Respuesta cardíaca a la estimulación β-adrenérgica determinada por análisis de asa presión-volumen

Aquí describimos un análisis de asa presión-volumen cardíaco bajo dosis crecientes de isoproterenol infundido por vía intravenosa para determinar la función cardíaca intrínseca y la reserva β-adrenérgica en ratones. Utilizamos un enfoque de pecho abierto modificado para las mediciones de bucle presión-volumen, en el que incluimos ventilación con presión positiva al final de la espiración.

La determinación de la función cardíaca es un análisis de punto final robusto en modelos animales de enfermedades cardiovasculares con el fin de caracterizar los efectos de tratamientos específicos en el corazón. Debido a la viabilidad de las manipulaciones genéticas, el ratón se ha convertido en el modelo animal de mamíferos más común para estudiar la función cardíaca y buscar nuevas dianas terapéuticas potenciales. Aquí describimos un protocolo para determinar la función cardíaca in vivo utilizando mediciones y análisis de asa presión-volumen durante condiciones basales y bajo estimulación β-adrenérgica por infusión intravenosa de concentraciones crecientes de isoproterenol. Proporcionamos un protocolo refinado que incluye soporte de ventilación teniendo en cuenta la presión positiva al final de la espiración para mejorar los efectos negativos durante las mediciones de tórax abierto, y analgesia potente (buprenorfina) para evitar el estrés miocárdico incontrolable evocado por el dolor durante el procedimiento. En conjunto, la descripción detallada del procedimiento y la discusión sobre posibles escollos permite un análisis de bucle presión-volumen altamente estandarizado y reproducible, reduciendo la exclusión de animales de la cohorte experimental al prevenir posibles sesgos metodológicos.

Las enfermedades cardiovasculares suelen afectar la función cardíaca. Este número señala la importancia de evaluar in vivo la función cardíaca detallada en modelos de enfermedades animales. La experimentación animal está rodeada por un marco de los tres principios rectores de las Tres R (3R) (Reducir/Refinar/Reemplazar). En caso de comprender patologías complejas que involucran respuestas sistémicas (es decir, enfermedades cardiovasculares) en el nivel de desarrollo actual, la opción principal es refinar los métodos disponibles. El refinamiento también conducirá a una reducción del número de animales requerido debido a una menor variabilidad, lo que mejora el poder del análisis y las conclusiones. Además, la combinación de mediciones de contractilidad cardíaca con modelos animales de enfermedad cardíaca, incluidos los inducidos por estimulación neurohumoral o por sobrecarga de presión como bandas aórticas, que imita, por ejemplo, los niveles alterados de catecolaminas / β-adrenérgicos^1,2,3,4, proporciona un método poderoso para estudios preclínicos. Teniendo en cuenta que el método basado en catéter sigue siendo el enfoque más utilizado para la evaluación en profundidad de la contractilidad cardíaca⁵, nuestro objetivo fue presentar aquí una medición refinada de la función cardíaca in vivo en ratones mediante mediciones de asa de presión-volumen (PVL) durante la estimulación β-adrenérgica basada en la experiencia previa, incluida la evaluación de parámetros específicos de este enfoque^{6, 7}.

Para determinar los parámetros hemodinámicos cardíacos se dispone de enfoques que incluyen técnicas basadas en imágenes o catéteres. Ambas opciones van acompañadas de ventajas y desventajas que deben considerarse cuidadosamente para la cuestión científica respectiva. Los enfoques de imágenes incluyen ecocardiografía y resonancia magnética (MRI); ambos se han utilizado con éxito en ratones. Las mediciones ecocardiográficas implican altos costos iniciales de una sonda de alta velocidad requerida para la alta frecuencia cardíaca de los ratones; es un enfoque no invasivo relativamente sencillo, pero es variable entre los operadores que idealmente deberían tener experiencia en el reconocimiento y visualización de estructuras cardíacas. Además, no se pueden realizar mediciones de presión directamente y los cálculos se obtienen a partir de la combinación de magnitudes de tamaño y mediciones de flujo. Por otro lado, tiene la ventaja de que se pueden realizar varias mediciones en el mismo animal y la función cardíaca se puede monitorear, por ejemplo, durante la progresión de la enfermedad. En cuanto a la medición de volumen, la resonancia magnética es el procedimiento estándar de oro, pero similar a la ecocardiografía, no es posible realizar mediciones de presión directa y solo se pueden obtener parámetros dependientes de la precarga⁸. Los factores limitantes son también la disponibilidad, el esfuerzo de análisis y los costos operativos. Aquí los métodos basados en catéteres para medir la función cardíaca son una buena alternativa que además permiten el monitoreo directo de la presión intracardíaca y la determinación de parámetros de contractilidad independientes de la carga, como el trabajo de accidente cerebrovascular reclutable precarga (PRSW)⁹. Sin embargo, los volúmenes ventriculares medidos por un catéter de conductancia de presión (mediante determinación de conductividad) son menores que los de la resonancia magnética, pero las diferencias de grupo se mantienen en el mismo rango¹⁰. Para determinar valores de volumen confiables, se requiere la calibración correspondiente, que es un paso crítico durante las mediciones de PVL. Combina mediciones ex vivo de la conductividad sanguínea en cubetas calibradas por volumen (conversión de conductancia a volumen) con el análisis in vivo para la conductancia paralela del miocardio durante la inyección en bolo de la solución salina hipertónica^11,12. Más allá de eso, el posicionamiento del catéter dentro del ventrículo y la orientación correcta de los electrodos a lo largo del eje longitudinal del ventrículo son críticos para la capacidad de detección del campo eléctrico circundante producido por ellos. Aún con el tamaño reducido del corazón de ratón es posible evitar artefactos producidos por cambios en la orientación intraventricular del catéter, incluso en ventrículos dilatados^5,10,pero los artefactos pueden evolucionar bajo estimulación β-adrenérgica^6,13. Además de los métodos de conductancia, el desarrollo del método basado en la admisión parecía evitar los pasos de calibración, pero aquí los valores de volumen están bastante sobreestimados^14,15.

