Cromatografía de intercambio iónico

Fuente: Laboratorio del Dr. B. Jill Venton - Universidad de Virginia

Cromatografía de intercambio iónico es un tipo de cromatografía que separa analitos en carga base. Una columna de relleno con una fase estacionaria cargada sobre un soporte sólido, llamado una resina de intercambio iónico se utiliza. Cromatografía de intercambio catiónico fuerte preferentemente separa a cationes mediante el uso de una resina con carga negativa mientras que la cromatografía de intercambio aniónico fuerte preferentemente selecciona a aniones usando una resina cargada positivamente. Este tipo de cromatografía es popular para la preparación de la muestra, por ejemplo en la limpieza de las proteínas o ácidos nucleicos de muestras.

Cromatografía de intercambio iónico es un proceso de dos pasos. El primer paso, la muestra se carga sobre la columna en un tampón de carga. La fijación de la muestra cargada con la resina de la columna se basa en interacciones iónicas de la resina para atraer a la muestra de la carga opuesta. Así, las muestras cargadas de polaridad opuesta a la resina están limitadas fuertemente. Otras moléculas que no están cargadas o de la carga opuesta no están limitados y se lavan a través de la columna. El segundo paso es a fin de eluir el analito que se enlaza a la resina. Esto se logra con un gradiente de sal, donde poco a poco se aumenta la cantidad de sal en el búfer. Fracciones se recogen al final de la columna como se produce la elución y la muestra purificada de interés puede ser recuperada en una de estas fracciones. Otra técnica, como la espectroscopia, puede ser necesaria para identificar la fracción que contiene la muestra. Cromatografía de intercambio iónico es especialmente útil en estudios de la proteína, para aislar las proteínas de interés que tienen una carga específica o el tamaño, tamaño puede determinar el número de interacciones con la resina.

Cromatografía de intercambio iónico es una técnica de separación más general que la cromatografía de afinidad, que es también de uso frecuente en la preparación de las muestras de proteína, donde un anticuerpo está enlazado a una columna para enlazar un analito. Debe adquirirse una nueva columna de afinidad para cada analito, mientras que el mismo tipo de columna de intercambio iónico, a menudo con diferentes condiciones de elución, se puede utilizar para limpiar muchas proteínas de la misma carga. Cromatografía de intercambio iónico puede utilizarse también en combinación con otros tipos de cromatografía que separan en base a otras propiedades. Por ejemplo, se separa de la cromatografía por exclusión de tamaño según el tamaño y podría ser utilizado antes de la cromatografía de intercambio iónico para elegir compuestos de solamente un tamaño determinado.

Cromatografía de intercambio iónico se rige por los principios de las interacciones químicas iónicas que conducen a la adsorción reversible de analito en la fase estacionaria. La fuerza de la vinculación entre la muestra y el soporte sólido se rige por el número y tipos de grupos funcionales en la muestra y la resina. El tampón de carga generalmente tiene baja conductividad para promover las interacciones entre la muestra y la resina. Resinas de intercambio catiónico fuerte típicamente cuentan con grupos de ácido sulfónico funcionales mientras que las resinas de intercambio catiónico débil tienen ácidos carboxílicos. Resinas de intercambio aniónico fuertes contienen aminas cuaternarias y resinas de intercambio aniónico débil aminas secundarias o terciarias característica. Los términos fuertes y débiles se refieren a las propiedades ácido/base del material de columna y no lo bien une un analito. Resinas débiles se cargan en un rango de pH más pequeño que las resinas fuertes, pero todavía enlazar los analitos muy con eficacia y podrían ser una buena opción si se cobran en el rango de pH necesitado. Antes de usar, columnas de intercambio iónico están equilibrados en un pH mediante un tampón de equilibrado.

Para eluir la muestra de interés, se utiliza un gradiente de sal. Las muestras menos firmemente enlazados a la resina se procederá a la elución en primer lugar, como la sal le molestará más fácilmente su vinculación iónica a la columna. Las muestras que son más bien encuadernado elución después, cuando se utilizan altas cantidades de sal. Normalmente, se utiliza un degradado lineal de sal, donde la concentración de sal aumenta con el tiempo de forma lineal. Sin embargo, los gradientes de paso pueden usarse donde la concentración de sal es intensificada con el tiempo.

Una consideración importante para los experimentos de intercambio iónico es el pH de los buffers. El pH debe ser mantenido para que el analito de interés se cobra y se unirá a la resina. Para las proteínas, la carga se basa en el punto isoeléctrico de la proteína, donde la proteína es neutral cargada y medido como pI. El pH en comparación con el pI de la proteína da información sobre la carga de la proteína esperada. En cromatografía de intercambio catiónico, elevando el pH hará que el analito que menos positivamente cargada y menos propensas a interactuar con la carga negativa resina. Del mismo modo, en cromatografía de intercambio aniónico, bajando el pH hará que el analito que carga menos negativa y menos propensos a interactuar con la resina cargada positivamente. Así también pueden utilizarse ajustes de pH para selectivamente eluir los analitos de la columna. El uso de ajustes de pH en lugar de sales podría ser ventajoso para separar dos tipos de proteínas diferentes con valores de pI diferente.

