이 연구는 MRC와 BBSRC의 기금에 의해 후원됩니다. 우리는 기술과 유용한 조언을 설정 도와 줘서 Ulf Landegren의 실험실에있는 웁살라 대학을 아가타 Zieba와 카테 리나 Pardalis 감사드립니다. 기술 지원 및 프레 젠 테이션에 대한 Olink의 Biosience.

1. 전지 도금 및 BMP 치료 <ol><li> GMEM 문화 Neuro2a 세포 10 % FBS와 보충, 1X 비 필수 아미노산 (NEAM), 1X 나트륨 pyruvate과 L - 글루타민 1X. 16 잘 챔버 슬라이드에 트립신 (0.05 % - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))과 잘 따라 플레이트 15.000-20.000 세포를 사용하여 세포를 분리. DMEM 문화 HEK293T 또는 Cos7 세포 10 % FBS, 1X L - 글루타민과 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보완. 70 % 에탄올에서 그들을 immersing 및 Immedge 펜은 1cm이 우물을 그릴 사용하여 polysine 슬라이드를 소독. 50 μl 매체 트립신 (0.05 % - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))과 잘 따라 플레이트 20.000-25.000 세포를 사용하여 세포를 분리. </li><li> 37 세포를 품어 ° humidified 5 % CO 2 배양기에서 C. </li><li> 24 후 H는 Neuro2a에 대한 혈청 무료 GMEM (알부민 0.1 %, 1X NEAM, 1X 나트륨 pyruvate 및 1X L - 글루타민과 보충) 또는 HEK293T에 대한 혈청 무료 DMEM (L - 글루타민과 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충)로 매체를 교체 / Cos7 후 2-3 H. 위해 전지를 품어 컨트롤로 사용하는 일반 culturing 조건 하에서 세포 (즉, 10% FBS) 세 우물 보관하십시오. </li><li> 원하는 시간 dorsomorphin (BMP 경로, 2 μm의의 억제제) 또는 BMP4 (25 NG / ML)와 세포 (10 분 - 1 H에 대한 예) 5를 처리합니다. </li></ol> 2. 고정 및 Permeabilization <ol><li> 정착액, 4퍼센트 PFA를 준비합니다. 100 ML PBS에 4 %의 솔루션을 준비하는 PFA의 4g의 무게를. 50 솔루션을 따뜻한 ° 그것이 명확 C까지. 사용까지 4 0.22 μm의 필터와 매장 ° C를 통해 솔루션을 필터링합니다. 신선한 정착액을 (이상 2 일간 저장되지 않습니다)를 사용합니다. </li><li> 우물에서 매체를 기음과 1xPBS로 씻으십시오. 이것은 세포의 분리의 결과 수 있으므로 직접 세포에 솔루션을 피펫하지 마십시오. 챔버 슬라이드를 사용하는 경우 다음 단계로 진행하기 전에, 회의소를 제거하지만, 우물 주변의 실리콘을 두십시오. </li><li> 동요하지 않고, RT에서 10 분 50 μl 4퍼센트 PFA과 부화를 추가합니다. </li><li> RT에서 교반과 코플린 병 3 X 5 분 PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 0,5 % 트리톤 PBS에서 X - 100 10 분에 대한 RT에 동요하지 않고있는 세포를 처리합니다. </li><li> RT에서 교반과 코플린 병 3 X 5 분 TBS의 0,05 % 트윈 20 (TBS - T)으로 세포를 씻으십시오. </li></ol> 3. 블로킹 <ol><li> TBS - T를 누릅니다. 물론 당 Duolink II 차단 솔루션 (1X) 중 하나 드롭을 추가합니다. </li><li> 37 1 H를위한 사전 가열 습도 챔버 ° C.에있는 슬라이드를 품어 </li></ol> 4. 프라이 머리 항체 <ol><li> 믹스와 1:100에서 aP-Smad1/5/8을 (토끼 polyclonal) 희석과 Duolink II 항체 희석액 (1X)에 1:100에서 - Smad4 (마우스 단클론). 컨트롤에 사용되는 동일한 농도에서도 aP-Smad1/5/8 준비하고 A - Smad4 혼자. </li><li> 슬라이드에서 차단 솔루션을 누릅니다. 최대한 차단 솔루션을 제거하지만 항체를 추가하기 전에 세포가 건조하게하지 여분의 처리. 우물에 항체 솔루션 40 μl를 추가합니다. 하나에 잘 추가 대조군에 불과 항체 희석액을 추가합니다. </li></ol> 5. 플레 프로브 <ol><li> 항체 희석액에 두 플레 프로브 (Duolink II 안티 마우스 빼기와 Duolink II 안티 래빗 플러스) 1:5 희석. </li><li> 슬라이드의 기본 항체 솔루션을 누릅니다. 1X Duolink II 씻으 버퍼 각 슬라이드에게 2 번 5 분 씻어 RT에서 교반과 코플린있는 항아리에. </li><li> 슬라이드에서 씻으 버퍼를 누르하고 (물론 40 μl /) 괞찮아 프로브 솔루션을 추가합니다. 