Análisis de metabolómica basada en cromatografía líquida no dirigida de grano de trigo

Se presenta un método para el análisis no focalizado de metabolitos y lípidos de grano de trigo. El protocolo incluye un método de extracción de metabolito de acetonitrilo y una metodología de espectrometría de masas de cromatografía líquida de fase inversa, con adquisición en modos de ionización de electrospray positivo según lo negativo y negativo.

Comprender las interacciones entre los genes, el medio ambiente y la gestión en la práctica agrícola podría permitir una predicción y gestión más precisas del rendimiento y la calidad del producto. Los datos metabolómicos proporcionan una lectura de estas interacciones en un momento dado y son informativos del estado bioquímico de un organismo. Además, los metabolitos individuales o paneles de metabolitos se pueden utilizar como biomarcadores precisos para la predicción y gestión del rendimiento y la calidad. Se prevé que el metaboló vegetal contiene miles de moléculas pequeñas con propiedades fisicoquímicas variadas que proporcionan una oportunidad para una visión bioquímica de los rasgos fisiológicos y el descubrimiento de biomarcadores. Para explotar esto, un objetivo clave para los investigadores metabolómicos es capturar la mayor cantidad posible de diversidad fisicoquímica dentro de un solo análisis. Aquí presentamos un método metabolómico no dirigido basado en cromatografía líquida-espectrometría de masas para el análisis del grano de trigo cultivado en campo. El método utiliza el administrador de disolventes cuaternarios de cromatógrafo líquido para introducir una tercera fase móvil y combina un gradiente de fase invertida tradicional con un gradiente lipid-amenable. La preparación de granos, la extracción de metabolitos, el análisis instrumental y los flujos de trabajo de procesamiento de datos se describen en detalle. Se observó una buena precisión de masa y reproducibilidad de la señal, y el método produjo aproximadamente 500 características biológicamente relevantes por modo de ionización. Además, se determinaron señales significativamente diferentes de metabolitos y lípidos entre variedades de trigo.

Comprender las interacciones entre los genes, el medio ambiente y las prácticas de gestión en la agricultura podría permitir una predicción y gestión más precisas del rendimiento y la calidad de los productos. Los metabolitos vegetales están influenciados por factores como el genoma, el medio ambiente (clima, lluvias, etc.), y en un entorno agrícola, la forma en que se gestionan los cultivos (es decir, la aplicación de fertilizantes, fungicidas, etc.). A diferencia del genoma, el metabolóme está influenciado por todos estos factores y, por lo tanto, los datos metabolómicos proporcionan una huella bioquímica de estas interacciones en un momento determinado. Por lo general, hay uno de los dos objetivos para un estudio basado en metabolómica: en primer lugar, lograr una comprensión más profunda de la bioquímica del organismo y ayudar a explicar el mecanismo de respuesta a la perturbación (estrés abiótico o biótico) en relación con la fisiología; y en segundo lugar, asociar biomarcadores con la perturbación en estudio. En ambos casos, el resultado de tener este conocimiento es una estrategia de gestión más precisa para lograr el objetivo de mejorar el tamaño y la calidad del rendimiento.

Se prevé que el metaboló de la planta contenga miles^{de 1} de moléculas pequeñas con propiedades fisicoquímicas variadas. Actualmente, ninguna plataforma metabolómica (predominantemente espectrometría de masas y espectroscopia de resonancia magnética nuclear) puede capturar todo el metabolóme en un solo análisis. El desarrollo de estas técnicas (preparación de muestras, extracción y análisis de metabolitos), que proporcionan una cobertura lo más grande posible del metaboló metandolo en una sola ejecución analítica, es un objetivo clave para los investigadores metabolómicos. Los análisis metabolómicos no focalizados anteriores del grano de trigo han combinado datos de múltiples separaciones cromatográficas y polaridades de adquisición y/o instrumentación para una mayor cobertura de metabolóme. Sin embargo, esto ha requerido que las muestras se preparen y adquieran por separado para cada modalidad. Por ejemplo, Beleggia et al.² prepararon una muestra derivada para el análisis GC-MS de analitos polares, además del análisis GC-MS de los analitos no polares. ³ utilizaron métodos GC y LC-MS para mejorar la cobertura en sus análisis; sin embargo, este enfoque generalmente requeriría preparaciones de muestras separadas como se describió anteriormente, así como dos plataformas analíticas independientes. Los análisis previos de grano de trigo utilizando GC-MS^2,3,4 y LC-MS^3,5 plataformas han producido 50 a 412 (55 identificados) características para GC-MS, 409 para GC-MS combinado y LC-MS y varios miles para un análisis de lipidómica LC-MS⁵. Mediante la combinación de al menos dos modos en un solo análisis, se puede mantener una cobertura de metabolóme ampliada, aumentando la riqueza de la interpretación biológica y al mismo tiempo ofreciendo ahorros en tiempo y costo.