Dado que el ratón es uno de los modelos preclínicos más importantes en la investigación cardiovascular y la reserva β-adrenérgica del corazón es de interés central en la fisiología y patología cardíaca, aquí presentamos un protocolo refinado para determinar la función cardíaca in vivo en ratones mediante mediciones de PVL durante la estimulación β-adrenérgica.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con las regulaciones del Consejo Regional de Karlsruhe y la Universidad de Heidelberg (AZ 35-9185.82 /A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) se ajustan a las directrices de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos. Los datos mostrados en este protocolo se derivan de ratones machos salvajes tipo C57Bl6 / N (17 ± 1,4 semanas de edad). Los ratones se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos en la instalación de animales (IBF) de la Facultad de Medicina de Heidelberg. Los ratones fueron alojados en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas, con una humedad relativa entre el 56-60%, un cambio de aire de 15 veces por hora y una temperatura ambiente de 22 ° C + / - 2 ° C. Se mantuvieron en jaulas convencionales tipo II o tipo II provistas de ropa de cama para animales y papeles de seda como enriquecimiento. Los alimentos estándar en autoclave y el agua en autoclave estaban disponibles para consumir ad libitum.

1. Preparación de instrumentos y soluciones farmacológicas

1. Catéter venoso central: Corte el microtubo (0,6 mm de diámetro exterior) en tubos de catéter de ~20 cm de largo. Use fórceps para tirar de un extremo del tubo en la punta de una cánula de calibre 23. Corte el otro extremo del tubo en diagonal para crear una punta afilada que pueda perforar la vena femoral.
2. Tubo endotraqueal: Para un tubo de intubación corte una cánula de venopunción de calibre 20 de 3 cm de longitud para quitar la fijación de la jeringa.
   1. Si el tubo de intubación no se ajusta perfectamente a la conexión del ventilador, envuelva la parapelícula sobre el extremo del tubo donde está conectado el dispositivo de ventilación. La conexión debe ser estable y sellada por el espesamiento (Figura 1A). Acorte el pasador guía metálico de la cánula de venopunción de calibre 20 a 2,7 cm y úselo como ayuda para la intubación. Los enfoques refinados para la intubación, incluidas las fibras ligeras para facilitar la visualización de la tráquea, también están bien descritos, por ejemplo, por Das y colaboradores¹⁶.
3. Mezcla anestésica utilizada para la intubación: Mezclar 200 μL de heparina (1000 UI/ml) con 50 μL de NaCl al 0,9% y 750 μL de etomidato de 2 mg/ml de un producto a base de emulsión de aceite en agua. Utilizar 7 μL/g de peso corporal (BW) para cada ratón (0,1 mg/kg de buprenorfina 10 mg/kg de etomidato de peso corporal).
4. Relajante muscular: Disolver 100 mg de bromuro de pancuronio en 100 ml de NaCl al 0,9%. Utilice 1,0 μL/g de peso corporal (1 mg/kg de peso corporal) para cada ratón.
5. Soluciones de isoproterenol: Disolver 100 mg de isoproterenol en 100 mL de NaCl al 0,9% (1 μg/μL). Preparar las siguientes diluciones (Tabla 1) y transferir cada una en una jeringa de 1 ml.
   1. Para obtener la dilución 1, diluya el caldo 1:1.8. Para obtener la dilución 2, diluya el caldo 1:6. Para obtener la dilución 3, diluya la dilución 1 en 1:10. Finalmente, obtener la dilución 4 por una dilución 1:10 de la dilución 2.
6. NaCl hipertónico al 15% (p/v): Disolver 1,5 g de NaCl al 0,9% en 10 ml de H₂O doble destilado. Filtrar la solución con un filtro de jeringa de poro de 0,45 μm.
7. Preparación de solución de albúmina al 12,5% (p/v): Disolver 1,25 g de albúmina sérica bovina en 10 mL de NaCl al 0,9%. Incubar la solución a 37 °C durante 30 min. Enfríe a temperatura ambiente y filtre la solución con un filtro de jeringa de poro de 0,45 μm.
8. Preparación de la configuración: Primero encienda la placa de calentamiento y configúrela a 39-40 ° C. Coloque una jeringa llena de solución salina en la almohadilla térmica y transfiera el catéter de asa de presión-volumen (PVL) a la jeringa. Preincubar el catéter durante al menos 30 minutos antes de usarlo para la estabilización. La configuración que utilizamos consiste en un catéter de conductancia de presión 1.4-F, una unidad de control y el software correspondiente, y se describe gráficamente en la Figura 1B y las referencias del proveedor se enumeran en la Tabla de Materiales.

