تحليل الموجات الاختزالية السائلة غير المستهدفة - قياس الطيف الشامل - Metabolomics من حبوب القمح

يتم تقديم طريقة للتحليل غير المستهدف لاستقلاب حبوب القمح والدهون. ويتضمن البروتوكول طريقة استخراج المستقلب الأسيتونتريل وعكس مرحلة منهجية قياس الطيف اللوني الشامل السائل، مع اكتساب في أوضاع التأيّن الكهربائي الإيجابية والسلبية.

ويمكن أن يتيح فهم التفاعلات بين الجينات والبيئة والإدارة في الممارسة الزراعية التنبؤ والإدارة الأكثر دقة لغلة المنتجات وجودتها. توفر بيانات Metabolomics قراءة لهذه التفاعلات في لحظة معينة من الزمن وغنية بالمعلومات عن حالة الكائن الحي الكيميائية الحيوية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الأيض الفردية أو لوحات من الأيض كعلامات حيوية دقيقة للتنبؤ والجودة والإدارة. ومن المتوقع أن يحتوي الميتابولوم النباتي على آلاف الجزيئات الصغيرة ذات الخصائص الفيزيائية الكيميائية المتنوعة التي توفر فرصة للحصول على نظرة حيوية كيميائية في الصفات الفسيولوجية واكتشاف العلامات الحيوية. لاستغلال هذا ، والهدف الرئيسي للباحثين metabolomics هو التقاط أكبر قدر ممكن من التنوع الفيزيائي الكيميائي في تحليل واحد. هنا نقدم طريقة قياس الطيف اللوني السائل القائم على الكتلة غير المستهدفة لتحليل حبوب القمح المزروعة في الحقل. تستخدم الطريقة مدير المذيبات الرباعية اللوني السائل لإدخال مرحلة متنقلة ثالثة وتجمع بين تدرج المرحلة المعكوسة التقليدية مع تدرج الدهون القابلة للاستبدال. يتم وصف إعداد الحبوب واستخراج المستقلب والتحليل الآلي وسير عمل معالجة البيانات بالتفصيل. ولوحظت دقة جيدة للكتلة وقابلية استنساخ الإشارة، وأسفرت الطريقة عن حوالي 500 من السمات ذات الصلة بيولوجياً لكل وضع تأيّن. علاوة على ذلك ، تم تحديد المستقلب وإشارات ميزة الدهون المختلفة بشكل كبير بين أصناف القمح.

ويمكن أن يتيح فهم التفاعلات بين الجينات والبيئة والممارسات الإدارية في الزراعة التنبؤ والإدارة الأكثر دقة لغلة المنتجات وجودتها. تتأثر الأيض النباتية بعوامل مثل الجينوم والبيئة (المناخ وهطول الأمطار وما إلى ذلك) ، وفي البيئة الزراعية ، تتم إدارة المحاصيل (أي استخدام الأسمدة ومبيدات الفطريات وما إلى ذلك). على عكس الجينوم ، يتأثر metabolome بكل هذه العوامل ، وبالتالي توفر بيانات metabolomics بصمة كيميائية حيوية لهذه التفاعلات في وقت معين. عادة ما يكون هناك واحد من هدفين لدراسة تستند إلى metabolomics: أولاً ، لتحقيق فهم أعمق للكيمياء الحيوية للكائن الحي والمساعدة في شرح آلية الاستجابة للاضطراب (الإجهاد اللاأحيائي أو الحيوي) فيما يتعلق بعلم وظائف الأعضاء ؛ أولاً ، تحقيق فهم أعمق للكيمياء الحيوية للكائن الحي والمساعدة في شرح آلية الاستجابة للاضطراب (الإجهاد اللاأحيائي أو الحيوي) فيما يتعلق بعلم وظائف الأعضاء . وثانيا، لربط المؤشرات الحيوية مع الاضطرابات قيد الدراسة. وفي كلتا الحالتين، فإن نتيجة الحصول على هذه المعرفة هي استراتيجية إدارية أكثر دقة لتحقيق هدف تحسين حجم الغلة ونوعيتها.

ومن المتوقع أن يحتوي الميتابولوم النباتي على الآلاف¹ من الجزيئات الصغيرة ذات الخصائص الفيزيائية الكيميائية المتنوعة. حاليا، لا يمكن لمنصات metabolomics (قياس الطيف الكتلي في الغالب والطيف المغناطيسي النووي) التقاط metabolome بأكمله في تحليل واحد. تطوير مثل هذه التقنيات (إعداد العينة، استخراج المستقلب والتحليل)، والتي توفر تغطية كبيرة من metabolome ممكن في غضون تشغيل تحليلي واحد، هو هدف رئيسي للباحثين metabolomics. وقد جمعت التحليلات السابقة غير المستهدفة لحبوب القمح بين البيانات المستمدة من عمليات فصل لوني متعددة وأقطاب اكتساب و/أو أجهزة لزيادة تغطية الميتابولم. غير أن ذلك تطلب إعداد عينات واقتنائها بشكل منفصل لكل طريقة. فعلى سبيل المثال، أعد كل من Beleggia et al.² عينة مشتقة لتحليل التحليل GC-MS للتحليلات القطبية بالإضافة إلى تحليل GC-MS للتحليلات غير القطبية. واستخدم "داس" وآخرون^أساليب "GC- وLC-MS" لتحسين التغطية في تحليلاتهم؛ غير أن هذا النهج سيتطلب عموما ً إعداد عينات منفصلة على النحو المبين أعلاه فضلاً عن منصتين تحليليتين مستقلتين. التحليلات السابقة لحبوب القمح باستخدام GC-MS^22،3،,4 و LC-MS^3،,5^منصات قد أسفرت عن 50 إلى 412 (55 محددة) ميزات لGC-MS، 409 لGC-MS مجتمعة وLC-MS وعدة آلاف لتحليل الدهون LC-MS⁵. من خلال الجمع بين ما لا يقل عن وضعين في تحليل واحد ، يمكن الحفاظ على تغطية metabolome الموسعة ، مما يزيد من ثراء التفسير البيولوجي مع توفير في الوقت والتكلفة على حد سواء.