Para permitir la separación eficiente de una amplia gama de especies de lípidos mediante cromatografía en fase inversa, las metodologías de lipidomics modernas suelen utilizar una alta proporción de isopropanol en el disolvente de elución^6,proporcionando amenabilidad a las clases de lípidos que de otro modo podrían no ser resueltos por la cromatografía. Para una separación eficiente de lípidos, la fase móvil inicial también es mucho mayor en la composición orgánica⁷ que los métodos cromatográficos de fase invertida típicos, que consideran otras clases de moléculas. La alta composición orgánica al comienzo del gradiente hace que estos métodos sean menos adecuados para muchas otras clases de moléculas. Más notablemente, la cromatografía líquida de fase invertida emplea un gradiente de disolvente binario, comenzando con una composición mayormente acuosa y aumentando en contenido orgánico a medida que aumenta la resistencia a la elución de la cromatografía. Con este fin, buscamos combinar los dos enfoques para lograr la separación de las clases de lípidos y no lipídicos de metabolitos en un solo análisis.

Aquí, presentamos un método cromatográfico que utiliza una tercera fase móvil y permite una fase invertida tradicional combinada y un método de cromatografía apropiado para lipidómica utilizando una sola preparación de muestra y una columna analítica. Hemos adoptado muchas de las medidas de control de calidad y pasos de filtrado de datos que se han implementado previamente en estudios metabolómicos predominantemente clínicos. Estos enfoques son útiles para determinar características sólidas con alta reproducibilidad técnica y relevancia biológica y excluyen aquellas que no cumplen estos criterios. Por ejemplo, describimos el análisis de repetición de la muestra de control de calidad agrupada⁸, corrección de QC⁹, filtrado de datos^9,10 e imputación de las características faltantes¹¹.

Este método es adecuado para 30 muestras (aproximadamente 150 semillas por muestra). Aquí se utilizaron tres réplicas biológicas de diez variedades diferentes de trigo cultivado en campo.

1. Preparación de granos

1. Recuperar muestras (granos enteros) de un almacenamiento de -80 oC.
   NOTA: Se recomienda el secado por congelación de las semillas poco después de la cosecha si se recogen muestras de varias estaciones. Esto minimiza cualquier cambio en la concentración de metabolitos que pueda ocurrir después de diferentes períodos de almacenamiento. Para ello, transfiera las semillas a un tubo centrífugo de plástico de 15 ml (aproximadamente 300 semillas llenarán el tubo) y cubra con papel de aluminio. Perforar la lámina dos-tres veces usando un alfiler y congelar los granos enteros durante la noche (aproximadamente 24 h). Las muestras pueden ser devueltas al congelador de -80 oC en esta etapa o se puede llevar a cabo el siguiente paso.
2. Moler las semillas usando una licuadora de laboratorio para dos carreras en modo alto durante 20 s.
   NOTA: La licuadora utilizada para este protocolo requiere un mínimo de aproximadamente 150 semillas para llenar la licuadora a la altura de la hoja y dar una muestra de grano molido relativamente homogéneamente.
3. Retire la licuadora de la base y toque el lado de la licuadora para llevar cualquier grano molido grueso a la superficie de la muestra. El material grueso se puede desechar o almacenar.
4. Transfiera el material finamente molido en polvo de la licuadora a un tubo de microcentrífuga de plástico de 2 ml.
   NOTA: Lave la licuadora con agua desionizada y enjuague con MeOH de grado LC-MS entre muestras. Asegúrese de que la licuadora esté completamente seca antes de pasar a la siguiente muestra.
5. Devuelva las muestras de grano finamente molido al congelador o continúe con el siguiente paso (extracción de metabolitos).

2. Preparación del disolvente de extracción

NOTA: Prepare el disolvente de extracción el mismo día en que realiza las extracciones.

