Method Article
El estudio de la cicatrización de heridas asociada con la lesión musculoesquelética a menudo requiere la evaluación de las interacciones in vitro entre las células de Schwann (SC), los queratinocitos y los fibroblastos. Este protocolo describe el aislamiento, cultivo y caracterización de estas células primarias del prepucio humano.
Este protocolo describe los métodos de aislamiento, las condiciones de cultivo y la caracterización de células primarias humanas con alto rendimiento y viabilidad utilizando la disociación enzimática rápida de la piel. Los queratinocitos primarios, los fibroblastos y las células de Schwann se extraen del prepucio del recién nacido humano, que está disponible siguiendo los procedimientos estándar de atención. La piel extraída se desinfecta y la grasa subcutánea y el músculo se eliminan con un bisturí. El método consiste en la separación enzimática y mecánica de las capas epidérmicas y dérmicas, seguida de una digestión enzimática adicional para obtener suspensiones unicelulares de cada una de estas capas de la piel. Finalmente, las células individuales se cultivan en medios de cultivo celular apropiados siguiendo los protocolos estándar de cultivo celular para mantener el crecimiento y la viabilidad durante semanas. Juntos, este protocolo simple permite el aislamiento, el cultivo y la caracterización de los tres tipos de células a partir de una sola pieza de piel para la evaluación in vitro de modelos de nervios de la piel. Además, estas células se pueden usar juntas en cocultivos para medir sus efectos entre sí y sus respuestas al trauma in vitro en forma de arañazos realizados robóticamente en el cultivo asociado con la cicatrización de heridas.
Las células primarias derivadas de tejido vivo y cultivadas en condiciones in vitro se asemejan mucho al estado fisiológico1, lo que las convierte en un modelo ideal para investigar procesos fisiológicos y fisiopatológicos. La piel contiene múltiples tipos de células, incluyendo queratinocitos, fibroblastos, sebocitos, melanocitos y células de Schwann (SC), que pueden aislarse y cultivarse para experimentos in vitro . No se han descrito métodos para aislar y cultivar queratinocitos, fibroblastos y SC, a partir de una sola pieza de piel. El objetivo de este protocolo es doble: 1) establecer un método confiable y reproducible para el aislamiento y cultivo de SC dérmicos y 2) utilizar un método eficiente y robusto para el aislamiento de queratinocitos, fibroblastos y SC de un solo prepucio humano.
En la actualidad, existen protocolos establecidos para aislar queratinocitos cutáneos 2,3,4 y fibroblastos 5,6. Estos estudios describen el aislamiento de queratinocitos, fibroblastos o ambos de la piel, pero ningún protocolo aborda cómo establecer cultivos de SC primarios de piel humana. Estudios recientes sugieren que los SC neuronales modulan los procesos celulares de queratinocitos y fibroblastos y regulan las funciones fisiológicas normales de la piel7. Por lo tanto, los SC son críticos para la homeostasis de la piel y contribuyen sustancialmente a la fisiología reguladora que influye en el comportamiento de los tipos de células de la piel vecinas presentes8. Por lo tanto, un protocolo que permita el aislamiento de cada uno de estos tipos de células es ideal para experimentos in vitro que involucren la comunicación célula-célula o la diafonía entre tipos de células.
Este protocolo describe el establecimiento de cultivos celulares individuales de células primarias a partir de una sola pieza de piel. Este protocolo es particularmente útil cuando la cantidad de tejido disponible es limitada. Además, el aislamiento de los tres tipos de células de un solo donante permite comparaciones sólidas entre tipos de células o experimentos de cocultivo, al tiempo que mitiga la influencia de la genética durante el experimento deseado.
La adquisición y el uso de tejido del prepucio humano no identificado con fines de investigación fue revisado y recibió la determinación de "investigación no humana" por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de Penn State (IRB # 17574).
NOTA: Siguiendo el siguiente protocolo, se obtienen 2,4 x 106 queratinocitos, 4,4 x 106 fibroblastos y 1,1 x 106 SC de un solo prepucio. En general, estas células primarias se pueden utilizar para 3 pasajes, dependiendo de las condiciones experimentales.