2. Anestesia

1. Inyecte buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal por vía intraperitoneal) 30 min antes de la intubación.
2. Coloque el ratón en una cámara de vidrio acrílico presaturada con 2,5% de isoflurano y precalentada con una almohadilla térmica colocada en la base de la cámara.
3. Tan pronto como el ratón duerma (falta de reflejo), inyecte la mezcla anestésica (7 ml/kg de peso corporal) que contiene 10 mg/kg de etomidato y heparina (1.200 UI/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal.

3. Ventilación

1. Transfiera al animal a la plataforma de intubación (Figura 1C) 3-4 minutos después de la inyección anestésica. El ratón cuelga de los dientes con la vista dorsal mirando hacia el operador.
2. Levante suavemente la lengua con fórceps. Para identificar la glotis, levante ligeramente la mandíbula inferior del ratón con segundas pinzas.
3. Inserte cuidadosamente el tubo endotraqueal(Figura 1A)en la tráquea y retire la varilla guía.
4. Transfiera el animal a la placa calefactora, colóquelo en la parte posterior y conecte el tubo de intubación al respirador del animal pequeño.
5. Ajustar la frecuencia respiratoria a 53.5 x (Peso corporal en gramos)^-0.26 [min^-1],según lo descrito por otros¹², y los volúmenes corrientes a presiones inspiratorias máximas de 11 ± 1 cmH₂O. Establecer una PEEP de 2 cmH₂O.
6. Fije cuidadosamente las extremidades del ratón en la placa calefactora con tiras adhesivas y aplique ungüento para los ojos en ambos ojos para evitar la sequedad.
7. Inserte una sonda de temperatura rectal y mantenga la temperatura corporal central a 37 ± 0,2 °C.
8. Instale un ECG de 1 derivación y controle la frecuencia cardíaca en línea como indicador de la profundidad y estabilidad de la anestesia.
9. En ausencia de reflejos interdigitales, inyectar 1 mg/kg de peso corporal del relajante muscular pancuronio-bromuro por vía intraperitoneal. Esto evita los artefactos respiratorios durante las mediciones de PVL.

4. Cirugía

1. Recomendaciones generales
   1. Durante la cirugía, ventile con ~1.5-2% de isoflurano vaporizado con O_2. La concentración de isoflurano también puede depender de variables como la cepa del ratón, el sexo, la edad y el peso de los animales, pero debe determinarse individual y experimentalmente y los valores aquí son referencia para la cepa de ratón C57BL6 / N. Es importante destacar que el ventilador está conectado a un sistema de extracción para evitar que el operador inhale isoflurano.
   2. Use un aumento entre 1.5-4x del microscopio estereoscópico para procedimientos quirúrgicos.
      NOTA: Consulte la guía institucional / local sobre la preparación del animal para cirugías que no son de supervivencia.
2. Canulación femoral
   1. Enjuague la extremidad posterior con etanol al 70%, incise la región inguinal izquierda y exponga la vena femoral izquierda.
   2. Blast de la arteria epigástrica y la vena con una cauterización.
   3. Ligar la vena femoral con una sutura colocada distal al acceso del catéter.
   4. Pase una sutura debajo de la vena femoral y prepare un nudo craneal del sitio de punción. Punción de la vena femoral con el microtubo preparado (ver paso 1.1) conectado a una jeringa de 1 ml.
   5. Ate el nudo para fijar el tubo dentro del recipiente.
   6. Contrarrestar la pérdida de líquido mediante la infusión de NaCl al 0,9% suplementado con albúmina al 12,5% a una velocidad de perfusión de 15 μL/min con una bomba de jeringa automática. Además, mantenga el tejido expuesto húmedo usando NaCl al 0,9% precalentado.
3. Toracotomía
   1. Enjuague el tórax con etanol al 70%.
   2. Incite la piel justo debajo del proceso xifoideo y separe sin rodeos los músculos pectorales de la pared torácica con fórceps o un cauterizado.
   3. Levante el proceso xifoideo con fórceps y luego corte a través de la pared torácica moviéndose lateralmente en ambos lados con una cauterización hasta que el diafragma sea completamente visible desde abajo.
   4. Incise el diafragma desde abajo y exponga el ápice cardíaco. Luego retire cuidadosamente el pericardio con fórceps.
   5. Realizar una costotomía limitada en el lado izquierdo como se describió anteriormente⁶.
   6. Pase una sutura debajo de la vena cava inferior para realizar la reducción de la precarga durante las etapas posteriores.
   7. Puncionar suavemente el ápice cardíaco con una cánula de calibre 25 (máximo 4 mm). Retire la cánula e inserte el catéter fotovoltaico hasta que todos los electrodos estén dentro del ventrículo.
   8. Ajuste la posición del catéter mediante movimientos suaves y giros hasta obtener asas de forma rectangular (Figura 2A).
   9. Mantenga siempre húmedo todo el tejido expuesto usando NaCl al 0,9% precalentado.