1. Preparar al menos 2 ml de 1 mg/ml de cada estándar. Utilice acetonitrilo (ACN) para preparar 2-aminoanthracene, miconazol y d₆-ácido transcinnamic. Use agua para preparar ¹³C₆-sorbitol.
2. Tome 2 ml de cada estándar de 1 mg/ml y añada a un matraz volumétrico de 100 ml.
3. Llene el matraz volumétrico hasta la línea con acetonitrilo. Asegúrese de que 100 ml de acetonitrilo contenga 20 g/ml de cada una de las normas internas: 2-aminoanthracene, miconazol, ¹³C₆-sorbitol, d₆-ácido transcinnamic.

3. Extracción de metabolitos

1. Pesar 200 mg de grano finamente molido en un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
2. Añadir 500 ml de disolvente de extracción a 200 mg de muestra de grano finamente molido.
3. Mezclar utilizando un homogeneizador para 2 tiradas de 20 s a 6.500 rpm.
4. Centrífuga a 4oC durante 5 min a 16.100 x g.
5. Transfiera el sobrenadante a un tubo de plástico de 2 ml.
6. Repita este procedimiento de los pasos 3.1 a 3.5 dos veces más para dar un volumen de sobrenadante total de aproximadamente 1,5 ml.
7. Vórtice para mezclar el sobrenadante.
8. Transfiera un volumen igual (55 l) de cada extracto a un tubo separado de 2 ml para hacer una muestra de extracto de grano agrupado.
9. Transfiera una alícuota de 50 l del extracto a un vial de vidrio.
   NOTA: Los extractos se pueden congelar (-80 oC) en este punto o continuar con el siguiente paso y seguir el análisis LC-MS.

4. Preparación de soluciones para el análisis LC-MS

ADVERTENCIA: Para el ácido concentrado, agregue siempre ácido al agua/solvente.

1. Prepare 50 ml de solución de material de formatede de amonio de 1 M. Pesar 3.153 g de formate de amonio y transferira a un matraz volumétrico de 50 ml. Llene el matraz volumétrico a la línea con LC-MS grado H₂O.
2. Preparar 1 L de la fase móvil A que consiste en 10 mM de formato de amonio, 0,1% ácido fórmico. Para ello, añada aproximadamente 500 ml de agua de grado LC-MS a un matraz volumétrico de 1 L. Añadir 10 ml de 1 M de material de formatede de amonio y 1 ml de ácido fórmico. Llene el matraz volumétrico a la línea con LC-MS grado H₂O. Transfiera a una botella de 1 L y sonice durante 15 minutos para desgasificación.
3. Preparar 1 L de fase móvil B que consiste en 10 mM de formación de amonio en 79:20:1 acetonitrilo:alcohol isopropílico:agua, 0,1% relación de ácido fórmico. Añadir 200 ml de isopropanol a un matraz volumétrico de 1 L. Añadir 10 ml de 1 M de material de formatede de amonio y 1 ml de ácido fórmico. Llene el matraz volumétrico a la línea con acetonitrilo. Pasar a una botella de 1 L y sonicar durante 15 minutos a desgasificación.
   NOTA: Diluir el formate de amonio de 1 M en el alcohol isopropílico (IPA) antes de añadir el ACN. El formate de amonio es insoluble en CAN.
4. Preparar 1 L de la fase móvil C que consiste en 10 mM de formación de amonio en la proporción de 89:10:1 alcohol isopropílico:acetonitrilo:agua. Para ello, añadir aproximadamente 500 ml de isopropanol, 10 ml de 1 M de material formato de amonio y 100 ml de acetonitrilo a un matraz volumétrico de 1 L. Rellene la línea con isopropanol. Pasar a una botella de 1 L y sonicar durante 15 minutos a desgasificación.
5. Preparación de disolventes de lavado del sistema LC-MS
   1. Sustituya la solución de lavado de cabeza de bomba por una solución fresca. Utilice 50% metanol, 10% alcohol isopropílico u otro según lo recomendado por el fabricante.
   2. Prepare soluciones de lavado de agujas fuertes y débiles para lavar los fluidos de inyección antes y después de la inyección de la muestra. Para el lavado fuerte, agregue volúmenes iguales de ACN e IPA. Para el lavado débil, preparar una solución de 10% ACN (que requiere aproximadamente 500 ml y 1 L de cada uno de los lavados fuertes y débiles respectivamente para este protocolo y el número de muestras) en botellas separadas.
   3. Ajuste los volúmenes de lavado de la aguja a 600 s y 1800 ml para los lavados fuertes y débiles, respectivamente.