للسماح بالانفصال الفعال لمجموعة واسعة من أنواع الدهون عن طريق اللوني عكس المرحلة، والمنهجيات الحديثة الدهون تستخدم عادة نسبة عالية من الإيزوبروبانول في المذيبات elution^6،وتوفير وسائل الراحة لفئات الدهون التي قد تكون خلاف ذلك دون حل من قبل الكروماتوغرافيا. لفصل الدهون كفاءة، مرحلة متنقلة بدءا هو أيضا أعلى بكثير في التكوين العضوي⁷ من الأساليب الكروماتوغرافية المرحلة النموذجية عكس، والتي تنظر في فئات أخرى من الجزيئات. التركيب العضوي العالي في بداية التدرج يجعل هذه الأساليب أقل ملاءمة للعديد من الفئات الأخرى من الجزيئات. وعلى الأخص، يستخدم اللون اللوني السائل للمرحلة المعكوسة تدرجًا ثنائيًا مذيبًا ، بدءًا من تكوين مائي في الغالب وزيادة في المحتوى العضوي مع زيادة قوة اللونية. ولتحقيق هذه الغاية، سعينا إلى الجمع بين النهجين لتحقيق الفصل بين كل من الفئات الدهنية وغير الدهنية من الأيض ضمن تحليل واحد.

هنا، نقدم طريقة كروماتوغرافية تستخدم مرحلة متنقلة ثالثة وتمكن من مرحلة تقليدية معكوسة مشتركة وطريقة كروماتوغرافية مناسبة للدهون باستخدام إعداد عينة واحدة وعمود تحليلي واحد. لقد اعتمدنا العديد من تدابير مراقبة الجودة وخطوات تصفية البيانات التي تم تنفيذها سابقًا في دراسات metabolomics السريرية في الغالب. وهذه النُهج مفيدة في تحديد السمات القوية ذات الاستنساخ التقني العالي والأهمية البيولوجية وتستبعد تلك التي لا تستوفي هذه المعايير. على سبيل المثال، نحن نصف تكرار تحليل عينة مراقبة الجودة المجمعة^8،QC التصحيح^9،تصفية البيانات^9،,10 ونسب الميزات المفقودة^11.

هذه الطريقة مناسبة ل30 عينة (حوالي 150 بذور لكل عينة). واستخدمت هنا ثلاثة نسخ بيولوجية من عشرة أصناف مختلفة من القمح المزروع ة في الحقول.

1. إعداد الحبوب

1. استرداد العينات (الحبوب الكاملة) من تخزين -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: يوصى بتجفيف البذور بعد وقت قصير من الحصاد إذا تم جمع عينات من مواسم متعددة. وهذا يقلل من أي تغييرات في تركيز المستقلب التي قد تحدث بعد فترات متفاوتة من التخزين. للقيام بذلك، نقل البذور إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي البلاستيكية (ما يقرب من 300 بذور سوف تملأ الأنبوب) وتغطية مع رقائق الألومنيوم. ثقب احباط مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام دبوس وتجميد الجافة الحبوب الكاملة بين عشية وضحاها (حوالي 24 ساعة). يمكن إرجاع العينات إما إلى الفريزر -80 درجة مئوية في هذه المرحلة أو يمكن تنفيذ الخطوة التالية.
2. طحن البذور باستخدام خلاط المختبر لمدة شوطين على الوضع العالي لمدة 20 s.
   ملاحظة: يتطلب الخلاط المستخدم لهذا البروتوكول ما لا يقل عن 150 بذورًا تقريبًا لملء الخلاط إلى ارتفاع الشفرة وإعطاء عينة حبوب أرضية متجانسة نسبيًا.
3. قم بإزالة الخلاط من القاعدة واضغط على جانب الخلاط لجلب أي حبة أرضية خشنة إلى سطح العينة. يمكن التخلص من المواد الخشنة أو تخزينها.
4. نقل مسحوق مثل المواد الأرضية ناعما من الخلاط إلى 2 مل البلاستيك أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
   ملاحظة: اغسل الخلاط بالماء الديوي وشطف هب مع LC-MS الصف MeOH بين العينات. تأكد من أن الخلاط جاف تمامًا قبل الانتقال إلى العينة التالية.
5. إعادة عينات الحبوب المطحونة ناعما إلى الثلاجة أو المضي قدما إلى الخطوة التالية (استخراج المستقلب).