37 1 H를위한 사전 가열 습도 챔버 ° C.에있는 슬라이드를 품어 </li></ol> 6. 내고 <ol><li> 소용돌이 Duolink II의 결합 주식 (5 배)와 고순도 물 혼합에 1:5 희석. 물의 볼륨을 계산할 때, 계정으로 바로 우물에 혼합을 추가하기 전에 1시 40분의 최종 희석에 추가됩니다 Ligase의 볼륨을. </li><li> 슬라이드에서 플레 프로브 솔루션을 누릅니다. 1X 와시 버퍼에있는 슬라이드 RT에서 교반과 코플린 병 2 번 5 분 각각 씻으십시오. </li><li> 냉동 블록 (-20 ° C)를 사용하여 냉동고에서 Ligase를 가져가라. 1시 40분 희석과 와동의 결합 솔루션 (6.1에서 준비)에 Ligase를 추가합니다. </li><li> 슬라이드에서 씻으 버퍼를 누르하고 내고 - Ligase 솔루션을 추가하는 것은 각 웰 (물론 40 μl /). 37 30 분 미리 가열 습도 챔버 ° C.에있는 슬라이드를 품어 </li></ol> 7. 확대 참고 : 라이트 민감한 시약. 조명으로부터 보호 슬라이드 보관하십시오. <ol><li> 고순도 물 혼합에 Duolink II의 증폭 주식 (5 배) 1:5 희석. 물 볼륨이 계정으로 단지 일까지 혼합을 추가하기 전에 1:80의 최종 희석에 추가됩니다 효소의 볼륨을 계산할 때E 웰스. </li><li> 슬라이드에서 내고 - Ligase 솔루션을 누릅니다. 1X 와시 버퍼에있는 슬라이드를 씻어 RT에서 교반과 코플린있는 항아리에 A 2 번 2 분 각. </li><li> 냉동 블록 (-20 ° C)를 사용하여 냉동고에서 효소를 가져가라. 1:80 희석과 와동의 증폭 솔루션 (7.1에서 준비)에 효소를 추가합니다. </li><li> 슬라이드에서 씻으 버퍼를 누르하고 증폭 - 효소 솔루션을 추가하는 것은 각 웰 (물론 40 μl /). 37 100 분 미리 가열 습도 챔버 ° C.에있는 슬라이드를 품어 </li></ol> 8. 이미징을위한 준비 참고 : 라이트 민감한 시약. 조명으로부터 보호 슬라이드 보관하십시오. <ol><li> 슬라이드에서 증폭 - 효소 솔루션을 누르고 RT에서 교반과 코플린있는 항아리에 1X Duolink II 워시 버퍼 B에 각 2 회 10 분에 대한 세척. </li><li> 0.1 X 와시 버퍼 B.에있는 슬라이드를 찍어 </li><li> 완전히 16 잘 슬라이드에서 실리콘을 제거합니다. coverslip에 DAPI와 매체를 장착 Duolink II의 ~ 40μl를 추가하고 부드럽게 약간하므로 커버 슬립 아래에서 기포가가 없다는 것을 그것을 눌러 샘플을 통해 그것을 놓으십시오. 수정 및 매니큐어를 사용하여 슬라이드에 coverslip을 봉쇄. 영상을 계속하기 전에 적어도 15 분 기다립니다. </li><li> 공촛점 또는 형광 현미경으로 샘플을 분석할 수 있습니다. 디지털 이미지를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 9. 부량 참고 : 라이트 민감한 시약. 조명으로부터 보호 슬라이드 보관하십시오. <ol><li> 신호 레벨의 측정을 얻기 위해 이미지에 신호를 계산하는 Duolink ImageTool을 사용합니다. </li><li> 측정을 비교하고 그래프를 확인합니다. </li></ol> 10. 대표 결과 현장 플레 실험의에서 결과는 개별 형광 명소를 보여줍니다. 신호의 위치는 공부의 특정 단백질에 따라 달라집니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" /> 그림 1. 원위치 괞찮아에서 BMP4 자극 후 Neuro2a 세포에. 셀 2 μm의 dorsomorphin (BMP 경로의 억제제) (A) 또는 25 NG / ML BMP4 취급했다 (B)에 대한 치료 60 분 또는 왼쪽 (CE). P-Smad1/5/8 및 Smad4에 대한 항체는 A와 B. 혼자 aP-Smad1/5/8 (C) 기본 항체와 A - Smad4 혼자 (D) 또는 기본 태만에의 적극적인 단지를 검색하는 데 사용되었다 항체 (E)는 컨트롤로 사용되었습니다. 블루 : DAPI, 빨간색 : 괞찮아 신호. 사진은 Leica SP5 공촛점 현미경과 함께 획득했다. (F) 괞찮아 신호는 Duolink ImageTool 소프트웨어로 간주되었으며 세포 당 핵에있는 명소의 평균 개수는 그래프에 표시됩니다. (G) Neuro2a 세포는 치료 왼쪽 또는 Dorsomorphin (2 μm의) 또는 60 분 BMP4 (25 NG / ML)로 처리되었습니다. 세포 lysed되었으며 단백질은 SDS - PAGE의 대상 및 제어를 로딩으로 aP-Smad1/5/8과 - PCNA와 immunoblotting에 의해 분석되었다. (*)가 아닌 특정 밴드. aP-Smad1/5/8 항체는 3 가지 단백질을 구별 수 없습니다이 Smad4 복잡한에 존재.