5. Preparación de muestras para el análisis LC-MS

1. Según el procedimiento de funcionamiento estándar del fabricante para la preparación de 400 ng/L de enkephalin de leucina, pipeta 7,5 ml de agua en el vial de 12 ml de leucina-enkephalin que contiene 3 mg de leucina-enkephalin. Congele a -80 oC en alícuotas de 50 s.
2. Preparar 100 ml de 5% de ACN que contenga 200 ng/ml de leucina-enkephalin (50 ml de 400 ng/L de enkephalin de leucina). Prepárese el mismo día que el análisis LC-MS.
3. Añadir 950 ml de acetonitrilo al 5% que contenga la leucina-enkephalin estándar de inyección a la alícuota de muestra de 50 l preparada a partir del paso 3.
4. Vórtice para mezclar la muestra preparada.

6. Configuración de LC-MS

NOTA: En la guía del usuario del fabricante se describe una descripción detallada de la configuración del instrumento y del método de adquisición. A continuación se describe una guía general y los detalles específicos de este protocolo. Los siguientes pasos se pueden completar en cualquier momento antes de adquirir los datos.

1. Abra un perfil de hardware LC-MS.
2. Configure el método cromatográfico como se describe en la Tabla 1. Asegúrese de que el sistema LC está equipado con un gestor de disolventes cuaternario para configurar este gradiente.
   NOTA: IPA es un disolvente viscoso. Debe introducirse a un caudal bajo y se debe utilizar un tiempo de equilibrio suficiente antes de aumentar la composición al 98,0%. Estos pasos evitarán que el sistema LC sobresecen y detengan en exceso.
3. Configure los métodos de adquisición del espectrómetro de masas para cada uno de los modos ToF-MS positivos y negativos en el rango m/z 50-1.300.
   NOTA: El instrumento utilizado para el trabajo presentado aquí requiere que los métodos positivos y negativos se calibran y se ejecutan individualmente (es decir, no es posible cambiar la polaridad dentro de un método).
4. Si la columna LC es nueva, acondicione la columna de acuerdo con la recomendación del fabricante.
   NOTA: Los siguientes pasos deben completarse directamente antes de la adquisición de datos.
5. En un perfil de hardware "solo MS", calibrar el espectrómetro de masas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Complete este paso antes de cada modo de adquisición, asegurándose de que el sistema se ha estabilizado en cada modalidad dada antes de la calibración.
6. Purgue y enjuague el sistema de fluidos LC utilizando disolventes de grado LC-MS, incluidos los disolventes de fase móvil y de lavado.
7. Equilibrar el sistema LC utilizando las condiciones de arranque del método LC, asegurándose de que la presión de la columna se haya estabilizado.
8. Inyectar formate de sodio (0,5 mM en 90% IPA) al comienzo de la secuencia de muestra (descrito a continuación) para comprobar la calibración del instrumento.
9. Configure primero la tabla de secuencias de instrumentos para que los espacios en blanco solventes y preparativos (extracción) se analicen primero; seguido de muestras de control de calidad agrupadas (6-10) para el acondicionamiento del sistema; a continuación, la lista de muestras aleatorias con muestras de control de calidad se ejecutan a intervalos regulares (por ejemplo, cada quinta inyección) como réplicas técnicas. Ejecute dos muestras de control de calidad al final de la secuencia.
   NOTA: Es útil incluir la fecha y el orden de inyección/adquisición en el nombre de archivo de ejemplo, así como el ID de muestra. Por ejemplo: YYYY MMDD_Injection number_Variety_Biological replicar. Antes de pulsar Start, asegúrese de que la presión de la columna LC es estable y de que la LC está conectada a la MS.

7. Procesamiento de datos

NOTA: En la Figura 1se presenta un flujo de trabajo general de procesamiento de datos.