5. Medidas

1. Recomendaciones generales
   1. Durante las mediciones, ventile con ~1.5-2% de isoflurano vaporizado con 100% de O_2.
   2. Realice 2 mediciones basales, así como 2 oclusiones de vena cava en cada paso del protocolo de respuesta a la dosis.
      NOTA: Es importante que después de la primera y segunda oclusión de la vena cava, tanto los valores de presión como los de volumen vuelvan a los valores de estado estacionario como antes de la primera oclusión. Esta observación es necesaria para reconocer un cambio en la posición del catéter debido a reducciones seriadas en el volumen intraventricular. Si un cambio en la posición del catéter fuera el caso, especialmente los valores de volumen se desplazarían.
2. Realizar un análisis on-line de parámetros (frecuencia cardíaca, volumen sistólico, dP/dt_max)y esperar hasta que se obtenga la función cardíaca en estado estacionario. Para el rango de parámetros esperado con la configuración aquí utilizada en ratones C57Bl6 / N, consulte los resultados publicados⁶.
3. Detenga el respirador en la posición espiratoria final y registre los parámetros basales. Después de 3 a 5 segundos, reduzca la precarga cardíaca levantando la sutura debajo de la vena cava inferior con fórceps para obtener parámetros independientes de precarga (Figura 2B). Encienda el ventilador. Espere al menos 30 segundos para la segunda oclusión hasta que los parámetros hemodinámicos se estabilicen.
4. Después de obtener las mediciones en condiciones basales, proceda a la dosis-respuesta de isoproterenol cambiando a las jeringas preparadas. Aquí la velocidad de infusión se mantiene sin cambios para evitar modificaciones de la precarga cardíaca. Tenga cuidado de no infundir burbujas de aire al cambiar la jeringa.
   1. Espere al menos 2 minutos hasta que se obtenga una nueva función cardíaca en estado estacionario para detener nuevamente el respirador en la posición espiratoria final y registrar los parámetros basales. Después de 3 a 5 segundos, reduzca la precarga cardíaca levantando la sutura debajo de la vena caval inferior para obtener parámetros independientes de precarga.
   2. Espere al menos 30 segundos para la segunda oclusión. Luego cambie a la jeringa preparada con la siguiente concentración de isoproterenol y repita los registros de los parámetros independientes de línea de base y precarga.
      NOTA: Artefactos como el pico de presión sistólica final (ESPS, Figura 2C)pueden ocurrir durante el aumento en la dosis de isoproterenol, que resulta del atrapamiento del catéter. Los artefactos que ocurren antes del inicio de los parámetros basales se pueden corregir fácilmente mediante el reposicionamiento del catéter.

6. Calibración

NOTA: Los procedimientos de calibración pueden variar según el sistema PVL utilizado.

1. Calibración de conductancia paralela
   1. Conecte una jeringa que contenga una solución de NaCl al 15% a la cánula femoral después de la última medición de la dosis-respuesta de isoproterenol. Infundir cuidadosamente 5 μL de la solución hipertónica que queda en el tubo hasta que la PVL se desplace ligeramente hacia la derecha durante la visualización en línea. Luego espere hasta que los bucles vuelvan al estado estacionario.
   2. Detenga el respirador al final de la espiración e inyecte un bolo de 10 μL de NaCl al 15% en 2 a 3 segundos. Compruebe si los PVL se amplían en gran medida y se desplazan hacia la derecha durante la visualización en línea.
2. Calibración de conductancia a volumen
   1. Espere 5 minutos, nada menos, para que el bolo salino hipertónico se diluya por completo. Posteriormente, retire el catéter y extraiga al menos 600 μL de sangre del ventrículo izquierdo del corazón que late con una jeringa de 1 ml y una cánula de calibre 21. En este punto de tiempo, el animal es sacrificado bajo anestesia profunda y analgesia por sangrado masivo, al detener la ventilación y la extracción del corazón.
   2. Transfiera la sangre a la cubeta de calibración precalentada (en un baño de agua a 37 °C) con cilindros de volumen conocido. Coloque el catéter fotovoltaico centralmente en cada cilindro y registre la conductancia. Al calcular una curva estándar para cada animal, las unidades de conductancia se pueden convertir en valores de volumen absolutos.

7. Análisis

1. Después de mediciones exitosas de PVL en condiciones basales y estimulación de isoproterenol, visualice, digitalice, calcule y extraiga parámetros que caracterizan la función cardíaca (como PRSW, dP / dt, presión y volumen diastólico final, presión y volumen sistólicos finales, tau constante de relajación, entre otros) utilizando un software de análisis PVL apropiado. Se pueden realizar análisis estadísticos adicionales y representaciones gráficas con un software de análisis estándar.
2. Análisis de parámetros independientes de precarga
   NOTA: Para este paso es crucial estandarizar el procedimiento.
   1. Seleccione los primeros 5-6 PVL que muestren una precarga decreciente en todas las mediciones para el análisis de parámetros independientes de precarga(Figura 2D). Un número constante de PVL seleccionados para el análisis durante la reducción de precarga disminuirá la variabilidad entre las mediciones de los parámetros obtenidos.
   2. Calcule el valor medio de las dos mediciones en cada paso del protocolo.