<ol>
	<li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. o. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction.">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li><li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses.">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism.">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li><li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun/AP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun/Fra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo.">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 .</li><li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia.">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li><li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor/retinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids.">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li></ol>

이 비디오 문서의 생산은 근접 내고 분석 절차에 사용되는 시약을 만드는 사람 OLINK 후원했다.

현장에서 단백질 단지의 시각은 특히 단백질 상호 작용과 단백질 수정은 세포들은 표면에서 핵으로 신호를 보내기를 위해 사용하는 수단입니다 어디 신호의 연구, 큰 수요에있다. 그것은 전에 immunofluorescence과 함께 현장에서 두 내생 단백질 사이의 단지를 시각화하고 계량 가능한되지 않았습니다. 항체의 공동 지방화는 낮은 해상도를 전시하고 진정한 상호 작용을 시각화하는 데 사용할 수 없습니다. 플레은 연구자가 성공 6, 7과 다른 시스템에서 사용하기 시작한다는 새로운 기술입니다. 여기, 우리는 시간이 지남에 BMP의 자극의 하류 활성화 Smad effectors 사이의 내생 단지를 시각적으로뿐만 아니라 수치뿐만 아니라 괞찮아를 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 Neuro2a이 (그림 1) 달성 종 (마우스 - Smad4와 토끼 aP-Smad1/5/8)에서 제기된 상업 항체에 의존을 포함한 다른 조직 문화 전지를 사용했습니다. 이 방법은 모든 Smad4와 활성화 단지에 종사하지 않을 수 있습니다 phosphorylated Smad1/5/8의 단지 존재가 아니라 시간이 지남에 따라 BMP 효과기 - 단지의 활성화를 참조하고, 처음으로 우리를 허용했다. 우리는 신호 (그림 1 층)을 계산하고 같은 세포 8 (그림 1G)의 immunoblot에서 얻은 부량로 측정을 비교했다. 우리는 반점의 수가 시간이 지남에 따라 레벨을 신호의 정확한 비교 측정을 제공 결론을 내렸다. 이 기술은 또한 유사한 결과를 다른 세포 라인 (HEK293T 및 Cos7) (데이터가 표시되지 않음)에 적용되었습니다. 기술의 원리는 Duolink 키트와 함께 제공되는 두 개의 정점이 프로브에 따라 달라집니다. 각 플레 프로브는 기자 역할을 독특한 합성 oligonucleotide에 연결된 보조 항체로 구성되어 있습니다. 프로브의 근접이 탐사선이 근접에 부착되는 정확한 위치에서 DNA의 결합을 허용합니다. DNA의 하이브리드화 및 내고 작은 (&lt;40nm) 및 그러므로 수있는 oligonucleotides의 거리, 상호 작용에만 단백질이 결합을 허용할 수 있습니다. 출혈도 잡았 DNA는 다음 증폭 및 증폭 순서 분류 oligonucleotides의 하이브리드화로 검색하실 수 있습니다. 증폭은 DNA - DNA의 하이브리드화 원칙에 따라 같은 특정되고 출혈도 잡았 DNA가 초기 내고 이벤트의 향상의 결과로 몇 배 증폭이므로 또한 고감도를 제공합니다. 증폭된 DNA는 레이블 oligonucleotides와 하이브리드화하여 검색하고 볼 수와 약간 큰 자리를 생산합니다. 반점이 계산 수 있듯이, 플레 신호의 정확한 공간 정보 (상호 작용 이벤트의 위치)뿐만 아니라, 이러한 이벤트를 2-4 quantifying의 객관적인 방법뿐만 아니라를 제공합니다. 단백질 상호 작용의 검출을 위해 고용하는 다른 기술은 공동 immunoprecipitation, immunofluoresence와 형광 공명 에너지 전송을 (무서워)가 있습니다. 공동 immunoprecipitation의 assays 널리 단백질 단지의 절연을 활성화하는 데 사용됩니다. 방법은 단백질을 감지하기 위해 상대적으로 높은 수준의 표현이어야합니다 즉 immunoblotting 함께합니다. 높은 배경이나 비즈 일부 단백질이 아닌 특정 바인딩의 문제는 종종 공동 immunoprecipitation에서 극복하기 어렵습니다. 또한, 공동 immunoprecipitation의 assays는 단백질 복합의 일부가 될 수있는 단백질의 검출을 허용하지만, 서로 물리적으로 상호 작용하는 매우 가까이에있는 이들을 구분할 수 없습니다. 또한, 공동 immunoprecipitations은 세포에서 단백질 단지의 지방화에 대한 단세포 해상도 또는 정보에 quantitation를 제공할 수 없습니다. immunofluoresence하여 셀 또는 셀 구획에 단백질 단지의 공동 존재의 감지 따라서 확산 신호의 중복에 기초하고있다, 낮은 공간 해상도를 가지고 있으며 단백질의 상호 작용에 대한 정확한 정보를 제공할 수 없습니다. 