1. Compruebe la calidad de los datos (precisión de masa estándar interna (cálculo a continuación) y reproducibilidad de la señal) mientras se ejecuta la secuencia. Para comprobar la reproducibilidad de la señal, la inspección visual de los espectros superpuestos debe ser suficiente.
   NOTA: Error de masa (ppm) á ((masa teórica – masa medida) / masa teórica) x 10⁶
2. Genere una matriz de intensidad máxima alineada que contenga muestras x estándares internos (alineados por el tiempo de retención y los valores m/z).
   1. Abra el software de procesamiento de datos (consulte Tabla de materiales). En Inicio > Abrir, haga clic en Datos. Vaya a la ubicación de archivo adecuada y abra todos los archivos de datos.
   2. En Inicio > Secuencia > Tipode procesamiento , seleccione Cantidad en el menú desplegable.
   3. En Inicio > Método > Quan, haga clic en Componentes de calibración. Rellene cada campo utilizando los detalles proporcionados en la Tabla 2. Haga clic en Aceptar.
   4. En el panel izquierdo de las columnas situadas junto a los archivos de datos, rellene el tipo de muestra haciendo clic con el botón derecho en la celda y seleccionando Desconocido. Rellene el nivel como n/a.
   5. En Inicio > Procesamiento, seleccione Secuencia. Elija una ubicación para guardar la secuencia y, a continuación, haga clic en Procesar.
   6. En Inicio > Resultados, seleccione Quan. En el visor de Quan, seleccione Exportar ejecuciones al analizadorde matriz .
   7. En el visor de resultados del analizador de matrices, haga clic en Exportar a csv. Guarde el archivo como un archivo de hoja de cálculo.
   8. En el software de hoja de cálculo, calcule el promedio, la desviación estándar y la desviación estándar relativa de la intensidad (área pico) de cada estándar interno.
3. Genere una matriz de intensidad máxima alineada que contenga muestras x entidades no segmentadas (alineadas por el tiempo de retención y los valores m/z).
   1. Abra el software de análisis de descubrimiento de moléculas pequeñas (consulte Tabla de materiales)y seleccione Archivo > Nuevo para crear un nuevo experimento. Asigne un nombre al experimento y elija la ubicación para guardar y almacenar archivos de experimento. Haga clic en Siguiente.
   2. Seleccione el tipo de instrumento utilizado (espectrómetro de masas de alta resolución), el formato de datos (perfil) y la polaridad (positiva o negativa). Haga clic en Siguiente. Seleccione todos los aductos disponibles en la biblioteca y edite la biblioteca de aductos según sea necesario. Haga clic en Crear experimento. Se cargará una nueva página donde el resto del procesamiento de datos continuará o se producirá.
   3. Importar archivos de datos. Seleccione el formato de archivo y, a continuación, seleccione Importar. Vaya a la ubicación de datos y seleccione los archivos de datos que desea importar. El progreso se mostrará para cada archivo en el panel izquierdo de la página.
   4. Una vez importados los archivos de datos, seleccione Iniciar procesamiento automático. Elija un método para seleccionar una referencia de alineación. Deje que el software evalúe todas las ejecuciones para su idoneidad, proporcione una lista de muestras adecuadas (es decir, muestras de control de calidad) o elija la referencia más adecuada, es decir, una muestra de control de calidad de secuencia media. Seleccione Sí, alinee automáticamente mis corridas > Siguiente.
   5. Seleccione Siguiente en la página de diseño del experimento (esto se puede configurar más adelante).
   6. Seleccione Realizar selección de picos y, a continuación, Establecer parámetros. En la pestaña Límites de picking máximo, seleccione Intensidad de iones absoluta e introduzca 100. Seleccione Aplicar un ancho de pico mínimo e introduzca 0,01 min. Seleccione Aceptar > Finalizar. Una vez finalizado el procesamiento, seleccione Cerrar.
      NOTA: Los límites de selección de picos se pueden optimizar para otros tipos de archivos de datos según sea necesario.
   7. En la parte inferior derecha de la pantalla, seleccione Sección completada. Revise las corridas alineadas y asegúrese de que cada muestra esté alineada con la referencia. Las puntuaciones de alineación fueron >90% para los datos presentados aquí. Seleccione Sección completada.
   8. En la página siguiente, seleccione entre el diseño del asunto. Asigne un nombre al diseño. Seleccione Agrupar las ejecuciones manualmente y Crear diseño. Agregue la condición, haga clic en la condición 1 y asigne el nombre apropiado al grupo. Haga clic en Sección completada.
      NOTA: Continúe agregando condiciones según corresponda para utilizar estadísticas dentro del software. Puesto que sólo usamos el software para generar una matriz no dirigida, usamos una sola condición etiquetada como 'all'.
   9. En la página siguiente, seleccione Sección completada. No vuelva a realizar el pico de picking.
   10. Revise la desconvolución y, a continuación, haga clic en Sección completada.
   11. Vaya a Archivo > Exportar mediciones compuestas. Anule la selección de las propiedades que no se desees en la salida. Haga clic en Aceptar. Elija una ubicación para guardar el archivo .csv. Haga clic en Guardar > Abrir archivo > Abrir carpeta o Cerrar.
4. Filtre los datos utilizando los espacios en blanco de extracción para eliminar artefactos (software de hoja de cálculo).
   1. Para cada entidad RT x m/z, en una nueva columna, calcule la respuesta media en espacios en blanco de extracción.
   2. Para cada función RT x m/z, calcule la respuesta media en todas las demás muestras (incluidas las muestras de control de calidad).
   3. Calcular la intensidad máxima del % de los espacios en blanco en las muestras (respuesta media en blanco/respuesta media en muestras x 100).
   4. Ordene la columna de contribución porcentual de valores más bajos a más altos.
   5. Elimine las entidades que tengan una contribución de intensidad >5% de los espacios en blanco.
5. Filtre los valores que faltan y corrija las señales de la característica a las señales en las muestras de control de calidad agrupadas.
   1. Abra el software de procesamiento de datos(Tabla de materiales). Haga clic en el botón View MatrixAnalyzer. Haga clic en el botón Abrir archivo de datos.
   2. Vaya a la ubicación del archivo .csv que contiene la intensidad máxima de las entidades RT x m/z para cada muestra (matriz no dirigida). Seleccione Abrir.
   3. En la pestaña Ejemplos de control de calidad, rellene cada parámetro según sea necesario. Para el conjunto de datos que se describe aquí, utilice la categoría DE control de calidad, el control de calidad, omita las categorías, el tipo de imputación, el umbral de cobertura 80, la escala mediante la opción sin escala, desactive la transformación del registro, corrija el uso de la spline de suavizado, el suavizado de 0,25.
   4. En la parte superior derecha del panel de matriz, haga clic en el botón de reproducción Corrección qc.
   5. Después de realizar la corrección en la parte superior derecha del panel de matriz, haga clic en Guardar resultados. Vaya a una ubicación adecuada y guarde el archivo de resultados .csv.
6. Filtre los datos para eliminar las entidades que tienen >20% RSD en muestras de control de calidad.
   1. Organice los datos para que los ejemplos estén en filas y entidades en columnas.
   2. En una nueva columna, calcule la intensidad máxima media de las muestras de control de calidad.
   3. En una nueva columna, calcule la desviación estándar de la intensidad máxima para las muestras de control de calidad.
   4. Calcular la desviación estándar relativa de la intensidad máxima para las muestras de control de calidad: (promedio de desviación estándar DE QC/QC) x 100.
   5. Ordene las entidades de menor a mayor %RSD y elimine las entidades que tienen un RSD QC >20%.
7. Filtre los datos para eliminar entidades con relaciones de control de calidad /RSD_{de muestra}RSD bajas (por ejemplo, <1).
   1. En una nueva columna, calcule la intensidad máxima media de las muestras.
   2. En una nueva columna, calcule la desviación estándar de la intensidad máxima de las muestras.
   3. Calcular la desviación estándar relativa de la intensidad máxima de las muestras: (desviación estándar de muestra/promedio de muestra) x 100.
   4. En una nueva columna, divida las muestras RSD por el RSD de control de calidad.
   5. Ordene los valores_(ratiosde la muestra RSD /RSD_QC) de mayor a menor y elimine las entidades con una relación <1.
8. Imputalos valores que faltan (varios métodos disponibles en línea).
   1. Formatee la hoja de cálculo para que los ejemplos estén en filas y las entidades estén en columnas. La primera columna debe ser el nombre de archivo de ejemplos. Cree una columna adicional junto a los nombres de archivo e introduzca las agrupaciones de ejemplo. En este caso, las muestras se agruparon por variedad.
   2. Guarde la hoja de cálculo como un archivo .csv.
   3. Vaya a la página principal de la canalización analítica basada en web para metabolómicas de alto rendimiento (consulte Tabla de materiales)y haga clic en Haga clic aquí para iniciar.
   4. Haga clic en Análisis estadístico. En Cargar los datos, seleccione Tipo de datos: tabla de intensidad máxima, Formato: muestras en filas (sin emparejar) y, a continuación, elija Archivo.
   5. Vaya al archivo .csv, seleccione Abrir y, a continuación, seleccione Enviar.
   6. En la página siguiente, seleccione Estimación de valor faltante. Desmarque el paso 1 (esto se realizó en AnalyzerPro XD). En el paso 2, elija un método para estimar los valores que faltan.
      NOTA: Para los datos presentados aquí - se ha seleccionado 'estimar los valores que faltan' con 'KNN'.
   7. En esta etapa, la matriz de datos se puede descargar (seleccione Descargar desde el panel izquierdo de la página web) o proceder a realizar más análisis estadísticos.