La medición del bucle de volumen de presión (PVL) es una herramienta poderosa para analizar la farmacodinámica cardíaca de los medicamentos e investigar el fenotipo cardíaco de los modelos de ratón modificados genéticamente en condiciones normales y patológicas. El protocolo permite la evaluación de la reserva cardíaca β-adrenérgica en el modelo de ratón adulto. Aquí describimos un método de pecho abierto bajo anestesia isoflurano combinado con buprenorfina (analgésico) y pancuronio (relajante muscular), que se centra en la respuesta cardíaca a la estimulación β-adrenérgica mediante la infusión de concentraciones de isoproterenol a través de un catéter de vena femoral. Algunos datos representativos mostrados en este protocolo se derivan de ratones machos adultos de tipo salvaje C57Bl6/N(Figura 3 y Tabla 2). Como indicador de la variabilidad de algunos parámetros importantes medidos por nuestro análisis PVL, realizamos un análisis de potencia (α probabilidad de error de 0,05 y potencia de 0,8) utilizando los resultados del grupo WT y el software G*Power disponible^{gratuitamente 17.} En la Tabla 3 se representan los tamaños de efecto calculados y los tamaños de muestra requeridos para la frecuencia cardíaca, PRSW, volumen sistólico, la constante de relajación Tau, dP/dt_max y dP/dt_min asumiendo cambios entre 10% y 30% para cada parámetro bajo 0, 0.825 y 8.25 ng/min isoproterenol.

El análisis gráfico de las relaciones presión-volumen se realiza trazando el volumen (μL) en el eje Y y la presión (mmHg). Si el catéter se coloca correctamente dentro del ventrículo, un ciclo cardíaco completo está representado por un PVL de forma rectangular(Figura 2A y Figura 3A). En breve, la sístole comienza con una fase de contracción isovolumétrica (caracterizada por dP/dt_max),durante la cual ambas válvulas cardíacas se cierran (borde vertical derecho). Cuando la presión ventricular excede la presión aórtica, la válvula aórtica se abre y la sangre se bombea a la aorta durante la fase de eyección (horizontal superior). Posteriormente, cuando la presión aórtica excede la presión ventricular, la válvula aórtica se cierra y comienza la diástole. Durante la relajación isovolumétrica (caracterizada por los parámetros dP/dt_min y Tau) la presión ventricular disminuye hasta que la presión auricular supera la presión ventricular y se abre la válvula mitral (borde vertical izquierdo). Ahora el llenado diastólico pasivo, caracterizado por la relación presión-volumen diastólica final (EDPVR), tiene lugar hasta que comienza el siguiente ciclo cardíaco (horizontal inferior)(Figura 2A-B).

El análisis de PVL proporciona información detallada sobre la función cardíaca, ya que es capaz de determinar la función cardíaca independientemente de la precarga cardíaca. Por lo tanto, se ha descrito como el estándar de oro para determinar la función cardíaca en configuraciones experimentales⁵. En el protocolo descrito utilizando ratones C57Bl6/N, evaluamos la respuesta al isoproterenol producida en parámetros generales de la función cardíaca como la frecuencia cardíaca, el gasto cardíaco, el volumen sistólico y el trabajo sistólico. Se observa un efecto significativo del isoproterenol en cada parámetro en la respuesta a la dosis bajo diferentes concentraciones de isoproterenol (Figura 3B). Los parámetros de contractilidad cardíaca como PRSW y dP/dt_max mostraron el aumento esperado en la dosis-respuesta bajo infusión de isoproterenol(Figura 3A-B). Por otro lado, se registró una reducción de los parámetros diastólicos (constante de relajación Tau y dP/dt_min)con concentraciones crecientes de isoproterenol(Figura 3C)como esperada de un efecto lusitrópico positivo producido por catecolaminas en el corazón sano. Otros parámetros de los que se muestran en la Figura 3 (es decir, presión y volumen sistólico final, presión y volumen diastólico final, presión máxima, entre otros) también se obtienen del análisis de PVL y también se pueden analizar según la cuestión científica, el modelo genético o de enfermedad y las observaciones obtenidas. Se han reportado previamente valores adicionales y detallados para los parámetros más comunes de la función cardíaca en PVL en cada paso durante la estimulación incremental β-adrenérgica, incluido el punto de tiempo de calibración para la conductancia paralela con solución salina hipertónica que influye altamente en los parámetros de volumen cardíaco, pero también en la inotropía cardíaca y la relajación^1,6.