차이가 몇 배 이상이며, 정확한 또는 괞찮아 명소로 측정 수없는 경우에만 immunofluoresence 신호의 양을 정함은 Visual 추정하여이 작업을 수행할 수 있습니다. 안달 라이브 세포에 단백질 단지의 시각화를 허용하고 항체의 필요성과 에피토프의 노출을 극복. 그러나, 걱정은 보통 플레 같이 내생 단백질 단지를 반영하지 않을 수 있습니다 인공 융합 단백질의 overexpression에 따라 달라집니다. 플레 프로토콜 차단 조건 항​​체 집합이 발생하고 배경을 증가 수 있으므로 중요합니다. 대체 차단 조건은 항체 제품 시트에서 찾을 수 있습니다. 기본 및 보조 항체 누락과 함께 적절한 컨트롤이 잘못 됐을 수도 있습니다 어떤 정보를 제공하고 그들은 항상 포함해야합니다. 그들이 만날 때 그들이 단독으로 사용하는 이상의 배경과 최상의 신호를 제공합니다 다른 항체를 스크린하는 것이 중요합니다. 셀의 고정부족한 고정이 절차의 단계 동안 단백질 단지의 손실로 이어질 수 있습니다 반면,여 - 고정이 단백질 단지 완전히 변성 및 저하를 일으킬 수로인가가 중요합니다. 이것은 3 % 정착액의 농도를 낮추거나 고정 시간을 제한하여 제어할 수 있습니다. 그러나, 고정은 기본 항체가 변성 단백질 여부를 인식하는지 여부에도 달려 있습니다. 플레 기술은 매우 민감한이기 때문에, 특별한주의는 배양 시간 및 다른 샘플간에 동등한 마이크로 조건을 유지하기 위해 필요합니다. 샘플은 최종 단계 이전에 어떤 경우에 건조 왼쪽해서는 안됩니다. 샘플의 건조하면 증가 배경으로 이어질 수 있습니다. 차단 솔루션의 완전한 제거는 배경을 방지하기 위해 중요합니다. 낮은 온도가 효소 반응을 느리게으로 세척 버퍼는 항상 사용하기 전에 실온에 회부해야합니다. 추가 문제 해결을위한 키트의 설명서를 참조하십시오. 그것은 괞찮아 신호 (예 : DAPI, 굴지 등)의 하위 세포 현지화을 확인할 얼룩을 사용하는 데 유용합니다. 여기서 우리는 핵을 얼룩이 DAPI을 (장착 매체) 사용하고 있습니다. 플레은 셀 형식이나 세포 구획을 (여기에 표시되지 않음)를 확인하는 항체와 immunofluorescence의 사용과 호환됩니다. 정확한 양을 정함은 신호와 특정 소프트웨어 (Duolink 이미지 도구 Olink Biosience)의 사용을 계산하여이 작업을 수행할 수 있습니다. 고감도 사용하기 쉽고, 노 배경, 그리고 현장에서 신호 활성 BMP를 정할 수있는 독특한 능력 : 결론적으로 우리는 BMP가 고정된 세포의 신호 전달과 그 이점을 제시 감지 Duolink 키트를 사용하여 현장 괞찮아에 사용하는 방법을 증명하고있다. 다른 단백질 상호 작용을 연구하기 위해이 기술을 적용의 제한은 조사에 따라 단백질을 인식 차 항체의 가용성과 품질에 따라 달라집니다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>GMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21710025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21063029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutogenBioclear</td>
<td>7.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11149068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11360070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16-well chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>178599</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-pSmad1/5/8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-Smad4 (B8) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>sc-7966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dorsomorphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>171260-10MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant Mouse BMP-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>5020-BP-010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton-X 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>H5151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Detection Reagents (Orange)</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OLINK</td>
<td>92007-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92004-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92002-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Mounting Medium with DAPI</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82040-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Wash Buffers Fluorescence</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82049</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using in situ pla, a proximity ligation assay