El metabollomo de la planta está influenciado por una combinación de su genoma y medio ambiente, y además en un entorno agrícola, el régimen de gestión de cultivos. Demostramos que las diferencias genéticas entre las variedades de trigo pueden observarse a nivel de metabolito, aquí, con más de 500 compuestos medidos que muestran concentraciones significativamente diferentes entre variedades en el grano solamente. Se observaron una buena precisión de masa (error<10 ppm) y reproducibilidad de la señal (<20% RSD) de las normas internas(Figura 2) para los modos de ionización tanto negativo como positivo (Tabla 3). La preparación de muestras descrita y el análisis basado en espectrometría de masas de líquidos produjo >900 características desenrevadas en modo de ionización negativa y >1300 características desenrevadas en modo de ionización positiva. Se incluyeron espacios en blanco preparativos(Figura 3)para determinar si los métodos de preparación y análisis de la muestra introdujeron características de artefactos y, por lo tanto, todas las influencias no biológicas eliminadas de la matriz de datos. Se encontró que 421 señales en el modo negativo y 835 señales en el modo positivo tenían intensidades de señal iguales o superiores al 5% de la intensidad media de la señal en muestras de granos. Estas características se eliminaron y después de otros pasos de filtrado de datos (paso 7 y figura 1),el modo negativo devolvió 483 características y el modo positivo devolvió 523 características, formando la instantánea metabólica. El método tuvo éxito en la detección de características, que tenían intensidades significativamente diferentes entre las variedades de trigo(Figura 4) con >500 características significativas en ambos modos de ionización. En el modo de ionización negativa, la mayoría de las características significativas estaban en el gradiente de fase invertido y en el modo de ionización positiva, la mayoría de las características significativas estaban en el gradiente de lípidos(Figura 4).