2. إعداد المذيبات استخراج

ملاحظة: إعداد المذيبات استخراج في نفس اليوم الذي يؤدي الاستخراج.

1. إعداد ما لا يقل عن 2 مل من 1 ملغ / مل من كل معيار. استخدام الأسيتونتريل (ACN) لإعداد 2-aminoanthracene, miconazole وd 6-transcinnamic حمض.₆ استخدام المياه لإعداد ¹³C 6-السوربيتول.₆
2. تأخذ 2 مل من كل معيار 1 ملغ / مل وإضافة إلى قارورة حجمية 100 مل.
3. ملء قارورة الحجمي إلى خط مع أسيتونتريل. تأكد من أن 100 مل من الأسيتونتريل يحتوي على 20 ميكروغرام /مل من كل من المعايير الداخلية: 2-aminoanthracene, miconazole, ¹³C 6-السوربيتول, د_6-حمضترانسالقرفيك.₆

3. استخراج المستقلب

1. تزن 200 ملغ من الحبوب المطحونة ناعما في أنبوب 2 مل الطرد المركزي.
2. إضافة 500 ميكرولتر من المذيبات استخراج إلى 200 ملغ من عينة الحبوب المطحونة ناعما.
3. مزيج باستخدام المتجانس لمدة 2 أشواط من 20 s في 6500 دورة في الدقيقة.
4. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقيقة عند 16100 × ز.
5. نقل supernatant إلى أنبوب بلاستيكي 2 مل.
6. كرر هذا الإجراء من الخطوات 3.1 إلى 3.5 مرتين أكثر لإعطاء حجم إجمالي فائق الحجم حوالي 1.5 مل.
7. دوامة لخلط supernatant.
8. نقل حجم متساو (55 ميكرولتر) من كل استخراج إلى أنبوب منفصل 2 مل لجعل عينة استخراج الحبوب المجمعة.
9. نقل 50 ميكرولتر aliquot من استخراج إلى قارورة زجاجية.
   ملاحظة: يمكن تجميد المستخلصات (-80 درجة مئوية) عند هذه النقطة أو الانتقال إلى الخطوة التالية ومتابعة تحليل LC-MS.

4- إعداد حلول لتحليل LC-MS

تنبيه: بالنسبة للحمض المركز، أضف دائمًا حمضًا إلى الماء/المذيبات.

1. إعداد 50 مل من 1 M حل الأسهم الأمونيوم. تزن 3.153 غرام من formate الأمونيوم ونقلها إلى قارورة حجمية 50 مل. ملء قارورة الحجمي إلى خط مع LC-MS الصف H₂O.
2. إعداد 1 لتر من المرحلة المتنقلة A تتكون من 10 mM الفورميت الأمونيوم، 0.1٪ حمض الفورميك. للقيام بذلك، إضافة ما يقرب من 500 مل من المياه الصف LC-MS إلى قارورة حجمية 1 لتر. أضف 10 مل من 1 م مخزون الفورميت الأمونيوم و 1 مل من حمض الفورميك. ملء قارورة الحجمي إلى خط مع LC-MS الصف H₂O. نقل إلى زجاجة 1 L وسونيكات لمدة 15 دقيقة لdegas.
3. إعداد 1 لتر من المرحلة المتنقلة B تتكون من 10 m m amformate في 79:20:1 acetonitrile: isopropyl الكحول: الماء، 0.1٪ نسبة حمض الفورميك. أضف 200 مل من الايزوبروبانول إلى قارورة حجمية 1 لتر. أضف 10 مل من 1 م مخزون الفورميت الأمونيوم و 1 مل من حمض الفورميك. ملء قارورة الحجمي إلى الخط مع الأسيتونتريل. نقل إلى زجاجة 1 لتر وسونيكات لمدة 15 دقيقة لdegas.
   ملاحظة: تمييع 1 M formate الأمونيوم في الكحول الأيزوبروبيل (IPA) قبل إضافة ACN. اللّومينة غير قابلة للذوبان في CAN.
4. إعداد 1 لتر من المرحلة المتنقلة C تتكون من 10 m m الأمونيوم formate في نسبة 89:10:1 isopropyl الكحول: الأسيتونتريل: الماء. للقيام بذلك، إضافة ما يقرب من 500 مل من ايزوبروبانول، 10 مل من 1 M مخزون formate الأمونيوم و 100 مل من الأسيتونتريل إلى قارورة حجمية 1 لتر. ملء إلى خط مع ايزوبروبانول. نقل إلى زجاجة 1 لتر وسونيكات لمدة 15 دقيقة لdegas.
5. إعداد المذيبات غسل نظام LC-MS
   1. استبدل محلول غسل رأس المضخة بمحلول جديد. استخدام 50٪ الميثانول، 10٪ الكحول ايزوبروبيل أو غيرها على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
   2. إعداد حلول غسل إبرة قوية وضعيفة لغسل سوائل الحقن قبل وبعد حقن العينة. للغسل القوي، أضف كميات متساوية من ACN و IPA. للغسل ضعيفة، وإعداد حل من 10٪ ACN (تتطلب ما يقرب من 500 مل و 1 لتر من كل من يغسل قوية وضعيفة على التوالي لهذا البروتوكول وعدد من العينات) في زجاجات منفصلة.
   3. ضبط أحجام غسل الإبرة إلى 600 ميكرولتر و 1800 ميكرولتر للغسل القوي والضعيف، على التوالي.