1. preparación de la muestra y la columna

1. En esta demostración, una mezcla de 2 proteínas se separan en una columna de intercambio catiónico: la hemoglobina y el citocromo C. agregar 0,2 mL de tampón de equilibrado (pH 8.1) a la muestra de proteína y vortex para mezclar bien. Centrifugar durante 2 min eliminar cualquier espuma.
2. Colocar la columna de intercambio catiónico en un tubo de ensayo durante 5 minutos permitir que la resina resolver. Abrazadera para el tubo de ensayo con la columna en un soporte de anillo para asegurarse de que esté en posición vertical.
3. Abra la tapa superior de la columna y luego la tapa inferior. Permitir que el tampón en la columna gotee hacia fuera bajo gravedad en el tubo de ensayo.
4. Lavar la columna dos veces con un columna de volumen (en este caso el volumen de la columna es de 0,3 mL) de tampón de equilibrado. Que el primer volumen de columna (0,3 mL) de goteo de tampón de equilibrado hacia fuera en el frasco de residuos antes de agregar el segundo volumen de la columna. Este paso permite la columna de equilibrar con el tampón de equilibrado. Añadir el tampón de equilibrado lentamente en este paso para no perturbar la resina.

2. ejecución de una muestra de proteína a través de una columna de intercambio catiónico

1. Poner la columna en un tubo de centrífuga de 2 mL con la etiqueta "Sin consolidar 1". Cuidadosamente coloque 0.1 mL de la muestra de proteína en la parte superior de la columna.
2. Una vez que la muestra ha sido cargada en la parte superior de la columna, lavar con 0,3 mL de tampón de equilibrado por agregar el buffer en la parte superior de la columna y dejándola gotear a través de todo el camino. Repita este paso x 4 (para un total de 5 lavados) y recoger cada lavado en un tubo de centrífuga separado, 2 mL. Etiquetar los tubos como "Desatados 1-5".
3. Para los últimos 2 lavados, centrifugue durante 10 s a 1.000 x g para asegurarse de que todas las especies salen de la columna. Cualquier muestra que se une a la columna no debe ser en estos lavados, pero muestra que no se lave bien. Centrifugación proporciona más fuerza para lavar materiales no consolidados de la columna.
4. Poner la columna en un tubo nuevo de colección 2 mL centrífuga con la etiqueta "destino 1". Poner 0,3 mL de tampón de elución (alta sal, pH 5.5) en la parte superior de la columna. Centrifugue el eluyente resultante de 10 s a 1.000 x g.
5. Repita el paso de elución 2 veces más, colocando la columna en un nuevo tubo de centrífuga, agregar 0.3 mL, y centrifugar por 10 etiqueta s. estos "Bound 2 y 3".
6. Registrar cualquier cambio de color u observaciones sobre las fracciones. La hemoglobina es una proteína de color que se ve rojizo mientras que el citocromo C es de color rojizo.

3. resultados: Intercambio catiónico de la hemoglobina y el citocromo C

1. Citocromo C tiene un pI de 10.5 y un pI de 6,8 de la hemoglobina. Así, cuando se utiliza un tampón de equilibrado pH 8.1, la hemoglobina no se une a la columna porque está cargado negativamente. Citocromo C se carga positivamente a este pH y se unen a la columna porque el pH < pI.
2. Hemoglobina se observa en la fracción no unida porque no está enlazado a la columna.
3. Citocromo C se observa en fracciones consolidados, ya que fue enlazado a la columna de intercambio catiónico.

Figura 1. Foto de la fracción no unida (hemoglobina) y fracción unida (citocromo C).

Cromatografía de intercambio iónico es ampliamente utilizada en bioquímica para aislar y purificar las muestras de proteína. Las proteínas tienen muchos aminoácidos con grupos funcionales que se cargan. Las proteínas se separan en base a la carga neta, que es dependiente del pH. Algunas proteínas son cargadas más positivamente mientras que otros están cargados más negativamente. Además, péptido pueden ser genéticamente agregan etiquetas a una proteína para darle un punto isoeléctrico que es no en la gama de proteínas normales, lo que es posible separar completamente. Cromatografía de intercambio iónico es útil para la separación de complejos de la proteína multimérica, como diversas configuraciones diferentes cantidades y diferentes interacciones.

Otra importante aplicación de cromatografía de intercambio iónico es el análisis de agua. Cromatografía de intercambio aniónico se puede utilizar para medir la concentración de aniones, como sulfatos, nitratos, nitritos, flúor y cloruro. Cromatografía de intercambio catiónico se utiliza para medir la concentración de cationes como sodio, potasio, calcio y magnesio. Un tipo de cromatografía de intercambio iónico también se utiliza en la purificación de agua, filtro suavizadores de agua como la mayoría de los iones magnesio y calcio en agua dura por atar a una resina, la cual libera sodio dependiente. Metales pesados, como cobre o plomo, también puede extraerse agua mediante cromatografía de intercambio iónico.

Cromatografía de intercambio iónico también es útil en la purificación del metal. Puede utilizarse para purificar el actanides, como el plutonio y quitar de barras de combustible de reactor nuclear gastado. También puede utilizarse para buscar uranio y eliminar del agua u otras muestras ambientales.