Figura 1: El flujo de trabajo utilizado en este análisis para la comprobación, el procesamiento y el filtrado de datos. El paso 1 se lleva a cabo utilizando el software de adquisición/visualización de datos en el instrumento para que se puedan llevar a cabo evaluaciones "sobre la marcha". Esto incluye el cálculo del error de masa (ppm) de los estándares internos y la superposición de picos estándar internos para la evaluación visual de la reproducibilidad de los datos. Los pasos 2-7 describen el procedimiento de procesamiento de datos descrito en el protocolo, paso 7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cromatografías iónicadas extraídas. Cromatogramas iónicos extraídos de ¹³C₆-sorbitol (azul oscuro), leucina-enkephalin (rosa), d₆-ácido trans-cinnamico (naranja), 2-aminoanthracene (verde) y miconazol (azul claro) estándares internos en los modos de ionización de electrospray positivo (arriba) y negativo (abajo) (ESI). Se muestran los tiempos de retención estándar internos y las intensidades. ESI + y ESI - Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Superposición total de cromatograma iónico (TIC) de espacios en blanco preparativos que muestran las adquisiciones de modo negativo (rosa) y modo positivo (azul). Se muestra un estándar interno, el miconazol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Superposición total de cromatograma iónico (TIC), que muestra las adquisiciones de modo negativo (rosa) y modo positivo (azul) y el número de características significativamente diferentes entre la variedad de trigo a través del gradiente cromatográfico. En el modo negativo, el mayor número de características significativas se encontró cuando la composición de fase B móvil era alta. En el modo positivo, el mayor número de características significativas se encontró cuando la composición de fase C móvil era alta. Se muestra un estándar interno, el miconazol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Programa cronometrado cromatografía líquida de composiciones de fase móvil.

Tabla 2: Parámetros de detección de picos para estándares internos en modos de adquisición positivos (y negativos).

Tabla 3: Muestra(n.o30) precisión interna de la masa estándar (ppm) y reproducibilidad de la señal antes y después de la corrección de qc expresada como desviación estándar relativa (%).

Aquí, presentamos un método metabolómico no dirigido basado en LC-MS para el análisis del grano de trigo. El método combina cuatro modos de adquisición (fase invertida y fase invertida lipida-amenable con ionización positiva y negativa) en dos modos mediante la introducción de una tercera fase móvil en el gradiente de fase invertido. El enfoque combinado produjo aproximadamente 500 características biológicamente relevantes por polaridad iónca, con aproximadamente la mitad de ellas significativamente diferentes en intensidad entre variedades de trigo. Los cambios significativos en la concentración de metabolitos en el grano de diferentes variedades de trigo indican una bioquímica alterada, que puede estar relacionada con la resistencia a las enfermedades, la tolerancia al estrés y otros rasgos fenotípicos que son importantes para la calidad y el rendimiento del grano. Por ejemplo, se han utilizado enfoques metabolómicos para describir nuevos mecanismos de defensa¹² y proponer el papel de los metabolitos en la tolerancia a la sequía¹³. Las aplicaciones futuras de este protocolo pueden vincular aún más los perfiles bioquímicos de variedades particulares con rasgos genéticos que son deseables para ciertos entornos y prácticas de gestión. A su vez, esto permitiría la producción de una calidad y un rendimiento óptimos del grano para los genotipos seleccionados.