Figura 1. Configuración del bucle de anestesia y presión-volumen. (A) Cánula de venopunción de calibre 20 adaptada para la intubación de ratón. (B) Diagrama que muestra la organización y conexión de los diferentes componentes de la configuración de medición de presión-volumen utilizada, incluida la dirección del flujo del gas anestésico. (C) Plataforma de intubación utilizada para colgar los ratones para una intubación rápida y segura. Se incluyen tornillos (i) en ambos lados al final de la rosca colgante (ii) para apretar la amenaza dependiendo del peso del ratón. La flecha indica una posibilidad de conexión para la exposición al isoflurano. Temp.: Temperatura; ECG: Electrocardiograma; MinP_exp: Presión espiratoria mínima; MaxP_exp: Presión espiratoria máxima; PV: Presión-volumen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Análisis representativo de presión-volumen. (A) Registros ejemplares de presión-volumen donde se muestran los parámetros analizados durante la medición basal y se representan los principales eventos durante el ciclo cardíaco. (B) Los parámetros ESPVR, EDPVR y PRSW se representan durante la reducción de la precarga. (C) Se presentan picos de presión sistólica final durante las mediciones basales (panel superior) o durante la maniobra de oclusión (panel inferior) ambos bajo estimulación isoproterenol. VI: Ventrículo izquierdo; dP/dt_min: Mínimo dP/dt; dP/dt_max: Máximo dP/dt; V_es: Volumen sistólico final; V_ed: Volumen diastólico final; ESPVR: Relación presión-volumen sistólico final; PRSW: Precarga de trabajo de carrera reclutable; EDPVR: Relación presión-volumen diastólica final. La figura fue adaptada del suplemento de nuestro trabajo anterior 2019⁶. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Análisis de mediciones de PVL en ratones C57BL6/N. (A) PVL representativos durante la oclusión de la vena caval inferior de ratones control C57BL6/N y sometidos a concentraciones crecientes de isoproterenol. (B) La función cardíaca general durante las condiciones basales y durante el isoproterenol se describe mediante el análisis de la frecuencia cardíaca, el gasto cardíaco, el volumen sistólico y el trabajo sistólico. (C) Se analizaron parámetros adicionales para evaluar la contractilidad cardíaca y la función diastólica como prSW, la constante de relajación Tau (Ecuación de Weiss¹⁸⁾y la dP/dt máxima y mínima. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. BPM: Latidos por minuto; PRSW: Precarga de trabajo de carrera reclutable; n: número de ratones. **p < 0,01: valores p de la prueba t de Student emparejada contra la condición basal (isoproterenol = 0 ng/min). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Dilución de isoproterenol para aumentar la estimulación β-adrenérgica.  Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2. Análisis de mediciones de PVL en ratones C57BL6/N. Parámetros de PVL de la función cardíaca durante las condiciones basales y durante la infusión de isoproterenol. Los datos se presentan como desviación media ± estándar de 18 ratones adultos machos. PV: Volumen de presión; BPM: Latidos por minuto; ESPVR: Pendiente de la relación PV-sistólica final, cálculo insuficiente a volúmenes intraventriculares bajos (2.475 y 8.25 ng/min Isoproterenol); EDPVR: Relación PV diastólica final, regresión exponencial (coeficiente alfa). Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3. Tamaño del efecto estimado y tamaño de muestra requerido para parámetros seleccionados basados en valores observados en ratones machos C57BL6/N. Delta representa una diferencia hipotética en el parámetro entre un control (es decir, tipo salvaje) y un grupo de tratamiento. El tamaño del efecto y el tamaño de muestra requerido por grupo se calculan utilizando datos de control (media y desviación estándar), error alfa (0,05) y potencia (0,8) a través de G*Power ¹⁹. Los valores en negrita (fondos verdes en la versión en línea de la tabla) indican un tamaño de efecto umbral sugerido (1≤) y el tamaño de la muestra para cada parámetro en cada dosis de isoproterenol. dP/dt_min: Mínimo dP/dt; dP/dt_max: Máximo dP/dt. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Aquí, proporcionamos un protocolo para analizar la función cardíaca in vivo en ratones bajo estimulación β-adrenérgica creciente. El procedimiento se puede utilizar para abordar tanto los parámetros basales de la función cardíaca como la reserva adrenérgica (por ejemplo, inotropía y cronotropía) en ratones modificados genéticamente o en intervenciones. La ventaja más destacada de las mediciones de bucle de presión-volumen (PVL) en comparación con otros medios para determinar la función cardíaca es el análisis de la función cardíaca intrínseca e independiente de la carga. Todos los demás métodos (por ejemplo, resonancia magnética y ecocardiografía) solo pueden evaluar los parámetros dependientes de la carga de la función cardíaca y, especialmente, la contractilidad cardíaca no se puede determinar de manera confiable. Esto hace que las mediciones de PVL sean el estándar de oro para las mediciones de punto final del análisis en profundidad de la función cardíaca⁵. Sin embargo, los métodos nombrados anteriormente permiten el análisis secuencial de la función cardíaca, poniéndolos a la vanguardia para las observaciones longitudinales (por ejemplo, durante la progresión de la enfermedad). Además, los volúmenes intraventriculares, y posteriormente el volumen sistólico y otros parámetros derivados, pueden subestimarse en las mediciones de PVL en comparación con la resonancia magnética en ratones²⁰.