BMPs는 발달 및 생물 학적 효과의 광범위한 책임이 있습니다. BMP 수용체 다음, Smad4와 복잡한을 형성하고 그들이 BMP 특정 다운 스트림 효과 1 시작 전사 요소로 기능을 핵으로 이동시키다 (phosphorylate) Smad1/5/8 effectors를 활성화해야합니다. phospho - Smad의 펩티드에 대한 항체와 함께 전통적인 단백질 형광 기법은 낮은 감도, 높은 배경을 전시하고이 형광 감광성의 경우 그들이 특히 항체 신호의 강도에 의존하는 등 총 부량을 제공합니다. 또한, phospho - Smads 모든 Smad4 복잡한으로되지 않을 수 있으며 적극적인 녹​​음에 참여. 현장에서 플레은 높은 특이성과 민감도 2-4과 단백질 상호 작용을 검출 수있는 기술입니다. 단백질의 DNA를 대리의 증폭과 함께이 새로운 기술 커플 항체 인식. 그것은 인식 행사의 정확한 위치를 공개 장소의 형태로 지역화된, 이산 신호를 생성합니다. 신호의 수를 계산하고 측정을 제공 비교할 수 있습니다. 우리는이 신호만을 발생하는 복잡한에 근접 즉,에있는 경우에만 BMP 신호 effectors phospho-Smad1/5/8 및 Smad4의 감지를 허용 항체의 조합으로 Duolink 키트를 사용하여 현장 플레 적용 활성화. 이것은 처음 BMP4 자극 아래 시간 코스 실험에서 높은 특이성과 민감도와 신호 내생 BMP의 시각화 및 측정에 대한 허용.

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Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

여기 우리는 뼈 Morphogenetic의 단백질 (BMP) 고정 세포에 신호를 시각화하는 항체의 조합과 근접 내고 분석 (괞찮아)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 우리가 BMP4 자극을 아래에 효과기 - 단지를 활성화 내생 BMP의 핵 축적에 따라 자신의 수준 시간이 지남에를 정할 수있었습니다.

효과기 - 단지에게 사용 BMP4의 다운 스트림 신호의 감지 현장에서 괞찮아, 근접 내고 분석

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

detection-signaling-effector-complexes-downstream-bmp4-using-situ-pla

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

31.7K 조회수.  Imperial College, Hammersmith Hospital. 여기 우리는 뼈 Morphogenetic의 단백질 (BMP) 고정 세포에 신호를 시각화하는 항체의 조합과 근접 내고 분석 (괞찮아)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 우리가 BMP4 자극을 아래에 효과기 - 단지를 활성화 내생 BMP의 핵 축적에 따라 자신의 수준 시간이 지남에를 정할 수있었습니다.

비디오: Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

자기 변조 Biosensing 시스템을 사용하여 생물 학적 Assays의 급속한 동차 검색

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

대사율의 측정에<em&gt; 초파리</em&gt; Respirometry를 사용하여

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; TUNEL 방법을 사용하여

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE의 분석을 사용하여 높은 처리량 miRNA의 표적의 탐지

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석 고정 세포의

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

세포내 캘리포니아2 + 제자리에서 신호 계량 Spatio 시간적 매핑 및 입자 분석 기법에의 응용

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...