La inclusión de estándares internos es fundamental para este protocolo para permitir al usuario determinar los cambios en la señal, los cambios de tiempo de retención y como indicadores de precisión de masa. Los cambios en la señal pueden indicar, por ejemplo, extracción sub óptima, inyección (incluidos bloqueos del sistema fluido) o rendimiento del detector. Los cambios de tiempo de retención pueden indicar un rendimiento deficiente de la bomba, un equilibrio de gradiente de fase móvil inapropiado o que la fase estacionaria de la columna LC se ha deteriorado. Una precisión de masa deficiente puede ser indicativa de una calibración a la deriva y que el sistema requiere una recalibración. En todos los casos anteriores, el sistema debe detenerse y realizar se realizan el mantenimiento/sustitución adecuados de las piezas. Incluimos cuatro estándares en la solución de extracción utilizada para preparar el grano y un estándar en la muestra final añadida antes de la inyección. Se tuvo cuidado de asegurar que las normas fueran susceptibles a cada modo de ionización y cubrieran una serie de tiempos de retención; sin embargo, reconocemos que esta gama de estándares podría mejorarse con la inclusión de un estándar de lípidos etiquetado. Se ha demostrado que el grano de trigo contiene cientos de triacilglycerols (TAGs)⁵, cualquiera de los cuales sería una adición adecuada a este protocolo. La inclusión de espacios en blanco preparativos y muestras de control de calidad agrupadas⁸ también son pasos críticos en este protocolo. Miles de características iónias se detectan en métodos de espectrometría de masas no dirigidos y es importante excluir aquellos que están presentes sólo en muestras en blanco y también aquellos que no se detectan reproduciblemente (es decir, un alto %RSD) a lo largo del análisis.

Aunque el método actual ahorra tiempo y recursos considerables, si no se dispone de un gestor de disolventes cuaternario, se pueden utilizar métodos estándar de fase invertida y lípidos para lograr los mismos resultados. El volumen de extracción utilizado en este protocolo sería suficiente para el análisis de modos de adquisición adicionales. Este protocolo describe una extracción de acetonitrilo. Si bien tiene éxito, un disolvente de extracción alternativo, o combinación de disolventes, proporcionará una cobertura de metabolito diferente, que a su vez puede ofrecer más características y / o dar mejor (o menor) eficiencia de extracción de algunos compuestos. No hemos intentado establecer la identidad del metabolito de las mediciones estadísticamente significativas resueltas en este protocolo; sin embargo, las bases de datos espectrales de masa para metabolitos vegetales y lípidos están disponibles y^{desarrollando5,14,15}. Para identificar los metabolitos, los espectros de masa en tándem (MS/MS) tendrían que ser recogidos además de los datos completos de escaneo. Estos se pueden recoger durante la ejecución inicial utilizando muestras agrupadas y un método MS/MS apropiado o en extracto reservado (almacenado a -80 oC) una vez que se hayan determinado los metabolitos de interés. Observamos grandes cambios de pliegue de compuestos entre variedades por lo que recomendamos hacer ambos y en segundo caso, utilizando una variedad conocida por contener una alta concentración del compuesto de interés para obtener el espectro MS/MS de la más alta calidad.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores desean reconocer el programa de Becas de Agricultura y Alimentos del Primer Ministro de Australia Occidental (Departamento de Empleo, Turismo, Ciencia e Innovación, Gobierno de Australia Occidental) y el Profesor Simon Cook (Centro de Agricultura Digital, Universidad de Curtin y Universidad de Murdoch). Los ensayos de campo y la recolección de muestras de granos fueron apoyados por el gobierno del programa de Regalías para Regiones de Australia Occidental. Reconocemos a Grantley Stainer y Robert French por sus contribuciones a los ensayos de campo. Bioplatforms Australia, financiada por NCRIS, es reconocida por la financiación de equipos.