5- إعداد عينات لتحليل LC-MS

1. وفقا للمصنعين إجراء التشغيل القياسي لإعداد 400 نانوغرام / μL leucine enkephalin، ماصة 7.5 مل من الماء في قارورة 12 مل leucine-enkephalin التي تحتوي على 3 ملغ من الليسين-enkephalin. تجميد في -80 درجة مئوية في 50 ميكرولتر aliquots.
2. إعداد 100 مل من 5٪ ACN تحتوي على 200 نانوغرام/مل ليسين-إنكيبالين (50 ميكرولتر من 400 نانوغرام/ميكرولتر ليسين إنكيبالين). إعداد في نفس اليوم الذي تحليل LC-MS.
3. أضف 950 ميكرولتر من 5% أسيتونتريل يحتوي على معيار الحقن leucine-enkephalin إلى عينة 50 ميكرولتر aliquot أعدت من الخطوة 3.
4. دوامة لخلط العينة المعدة.

6. LC-MS الإعداد

ملاحظة: يتم وصف تفصيلي لإعداد الأداة وطريقة الامتلاك في دليل المستخدم الخاصة بالشركة المصنعة. وفيما يلي دليل عام وتفاصيل محددة لهذا البروتوكول. يمكن إكمال الخطوات التالية في أي وقت قبل الحصول على البيانات.

1. افتح ملف تعريف أجهزة LC-MS.
2. إعداد الأسلوب اللوني كما هو موضح في الجدول 1. تأكد من أن نظام LC مجهز بمدير مذيبات رباعية لإعداد هذا التدرج.
   ملاحظة: IPA هو مذيب لزج. وينبغي إدخاله بمعدل تدفق منخفض وينبغي استخدام وقت كاف للتوازن قبل زيادة التكوين إلى 98.0 في المائة. هذه الخطوات سوف تمنع نظام LC من الضغط المفرط والتوقف.
3. قم بإعداد أساليب اكتساب مطياف الكتلة لكل من أوضاع ToF-MS الإيجابية والسلبية على نطاق m/z 50-1300.
   ملاحظة: تتطلب الأداة المستخدمة للعمل المعروض هنا طرقًا إيجابية وسلبية لمعايرتها وتشغيلها بشكل فردي (أي أن تبديل القطبية داخل طريقة غير ممكن).
4. إذا كان عمود LC جديدًا، فاشترط العمود وفقًا لتوصية الشركة المصنعة.
   ملاحظة: يجب إكمال الخطوات التالية مباشرة قبل الحصول على البيانات.
5. في ملف تعريف الأجهزة "MS فقط"، قم بمعايرة مطياف الكتلة وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة. أكمل هذه الخطوة قبل كل طريقة من طرق الاقتناء، مع ضمان استقرار النظام في كل طريقة معينة قبل المعايرة.
6. تطهير وتدفق نظام سوائل LC باستخدام المذيبات الصف LC-MS، بما في ذلك المرحلة المتنقلة وغسل المذيبات.
7. اتوازن نظام LC باستخدام شروط بدء طريقة LC ، مما يضمن استقرار ضغط العمود.
8. حقن لومات الصوديوم (0.5 مم في 90% IPA) في بداية تسلسل العينة (الموضح أدناه) للتحقق من معايرة الأداة.
9. إعداد جدول تسلسل الصك بحيث يتم تحليل الفراغات المذيبة والتجهيزية (الاستخراج) أولاً؛ تليها عينات مراقبة الجودة المجمعة (6-10) لتكييف النظام؛ ثم قائمة العينة العشوائية مع عينات مراقبة الجودة تعمل على فترات منتظمة (على سبيل المثال، كل حقنة خامسة) كما يكرر التقنية. تشغيل عينتين مراقبة الجودة في نهاية التسلسل.
   ملاحظة: من المفيد تضمين ترتيب التاريخ والحقن/الاقتناء في اسم الملف النموذجي بالإضافة إلى معرف العينة. على سبيل المثال: yYYy MMDD_Injection number_Variety_Biological النسخ المتماثل. قبل الضغط على البدء، تأكد من أن ضغط عمود LC مستقر وأن LC متصل بالتصلب المتعدد.

7- معالجة البيانات

ملاحظة: يتم تقديم سير عمل معالجة البيانات العامة في الشكل 1.