1. Aislamiento de células primarias y condiciones de cultivo
2. Verificación de queratinocitos epidérmicos, SC dérmicos y marcadores proteicos de fibroblastos por inmunofluorescencia
Se utilizó el prepucio neonatal normal para el aislamiento de queratinocitos epidérmicos primarios y SC y fibroblastos dérmicos. Las células primarias aisladas se cultivaron en los respectivos medios de cultivo celular que contenían factores de crecimiento. Después de la siembra de SC y fibroblastos en matraces de cultivo, la mayoría de las células se adhirieron al fondo del matraz dentro de las 2 h. En el caso de los queratinocitos, la mayoría de los queratinocitos se adhirieron por 24 h. Los queratinocitos primarios epidérmicos aislados alcanzaron el 85% de confluencia en el día 7 y exhibieron una morfología celular característica (forma de adoquín) (Figura 1A). Los SC alcanzaron el 95% de confluencia en el día 5 y aparecieron de forma bipolar o tripolar (Figura 1B). Los cultivos de fibroblastos alcanzaron el 95% de confluencia en el día 4 y la mayoría de las células exhibieron una morfología en forma de huso (Figura 1C). La expresión de proteínas específicas de tipo celular se confirmó en estos cultivos mediante tinción de inmunofluorescencia. Los queratinocitos fueron positivos para las proteínas K10 (marcador de diferenciación) y K14 (marcador de proliferación) (Figura 2A); del mismo modo, los SC fueron positivos para S100 y p75-NTR (Figura 2C). Los fibroblastos expresaron positivamente vimentina, pero no expresaron el marcador de miofibroblastos, actina del músculo liso alfa (α-SMA) (Figura 2E).
Las imágenes combinadas de inmunofluorescencia de queratina y tinción nuclear DAPI (Figura 2A) indicaron que el 97,8% de las células en los cultivos eran queratinocitos (Figura 2B). Las células de Schwann dobles S100 y p75-NTR positivas sugieren una pureza de SC del 95,2% en cultivo siguiendo el protocolo (Figura 2C,D). Del mismo modo, el 97,2% de las células en cultivos de fibroblastos expresaron positivamente vimentina (Figura 2E, F). Por lo tanto, la expresión característica de proteínas se encuentra en los respectivos tipos de células, y el protocolo permite el aislamiento de poblaciones relativamente puras de células.
Figura 1: Aislamiento de queratinocitos primarios derivados del prepucio humano, células de Schwann y fibroblastos. (A) Queratinocitos, (B) células de Schwann y (C) fibroblastos bajo microscopio de contraste de fase; barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización de queratinocitos primarios derivados del prepucio humano, células de Schwann y fibroblastos. (A) Los queratinocitos se identificaron utilizando queratina 14 (K14, queratinocitos proliferativos) y K10 (queratina 10, marcador de diferenciación de queratinocitos); barra de escala = 100 μm. (B) Análisis estadístico de la pureza de queratinocitos cultivados utilizando inmunofluorescencias de células teñidas dobles. (C) Las células de Schwann se identificaron utilizando S100 y p75-NTR (receptor del factor de crecimiento nervioso); barra de escala = 100 μm. (D) Análisis estadístico de la pureza de los SC cultivados utilizando inmunofluorescencias de células de doble teñida. (E) Los fibroblastos se identificaron utilizando vimentina (fibroblasto) y actina del músculo α liso (diferenciación de fibroblastos, miofibroblasto); barra de escala = 100 μm. (F) Análisis estadístico de la pureza de fibroblastos cultivados utilizando células teñidas con inmunofluorescencias vimentina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Este protocolo describe un método para aislar tres poblaciones celulares distintas de una sola pieza del prepucio, a saber, queratinocitos, fibroblastos y células de Schwann. Existen algunos protocolos de aislamiento disponibles para aislar queratinocitos y fibroblastos 2,3,5,6, pero ninguno describe el aislamiento SC. Además de las células estructurales clave en la piel, los queratinocitos y los fibroblastos, la piel también está altamente inervada por estructuras aferentes sensoriales y eferentes autónomas. Las aferencias sensoriales juegan un papel importante en la transmisión del tacto ligero, la vibración, el dolor, la picazón y las sensaciones de calor y frío. Las eferentes autónomas inervan las glándulas sudoríparas y los músculos arrector pili9. Cada axón nervioso está envuelto por un SC, las células gliales del sistema nervioso periférico. La investigación y los intereses clínicos en los SC han aumentado considerablemente a medida que los SC apoyan la regeneración axonal10,11. Los nervios de la piel son importantes reguladores de la fisiología de la piel y la patología de la enfermedad a través de señales de comunicación (neuromoduladores/neuromediadores) a las células no neurales 12,13,14.