Hay cuatro pasos críticos durante el protocolo que son cruciales para obtener datos válidos de PVL: 1) Intubación, 2) colocación del catéter de vena femoral, 3) colocación del catéter de conductancia de presión y 4) el régimen periprocedimental. La intubación no invasiva de ratones requiere cierta experiencia y es complicada cuando se usa isoflurano, ya que el marco de tiempo para la intubación es estrecho (20 - 40 s). Por lo tanto, después de la intubación, la colocación correcta del tubo debe verificarse cuidadosamente examinando los movimientos del tórax murino al alterar la frecuencia respiratoria de los ventiladores. Para ampliar la ventana para la intubación, describimos aquí el uso concomitante del etomidato hipnótico de acción corta. Además, las fibras ligeras para facilitar la visualización de la glotis están disponibles¹⁶. La colocación adecuada del catéter de la vena femoral es esencial para la aplicación de isoproterenol durante las etapas posteriores. Durante este paso, la embolia aérea puede dañar gravemente a los animales induciendo la embolia pulmonar. La colocación correcta del catéter femoral se puede comprobar inicialmente mediante una aspiración cuidadosa de sangre venosa. Cuando la colocación adecuada del catéter es incierta durante las etapas posteriores, se puede examinar el volumen diastólico final, que debe aumentar en respuesta al más mínimo bolo al visualizar PVL en línea. Contrariamente a la mayoría de los otros investigadores, aquí describimos la canulación de la vena femoral, mientras que otros utilizaron con mayor frecuencia la vena yugular como el vaso objetivo para el acceso venoso central^12,21. Este enfoque tiene la ventaja de no manipular cerca del nervio vago, como se hace en el enfoque de pecho cercano cuando se prepara la carótida, y por lo tanto asumimos que se evita la estimulación potencial del sistema parasimpático simplemente tocando / dañando el nervio. La colocación adecuada del catéter PV dentro del ventrículo es crucial para obtener datos significativos, especialmente en lo que respecta a los parámetros de volumen. Cuando los electrodos no están completamente dentro del ventrículo o el catéter no se coloca correctamente a lo largo del eje longitudinal del ventrículo, los parámetros de volumen están muy subestimados. Además, el contacto entre el endocardio y el transductor de presión causa picos de presión sistólica final que no deben tolerarse durante las mediciones basales⁶. Por último, el régimen periprocedimental que incluye la profundidad de la anestesia y el manejo de líquidos tiene un impacto significativo en la confiabilidad de los datos de PVL en ratones. La dosis anestésica insuficiente o excesiva puede afectar gravemente los parámetros hemodinámicos, lo que con mayor frecuencia resulta en una función cardíaca reducida. La pérdida de líquidos, que se debe principalmente a la pérdida de sangre y la evaporación, debe contrarrestarse con la infusión constante de soluciones adecuadas como albúmina al 12,5% disuelta en NaCl al 0,9%, que recomendamos. Siendo que el abordaje es muy invasivo, no menos importante es la inclusión de un analgésico potente como la buprenorfina para minimizar las influencias en las funciones cardiovasculares evocadas por una evitación insuficiente del dolor. Inyectamos el fármaco analgésico antes de la intubación. Es importante realizar la inyección ~ 30 minutos antes de comenzar todo el procedimiento, especialmente si el operador tiene experiencia, y por lo tanto rápido, para alcanzar un efecto analgésico adecuado evitando cualquier dolor durante la fase de investigación. Además, cuando se trabaja con modelos obesos probablemente se deben considerar dosis más altas debido a la alta lipofilia de esta sustancia. Finalmente, este protocolo también puede modificarse para determinar la respuesta a otros estímulos catecolaminérgicos como la dobutamina o la epinefrina; como por ejemplo lo hicieron Calligaris y sus colegas²² que describieron el análisis en la presión intraventricular durante la estimulación con dobutamina.

Con respecto al registro y análisis de las mediciones de PVL, hay varios pasos que deben considerarse. En primer lugar, es de gran importancia analizar consistentemente las grabaciones de PVL en un conjunto de datos experimentales. Los artefactos respiratorios que evolucionan debido a la alternancia de la presión pulmonar que resulta en la alternancia de la precarga cardíaca durante la ventilación mecánica deben evitarse apagando el ventilador durante las grabaciones. Para eliminar aún más los artefactos respiratorios, recomendamos usar el relajante muscular pancuronio para prevenir las contracciones del diafragma que se ven con frecuencia durante la anestesia con isoflurano. Además, hace factible detener la ventilación al final-espiración y analizar todos los bucles seleccionados, a diferencia de otros protocolos que recomiendan seleccionar 8-10 bucles y luego identificar 5-6 bucles end-espiratorios que posteriormente se analizan²³. Es importante destacar que los períodos de apnea deben mantenerse cortos para evitar la hipoventilación que resulta en hipercapnia y acidosis respiratoria. Para mejorar la oxigenación y prevenir la formación de atelectasia, examinamos previamente el uso de la ventilación PEEP durante las mediciones de PVL en ratones⁶. Al seleccionar bucles para el análisis de datos independientes de precarga, seleccione los primeros 5-6 bucles que muestren un volumen diastólico final decreciente y evite incluir bucles donde solo la presión está disminuyendo, pero el volumen es constante. Además, los latidos adicionales no deben incluirse en el análisis, ya que afectan de manera crucial a los parámetros de PVL. Sorprendentemente, la mayoría de las veces los latidos arrítmicos ocurren debido al contacto entre la sutura de oclusión y el corazón murino. La calibración para la conductancia paralela mediante infusión de solución salina hipertónica tiene un tremendo impacto en los parámetros de la función cardíaca y, a nuestro entender, debe realizarse al final de un experimento⁶. En particular, debido a su impacto en la función cardíaca, la calibración para la conductancia paralela se realiza solo una vez durante el protocolo. Sin embargo, la conductancia paralela cambia ligeramente durante el protocolo, debido a cambios en la forma de los ventrículos tras la estimulación adrenérgica. Los sistemas de admisión para evaluaciones de PVL en ratones están disponibles que no tienen necesidad de calibraciones salinas y pueden calcular la conductancia paralela dinámicamente a través de los registros de PVL. Sin embargo, la precisión de este método todavía está en debate^5,8,24,25.