1. تحقق من جودة البيانات (دقة الكتلة القياسية الداخلية (الحساب أدناه) وقابلية تكرار الإشارة) أثناء تشغيل التسلسل. للتحقق من قابلية استنساخ الإشارة ، يجب أن يكفي الفحص البصري للأطياف المتراكبة.
   ملاحظة: خطأ كتلة (جزء في المليون) = ((كتلة نظرية – كتلة مقاسة) / كتلة نظرية) × 10⁶
2. إنشاء مصفوفة كثافة الذروة المحاذاة التي تحتوي على عينات × المعايير الداخلية (محاذاة حسب وقت الاحتفاظ وقيم m/z).
   1. افتح برنامج معالجة البيانات (انظر جدول المواد). تحت الصفحة الرئيسية > فتح،انقر فوق البيانات. انتقل إلى موقع الملف المناسب وافتح كافة ملفات البيانات.
   2. ضمن الصفحة الرئيسية > تسلسل > نوع المعالجة، حدد الكمية من القائمة المنسدلة.
   3. تحت الصفحة الرئيسية > طريقة > كوان،انقر فوق مكونات المعايرة. ملء كل حقل باستخدام التفاصيل الواردة في الجدول 2. انقر فوق موافق.
   4. على اللوحة اليسرى في الأعمدة بجوار ملفات البيانات، قم بتعبئة نوع العينة بالنقر الأيمن على الخلية وتحديد غير معروف. ملء المستوى كـ n/a.
   5. تحت الصفحة الرئيسية > تجهيز، حدد تسلسل. اختر موقعًا لحفظ التسلسل ثم انقر فوق Process.
   6. تحت الصفحة الرئيسية > النتائج، حدد كوان. من عارض Quan، حدد تصدير يعمل إلى محلل مصفوفة.
   7. من عارض نتائج محلل المصفوفة، انقر فوق تصدير إلى CSV. حفظ الملف كملف جدول بيانات.
   8. في برنامج جدول البيانات، احسب المتوسط والانحراف المعياري والانحراف المعياري النسبي لشدة (منطقة الذروة) لكل معيار داخلي.
3. إنشاء مصفوفة كثافة الذروة المحاذاة التي تحتوي على عينات × الميزات غير المستهدفة (محاذية بوقت الاحتفاظ وقيم m/z).
   1. افتح برنامج تحليل اكتشاف الجزيء الصغير (انظر جدول المواد)وحدد File > جديد لإنشاء تجربة جديدة. قم بتسمية التجربة واختر الموقع لحفظ ملفات التجربة وتخزينها. انقر فوق التالي.
   2. حدد نوع الأداة المستخدمة (مطياف الكتلة عالية الدقة)، وتنسيق البيانات (الملف الشخصي)، والقطبية (إيجابية أو سلبية). انقر فوق التالي. حدد جميع القنوات المتوفرة في المكتبة وقمت بتحرير مكتبة القناة كما هو مطلوب. انقر فوق إنشاء تجربة. سيتم تحميل صفحة جديدة حيث سيتم متابعة/حدوث بقية معالجة البيانات.
   3. استيراد ملفات البيانات. حدد تنسيق الملف ثم حدد الاستيراد. استعرض إلى موقع البيانات وحدد ملفات البيانات التي سيتم استيرادها. سيتم عرض التقدم لكل ملف على اللوحة اليسرى من الصفحة.
   4. بمجرد استيراد ملفات البيانات، حدد بدء المعالجة التلقائية. اختر طريقة لتحديد مرجع محاذاة. إما السماح للبرنامج تقييم جميع أشواط لملاءمة، وإعطاء قائمة من عينات مناسبة (أي عينات مراقبة الجودة) أو اختيار المرجع الأنسب أي عينة مراقبة الجودة منتصف تسلسل. حدد نعم، قم تلقائيًا بمحاذاة أشواطي > التالي.
   5. حدد التالي في صفحة تصميم التجربة (يمكن إعداد هذا لاحقاً).
   6. حدد تنفيذ انتقاء الذروة ثم تعيين المعلمات. ضمن علامة التبويب "حدود الانتقاء الذروة"، حدد كثافة الأيون المطلقة وأدخل 100. حدد تطبيق الحد الأدنى لعرض الذروة وأدخل 0.01 دقيقة. حدد موافق > إنهاء. عند اكتمال المعالجة، حدد إغلاق.
      ملاحظة: يمكن تحسين حدود انتقاء الذروة لأنواع ملفات البيانات الأخرى حسب الضرورة.
   7. في أسفل يمين الشاشة، حدد اكتمال القسم. مراجعة عمليات التشغيل المحاذاة وتأكد من محاذاة كل عينة إلى المرجع. وكانت درجات المحاذاة > 90٪ للبيانات المعروضة هنا. حدد اكتمال القسم.
   8. في الصفحة التالية، حدد بين تصميم الموضوع. اسم التصميم. حدد تجميع عمليات التشغيل يدويًا وإنشاء التصميم. إضافة شرط، انقر على الشرط 1 واسم المجموعة بشكل مناسب. انقر فوق اكتمال المقطع.
      ملاحظة: الاستمرار في إضافة الشروط المناسبة لاستخدام الإحصائيات داخل البرنامج. نظرًا لأننا استخدمنا البرنامج فقط لإنشاء مصفوفة غير مستهدفة ، استخدمنا حالة واحدة تحمل اسم "الكل".
   9. في الصفحة التالية، حدد اكتمال القسم. لا تقم بإعادة اختيار الذروة.
   10. راجع deconvolution ومن ثم انقر فوق اكتمال القسم.
   11. انتقل إلى ملف > قياسات مجمع التصدير. إلغاء تحديد أي خصائص غير مطلوبة في الإخراج. انقر فوق موافق. اختر موقعًا لحفظ ملف .csv. انقر فوق حفظ > فتح ملف > فتح مجلد أو إغلاق.
4. تصفية البيانات باستخدام الفراغات استخراج لإزالة القطع الأثرية (برنامج جدول البيانات).
   1. لكل ميزة RT x m/z، في عمود جديد، قم بحساب متوسط الاستجابة في فراغات الاستخراج.
   2. لكل ميزة RT x m/z، احسب متوسط الاستجابة في جميع العينات الأخرى (بما في ذلك عينات مراقبة الجودة).
   3. حساب النسبة المئوية لكثافة الذروة للفراغات في العينات (متوسط الاستجابة في استجابة فارغة/متوسطة في العينات × 100).
   4. فرز عمود المساهمة النسبة المئوية من أدنى القيم إلى أعلىالقيم.
   5. إزالة الميزات التي لديها أكثر من 5٪ مساهمة كثافة من الفراغات.
5. تصفية القيم المفقودة وتصحيح إشارات الميزة إلى إشارات في عينات مراقبة الجودة المجمعة.
   1. فتح برنامج معالجة البيانات(جدول المواد). انقر فوق الزر عرض MatrixAnalyzer. انقر على زر فتح ملف البيانات.
   2. انتقل إلى موقع ملف .csv الذي يحتوي على كثافة الذروة لميزات RT x m/z لكل عينة (مصفوفة غير مستهدفة). حدد فتح.
   3. تحت علامة التبويب عينات مراقبة الجودة، ملء كل معلمة على النحو المطلوب. لمجموعة البيانات الموضحة هنا، استخدم فئة QC = QC، تجاهل الفئات = فارغة، نوع الإسناد = لا شيء، عتبة التغطية = 80، مقياس باستخدام = لا تحجيم، إلغاء تحديد تحويل السجل، الصحيح باستخدام = تنعيم spline، التنعيم = 0.25.
   4. في أعلى يمين لوحة المصفوفة، انقر فوق تصحيح QCزر التشغيل .
   5. بعد إجراء التصحيح في أعلى يمين لوحة المصفوفة، انقر فوق حفظ النتائج. انتقل إلى موقع مناسب وحفظ ملف نتائج .csv.
6. تصفية البيانات لإزالة الميزات التي لديها > 20٪ RSD في عينات مراقبة الجودة.
   1. ترتيب البيانات بحيث تكون العينات في الصفوف والميزات في الأعمدة.
   2. في عمود جديد، احسب متوسط كثافة الذروة لعينات مراقبة الجودة.
   3. في عمود جديد، احسب الانحراف المعياري لشدة الذروة لعينات مراقبة الجودة.
   4. حساب الانحراف المعياري النسبي لكثافة الذروة لعينات مراقبة الجودة: (QC الانحراف المعياري / متوسط مراقبة الجودة) × 100.
   5. فرز الميزات من أدنى إلى أعلى %RSD وإزالة الميزات التي لديها RSD QC > 20٪.
7. تصفية البيانات لإزالة الميزات مع_{انخفاض معدل}الاختزال / RSD نسب_{مراقبة الجودة} (على سبيل المثال ، lt;1).
   1. في عمود جديد، احسب متوسط كثافة الذروة للعينات.
   2. في عمود جديد، احسب الانحراف المعياري لكثافة الذروة للعينات.
   3. حساب الانحراف المعياري النسبي لكثافة الذروة للعينات: (عينة الانحراف المعياري / متوسط العينة) × 100.
   4. في عمود جديد، قم بتقسيم عينات RSD بواسطة RSD QC.
   5. فرز القيم_{(RSD عينة}/ RSD_{نسب مراقبة الجودة)} من أعلى إلى أدنى وإزالة الميزات مع نسبة <1.
8. نسب القيم المفقودة (العديد من الأساليب المتاحة عبر الإنترنت).
   1. قم بتنسيق جدول البيانات بحيث تكون العينات في الصفوف والميزات في الأعمدة. يجب أن يكون العمود الأول اسم ملف العينات. إنشاء عمود إضافي بجوار أسماء الملفات وإدخال مجموعات العينة. في هذه الحالة، تم تجميع العينات حسب التنوع.
   2. حفظ جدول البيانات كملف .csv.
   3. انتقل إلى الصفحة الرئيسية لخط أنابيب تحليلي على شبكة الإنترنت لmetabolomics عالية الإنتاجية (انظر جدول المواد)وانقر فوق هنا لبدء.
   4. انقر على التحليل الإحصائي. ضمن تحميل البيانات الخاصة بك، حدد نوع البيانات: جدول كثافة الذروة ، التنسيق: عينات في صفوف (غير مقترنة) ثم اختر الملف.
   5. انتقل إلى ملف .csv، حدد فتح ثم حدد إرسال.
   6. في الصفحة التالية، حدد تقدير القيمة المفقودة. إلغاء تحديد الخطوة 1 (تم تنفيذ هذا في AnalyzerPro XD). في الخطوة 2، اختر أسلوبًا لتقدير القيم المفقودة.
      ملاحظة: بالنسبة للبيانات المعروضة هنا - تم تحديد "تقدير القيم المفقودة" باستخدام "KNN".
   7. في هذه المرحلة، يمكن تنزيل مصفوفة البيانات (حدد التنزيل من اللوحة اليسرى لصفحة الويب) أو الشروع في إجراء المزيد من التحليلات الإحصائية.