A pesar de la amplia distribución de los SC nerviosos en la piel, existe información limitada sobre el papel específico de los SC en la fisiología de la piel. ¿Cómo interactúan los SC en la piel con otras células no neuronales en la piel? Responder a esta pregunta se ha visto obstaculizado por la falta de modelos confiables de cultivo celular in vitro . Por lo tanto, con este protocolo, el análisis de cada célula individual y sus interacciones con células del mismo tejido puede revelar con precisión los rasgos característicos de los roles de las células de Schwann en la homeostasis de la piel y la fisiopatología.
Una de las ventajas clave de este protocolo es un procedimiento experimental simple y económico para establecer tres células primarias (SC, queratinocitos y fibroblastos) a partir de un solo prepucio humano. También tiene la ventaja de que los tres tipos de células se aíslan del mismo tejido, mitigando así las diferencias genéticas en las comparaciones celulares y optimizando los aislamientos celulares cuando el tejido está en suministro limitado. Este protocolo tarda 2 días en realizarse y simplifica el procedimiento de aislamiento para tres células primarias del tejido de la piel y las condiciones de cultivo. Este protocolo produce de manera confiable un alto número de células viables, y los pasajes iniciales de estas células alcanzaron ~ 90% de confluencia en 4-7 días después del recubrimiento inicial. Hemos utilizado queratinocitos durante al menos 3 pasajes (~ 21 días) y las células de fibroblastos y Schwann se pueden usar durante 5-6 pasajes (~ 40 días en cultivo).
Este protocolo no está exento de desafíos técnicos. La eliminación suficiente del tejido adiposo subyacente y la separación epidérmica / dérmica eficiente antes de la digestión enzimática son clave para obtener poblaciones relativamente puras de células de cada capa de la piel. Los SC dérmicos son más difíciles de aislar de la piel debido a su prevalencia relativamente baja en la piel en comparación con los fibroblastos más numerosos. Cualquier arrastre de fibroblastos en cultivos SC superará rápidamente a los SC15. Para mejorar la adherencia al SC, optamos por pre-recubrir los artículos de cultivo de tejidos con PLL, ya que esto aumenta la adhesión de los SC16. Para mitigar aún más la contaminación por fibroblastos, se agregó arabinósido de citosina (agente antimitótico) después de que las células se hubieran adherido durante un corto período de tiempo para eliminar los fibroblastos que se dividen rápidamente de los cultivos de SC. Sin embargo, una exposición más prolongada al arabinósido de citosina también puede ser perjudicial para los SC.
La adopción del protocolo descrito anteriormente permite aislar cultivos individuales de SC de piel, queratinocitos y fibroblastos para experimentos in vitro . Estas poblaciones celulares distintas se pueden usar para investigar SC, queratinocitos y fibroblastos individualmente o en combinación durante la fisiología normal de la piel, la cicatrización de heridas o en condiciones que imitan un entorno de enfermedad.
Todos los demás autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Nos gustaría agradecer a la Dra. Fadia Kamal y al Dr. Reyad Elbarbary por permitirnos utilizar instrumentos de laboratorio y soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH (K08 AR060164-01A) y el DOD (W81XWH-16-1-0725) a J. C. E., además del apoyo institucional del Centro Médico Hershey de la Universidad Estatal de Pensilvania.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
T25 culture flask | Corning | 353109 | |
Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
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