Determinamos a partir de nuestras observaciones que cuando se utiliza este protocolo en ratones machos adultos sanos de tipo salvaje (es decir, C57Bl6 / N), la presión sistólica está en el rango de 70 mmHg a 90 mmHg al inicio y entre 80 y 100 mmHg durante la estimulación máxima con el agonista β-adrenoreceptor isoproterenol. Asimismo, se observó que el volumen sistólico estaba en el rango de 13 μL a 20 μL al inicio y entre 20 μL y 35 μL durante la estimulación máxima. La frecuencia cardíaca fue de alrededor de 450 a 520 latidos por minuto al inicio del estudio y puede superar los 650 latidos por minuto durante la estimulación máxima. En cuanto a la contractilidad cardíaca independiente de la precarga, el parámetro más robusto del trabajo de accidente cerebrovascular reclutable de precarga (PRSW) se consideró adecuado entre 60 mmHg y 80 mmHg al inicio y entre 100 mmHg y 140 mmHg durante la estimulación máxima. Si los parámetros basales difieren significativamente de los que generalmente se obtienen, o cuando la función cardíaca reacciona inadecuadamente a la estimulación β-adrenérgica, se deben tener en cuenta las complicaciones (por ejemplo, pérdida de sangre no observada, caída / aumento de la temperatura corporal o dosis anestésica excesiva / insuficiente).

Además, algunos artefactos pueden surgir durante las mediciones de PVL en ratones. El artefacto más común es el pico de presión sistólica final (ESPS, Figura 2C),que resulta del atrapamiento del catéter y es fácilmente rectificable al volver a colocar el catéter antes de las mediciones basales a 0 ng / min de isoproterenol. Las mediciones no deben comenzar antes de que los ESPS sean erradicados en las condiciones basales para obtener datos significativos, ya que el ESPS puede afectar varios parámetros de la función cardíaca⁶. Sin embargo, cuando se produce un ESPS durante la estimulación incremental con isoproterenol debido a la alteración de la morfología ventricular en mediciones no afectadas al inicio del estudio, esto no es rectificable, ya que el reposicionamiento del catéter alteraría la conductancia paralela durante el protocolo de respuesta a la dosis. Hay que examinar esto de cerca, ya que, al igual que los de referencia, se ha demostrado que estos ESPS alteran significativamente los parámetros de la función cardíaca no solo a través de un aumento significativo de la presión máxima^13,26, sino también a través de la detección de volumen reducido⁶.

Los valores representativos para los parámetros hemodinámicos obtenidos mediante mediciones de PVL en condiciones basales y durante la estimulación incremental con isoproterenol en ratones varían ampliamente con diferentes enfoques metodológicos y en diferentes cepas de^{ratón 27,28}. Más allá de eso, uno debe ser consciente de que los fenotipos de ratones genéticamente alterados también pueden estar restringidos a distintos antecedentes genéticos. Metodológicamente, hay dos enfoques primordiales para realizar análisis de presión-volumen en ratones. Cada método tiene sus (des)ventajas y el método de elección a menudo depende de las experiencias del laboratorio y sus investigadores. Aquí nos centramos en el procedimiento de tórax abierto, en el que el catéter se coloca a través de una punción en el ápice. Este enfoque tiene el avance de la colocación del catéter bajo visión que permite un posicionamiento preciso del catéter, un predictor esencial para el registro de datos significativos de la función cardíaca en ratones. Esto es particularmente cierto para el registro de parámetros de volumen en el rango de microlitros. En contraste, un aspecto crítico de este enfoque es la pérdida de presiones intratorácicas fisiológicas, lo que resulta en el colapso de los pulmones y la formación de atelectasia y una mayor pérdida de líquido corporal. Sin embargo, mediante el uso de ventilación positiva con presión espiratoria final (PEEP), aquí describimos una estrategia que ha demostrado contrarrestar el daño pulmonar durante la PVL de tórax abierto en ratones⁶. El segundo enfoque experimental es insertar el catéter a través de la arteria carótida y luego retrógradamente a través de la válvula aórtica. Mediante el uso de esta técnica, las presiones intratorácicas se pueden mantener bastante normales, aunque todavía se necesita ventilación mecánica, lo que debilita esta ventaja. Además, el enfoque de tórax cerrado limita las posibilidades de los investigadores para el posicionamiento preciso del catéter. Además, los catéteres fotovoltaicos utilizados en ratones tienen diámetros que van de 1 a 1,4 franceses (0,33 mm a 0,47 mm), lo que implica una obstrucción significativa del tracto de salida murino cuando se utiliza el enfoque de pecho cerrado, ya que las aortas de ratones adultos suelen tener diámetros entre 0,8 mm y 1,2 mm^29,30. En cuanto al uso de PVL en modelos de insuficiencia cardíaca, el enfoque de tórax abierto es de particular importancia para los modelos de constricción aórtica transversa, donde la constricción se encuentra entre la arteria innominada y la arteria carótida izquierda. Aquí el catéter no se puede colocar a través de la arteria carótida. Por otro lado, el enfoque de tórax cerrado es de interés para los investigadores que investigan modelos murinos de ventrículos dilatados, como después de la inducción del infarto de miocardio, donde la punción del ápice no es factible.

No hay que declarar ningún conflicto de intereses.

Agradecemos a Manuela Ritzal, Hans-Peter Gensheimer, Christin Richter y al equipo de la Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung (IBF) de la Universidad de Heidelberg por la asistencia técnica experta.

Este trabajo fue apoyado por el DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular), el BMBF (Ministerio Alemán de Educación e Investigación), un fondo de innovación del estado federal de Baden-Württemberg y el Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) Project-ID 239283807 - TRR 152, FOR 2289 y el Centro de Investigación Colaborativa (SFB) 1118.