يتأثر الميتابولم النباتي بمزيج من الجينوم والبيئة ، بالإضافة إلى ذلك في بيئة زراعية ، نظام إدارة المحاصيل. نحن نثبت أن الاختلافات الجينية بين أصناف القمح يمكن ملاحظتها على مستوى المستقلب ، هنا ، مع أكثر من 500 مركب مقيس تظهر تركيزات مختلفة بشكل كبير بين الأصناف في الحبوب وحدها. لوحظت دقة الكتلة الجيدة (<10 جزء في المليون خطأ) واستنساخ الإشارة (<20% RSD) للمعايير الداخلية(الشكل 2)لكل من أوضاع التأيين السلبية والإيجابية(الجدول 3). أسفر إعداد العينة الموصوفة والتحليل الطيفي الطيفي للكتلة السائلة عن ميزات أكثر من 900 ديسيونفول في وضع التأيين السلبي وميزات deconvoluted في وضع التأيين الإيجابي. تم تضمين الفراغات التحضيرية(الشكل 3)لتحديد ما إذا كانت أساليب إعداد العينة وتحليلها قد أدخلت ميزات القطع الأثرية ، وبالتالي جميع التأثيرات غير البيولوجية التي تم التخلص منها من مصفوفة البيانات. ووجد أن 421 إشارة في الوضع السلبي و835 إشارة في الوضع الإيجابي كانت لها كثافة إشارة تساوي أو تزيد عن 5% من متوسط كثافة الإشارة في عينات الحبوب. تمت إزالة هذه الميزات وبعد مزيد من خطوات تصفية البيانات (الخطوة 7 والشكل 1)، عاد الوضع السلبي 483 ميزات وعاد الوضع الإيجابي 523 ميزات ، وتشكيل لقطة التمثيل الغذائي. وكانت هذه الطريقة ناجحة في الكشف عن الميزات، التي كانت كثافة مختلفة إلى حد كبير بين أصناف القمح(الشكل 4)مع أكثر من 500 ميزات هامة عبر كل من وسائط التأيين. في وضع التأيّن السلبي ، كانت غالبية الميزات الهامة في تدرج المرحلة المعكوسة وفي وضع التأيين الإيجابي ، كانت غالبية الميزات الهامة في تدرج الدهون(الشكل 4).

