchas de PLA. FRET permite la visualización de los complejos de proteínas en células vivas y evita la necesidad de anticuerpos y la exposición del epítopo. Sin embargo, FRET lo general depende de la sobreexpresión de proteínas de fusión artificial, lo cual no refleja los complejos de proteínas endógenas como en el PLA. Condiciones de bloqueo en el protocolo de PLA son fundamentales como la agregación de anticuerpos puede ocurrir y aumentar el fondo. Distintas condiciones de bloqueo se puede encontrar en las fichas técnicas de anticuerpos. Los controles adecuados con omisión del anticuerpo primario y secundario proporcionan información sobre lo que pudo haber salido mal y que necesitan estar siempre incluido. Es importante a la pantalla de anticuerpos diferentes que le dará al menos de fondo cuando se emplean solos y la mejor señal cuando están juntos. La fijación de cells es crítico ya que más de la fijación puede causar complejos de proteínas para desnaturalizar completamente y se degradan, mientras que la fijación insuficiente puede conducir a la pérdida de complejos de proteínas durante las etapas del procedimiento. Esto puede ser controlado mediante la reducción de la concentración del fijador al 3% o al limitar el tiempo de fijación. Sin embargo, la fijación depende también de si los anticuerpos primarios reconocer proteínas desnaturalizadas o no. A medida que la técnica de PLA es muy sensible, requiere de cuidados especiales para mantener los tiempos de incubación y las condiciones micro iguales entre las diferentes muestras. Las muestras no deben dejarse secar, en cualquier caso antes de la etapa final. Secado de las muestras puede dar lugar a un aumento de fondo. La remoción completa de la solución de bloqueo también es fundamental para evitar el fondo. Los tampones de lavado debe estar siempre a temperatura ambiente antes de su uso, como la temperatura baja retarda las reacciones enzimáticas. Para la solución de problemas, consulte el manual del kit. Es útil el uso de las manchas para determinar la localización subcelular de la señal de PLA (por ejemplo, DAPI, la actina, etc.) Aquí hemos utilizado DAPI (en el medio de montaje) para teñir los núcleos. PLA es compatible con el uso de inmunofluorescencia con anticuerpos para determinar el tipo de células o compartimento celular (no mostrado aquí). Cuantificación exacta se puede hacer contando las señales y el uso de software específico (Herramienta Duolink imagen, Olink Biosience). En conclusión, hemos demostrado cómo utilizar in situ PLA, utilizando el kit de Duolink para detectar la señalización de BMP en células fijadas y presentó sus ventajas: fácil de usar, altamente sensible, no de fondo, y una capacidad única para cuantificar los activos de señalización de BMP en el lugar. La limitación de la aplicación de esta técnica para estudiar las interacciones de diferentes proteínas depende de la disponibilidad y la calidad de los anticuerpos primarios que reconocen las proteínas objeto de la investigación.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>GMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21710025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21063029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutogenBioclear</td>
<td>7.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11149068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11360070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16-well chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>178599</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-pSmad1/5/8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-Smad4 (B8) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>sc-7966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dorsomorphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>171260-10MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant Mouse BMP-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>5020-BP-010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton-X 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>H5151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Detection Reagents (Orange)</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OLINK</td>
<td>92007-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92004-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92002-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Mounting Medium with DAPI</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82040-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Wash Buffers Fluorescence</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82049</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using in situ pla, a proximity ligation assay

BMPs son responsables de una amplia gama de efectos sobre el desarrollo y biológicos. Activar los receptores BMP (fosforilar) la Smad1/5/8 efectores, que a su vez, forman un complejo con Smad4 y trasladar al núcleo donde funcionan como factores de transcripción para iniciar BMP efectos específicos intermedios 1. Tradicionales técnicas de inmunofluorescencia con anticuerpos contra péptidos Smad fosfo-presentan baja sensibilidad de fondo, de altura y ofrecen la cuantificación bruto ya que dependen de la intensidad de la señal de anticuerpos sobre todo si este es fotosensible fluorescentes. Además, fosfo-Smads pueden no estar todos en el complejo con Smad4 y participó en la transcripción activa. In situ PLA es una tecnología capaz de detectar las interacciones de proteínas con alta especificidad y sensibilidad 2-4. Esta nueva tecnología de reconocimiento parejas de anticuerpos con la amplificación de ADN de un sustituto de la proteína. Se genera una señal localizada, discreta en forma de manchas de revelar la posición exacta del evento de reconocimiento. El número de señales se pueden contar y en comparación proporciona una medición. Hemos aplicado in situ PLA, utilizando el kit de Duolink, con una combinación de anticuerpos que permite la detección de los efectores de señalización BMP phospho-Smad1/5/8 Smad4 y sólo cuando estos se encuentran en la proximidad, es decir en un complejo, que ocurre sólo con la señalización activación. Esto permitió que por primera vez, la visualización y medición de los endógenos de señalización de BMP con una alta especificidad y sensibilidad en un tiempo experimento en la estimulación BMP4.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Aquí se muestra cómo utilizar la ligadura de ensayo de proximidad (PLA), con una combinación de anticuerpos para visualizar la proteína morfogenética ósea (BMP) de señalización en células fijadas. Esta técnica nos permitió seguir la acumulación nuclear de endógeno BMP activa de efectos complejos y cuantificar sus niveles en el tiempo en BMP4 estimulación.

La detección de señalización de Efectos Complejos de aguas abajo de BMP4 uso In situ PLA, un ensayo de la ligadura de proximidad

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

detection-signaling-effector-complexes-downstream-bmp4-using-situ-pla

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

31.7K vistas.  Imperial College, Hammersmith Hospital. Aquí se muestra cómo utilizar la ligadura de ensayo de proximidad (PLA), con una combinación de anticuerpos para visualizar la proteína morfogenética ósea (BMP) de señalización en células fijadas. Esta técnica nos permitió seguir la acumulación nuclear de endógeno BMP activa de efectos complejos y cuantificar sus niveles en el tiempo en BMP4 estimulación.

Video: Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Investigación

Biología

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Detección rápida homogénea de Ensayos Biológicos Usando el Sistema de modulación magnética biosensores

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

El análisis genético rápido de epitelio-mesenquimal de señalización durante la regeneración del cabello

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

La medición de la tasa metabólica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Mediante respirometría

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detección y análisis de daño del ADN en el ratón músculo esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Con el método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

La detección de los genes miARN objetivos en de alto rendimiento utilizando el ensayo 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

Estudio del retículo endoplasmático y las mitocondrias por Interacciones<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidad ligadura de ensayo en células fijadas

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

Aplicaciones de la cartografía espacio-temporal y técnicas de análisis de partículas para cuantificar Ca intracelular2 + señalización In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...