الشكل 1: سير العمل المستخدم في هذا التحليل لفحص البيانات ومعالجتها وتصفيتها. تتم الخطوة 1 باستخدام برنامج الحصول على البيانات / المشاهدة على الأداة بحيث يمكن إجراء تقييمات "أثناء التنقل". ويشمل ذلك حساب الخطأ الشامل للمعايير الداخلية وتراكب القمم القياسية الداخلية للتقييم البصري لقابلية استنساخ البيانات. تصف الخطوات 2-7 إجراء معالجة البيانات الموضح في البروتوكول، الخطوة 7. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الكروماتوجرامات الأيونية المستخرجة. استخراج الكروماتوجرامات أيون من ¹³C 6-sorbitol (الأزرق الداكن)، leucine-enkephalin (وردي)، د_6-عبرالقرفة حمض (البرتقال)، 2-aminoanthracene (الأخضر) وmiconazole (الأزرق الفاتح) المعايير الداخلية في إيجابية (أعلى) وسلبية (أسفل) التأيّن الكهربائي (ESI) وسائط.₆ يتم عرض أوقات الاحتفاظ القياسية الداخلية وكثافة. ESI + وESI - الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: إجمالي اللون اللوني للأيون (TIC) تراكب الفراغات الإعدادية التي تظهر الوضع السلبي (الوردي) والوضع الإيجابي (الأزرق) المقتنيات. يتم عرض معيار داخلي واحد، الميكونازول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: إجمالي اللون اللوني الأيوني (TIC) تراكب، يظهر الوضع السلبي (الوردي) والوضع الإيجابي (الأزرق) عمليات الاستحواذ وعدد الميزات المختلفة بشكل كبير بين تنوع القمح عبر التدرج اللوني. في الوضع السلبي ، تم العثور على أكبر عدد من الميزات الهامة عندما كان تكوين المرحلة المتنقلة B مرتفعًا. في الوضع الإيجابي ، تم العثور على أكبر عدد من الميزات الهامة عندما كان تكوين المرحلة المتنقلة C مرتفعًا. يتم عرض معيار داخلي واحد، الميكونازول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: اللونية السائلة توقيت البرنامج من التراكيب المرحلة المتنقلة.

الجدول 2: معلمات الكشف القصوى للمعايير الداخلية في أوضاع الاكتساب الإيجابية (والسلبية).

الجدول 3: عينة(n= 30) دقة الكتلة القياسية الداخلية (جزء في المليون) واستنساخ الإشارة قبل وبعد تصحيح مراقبة الجودة معبراً عنه كانحراف معياري نسبي (٪).

هنا ، نقدم طريقة metabolomics غير المستهدفة المستندة إلى LC-MS لتحليل حبوب القمح. وتجمع هذه الطريقة بين أربعة أوضاع للاقتناء (المرحلة المعكوسة والمرحلة المعكوسة للدهون والتأيّن الموجب والسالب) في وضعين بإدخال مرحلة متنقلة ثالثة في تدرج المرحلة المعكوس. وأسفر النهج المشترك عن نحو 500 من السمات ذات الصلة بيولوجياً لكل قطبية أيونية، مع ما يقرب من نصف هذه السمات المختلفة اختلافاً كبيراً في الكثافة بين أصناف القمح. تشير التغيرات الهامة في تركيز المستقلب في الحبوب من أصناف القمح المختلفة إلى تغير الكيمياء الحيوية ، والتي قد تكون مرتبطة بمقاومة المرض ، وتحمل الإجهاد وغيرها من الصفات الفينوتيبيكية المهمة لجودة الحبوب والعائد. على سبيل المثال ، تم استخدام نهج metabolomics لوصف آليات الدفاع رواية¹² واقتراح دور الأيض في تحمل الجفاف¹³. وقد تكون التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول قادرة على زيادة ربط الملامح الكيميائية الحيوية لأصناف معينة بالصفات الوراثية المرغوبة في بيئات وممارسات إدارية معينة. وهذا بدوره سيسمح بإنتاج أفضل جودة للحبوب وغلة لأنواع جينية مختارة.

وإدراج المعايير الداخلية أمر بالغ الأهمية لهذا البروتوكول للسماح للمستخدم بتحديد التغيرات في الإشارات، والتحولات الزمنية للاحتفاظ بها، وكمؤشرات لدقة الكتلة. قد تشير التغيرات في الإشارة، على سبيل المثال، إلى الاستخراج دون المستوى الأمثل، أو الحقن (بما في ذلك انسداد النظام السائل)، أو أداء الكاشف. وقد تشير التحولات الزمنية للاحتفاظ بضعف أداء المضخة، أو معادلة تدرج المرحلة المتنقلة غير الملائمة، أو إلى أن مرحلة عمود LC الثابتة قد تدهورت. ويمكن أن يكون ضعف دقة الكتلة مؤشراً على المعايرة المنجرفة وأن النظام يتطلب إعادة المعايرة. وفي جميع الحالات المذكورة أعلاه، ينبغي وقف النظام، والصيانة/الاستبدال المناسبين لقطع الغيار المنجزة. أدرجنا أربعة معايير في محلول الاستخراج المستخدم لإعداد الحبوب ومعيار في العينة النهائية المضافة قبل الحقن. وجرى الحرص على ضمان أن تكون المعايير قابلة لكل أسلوب من أشكال التأيين وتغطي مجموعة من أوقات الاحتفاظ؛ ومع ذلك، فإننا نعترف بأن هذه المجموعة من المعايير يمكن تحسينها مع إدراج معيار الدهون المسمى. وقد ثبت أن حبوب القمح يحتوي على مئات من triacylglycerols (TAGs)⁵، أي منها سيكون إضافة مناسبة لهذا البروتوكول. كما أن إدراج الفراغات الإعدادية وعينات مراقبة الجودة المجمعة⁸ هي خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. يتم الكشف عن الآلاف من ميزات الأيون في أساليب قياس الطيف الكتلي غير المستهدفة ومن المهم استبعاد تلك الموجودة فقط في عينات فارغة وكذلك تلك التي لم يتم اكتشافها بشكل مستنسخ (أي ارتفاع %RSD) طوال التحليل.

على الرغم من أن الطريقة الحالية توفر الكثير من الوقت والموارد ، إذا لم يكن مدير المذيبات الرباعية غير متوفر ، يمكن استخدام المرحلة القياسية المعكوسة وطرق الدهون لتحقيق نفس النتائج. ويكفي حجم الاستخراج المستخدم في هذا البروتوكول لتحليل أساليب الاقتناء الإضافية. يصف هذا البروتوكول استخراج الأسيتونتريل. في حين ناجحة، والمذيبات استخراج بديل، أو مزيج من المذيبات، وسوف توفر تغطية المستقلب مختلفة، والتي قد بدورها تقديم المزيد من الميزات و / أو إعطاء أفضل (أو أقل) كفاءة استخراج بعض المركبات. ولم نحاول تحديد هوية المستقلب للقياسات ذات الأهمية الإحصائية التي تم حلها في هذا البروتوكول؛ ومع ذلك ، فإن قواعد البيانات الطيفية الشاملة للأيض النباتي والدهون متوفرة وتطوير^5،14،15. ولتحديد الأيض، يجب جمع أطياف الكتلة المترادفة (MS/MS) بالإضافة إلى بيانات المسح الكامل. ويمكن جمع هذه خلال التشغيل الأولي باستخدام عينات مجمعة وطريقة MS / MS مناسبة أو على استخراج محفوظة (المخزنة في -80 درجة مئوية) مرة واحدة تم تحديد الأيض من الفائدة. لاحظنا تغييرات كبيرة أضعاف المركبات بين الأصناف لذلك نوصي بالقيام على حد سواء وفي الحالة الثانية، وذلك باستخدام مجموعة متنوعة معروفة لاحتواء تركيز عال من مجمع الفائدة للحصول على أعلى جودة طيف MS / MS.

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

ويود المؤلفون أن ينوهوا ببرنامج زمالة الزراعة والأغذية التابع لرئيس وزراء غرب أستراليا (وزارة الوظائف والسياحة والعلوم والابتكار، وحكومة غرب أستراليا) وزميل رئيس الوزراء، البروفيسور سيمون كوك (مركز الزراعة الرقمية، جامعة كورتين وجامعة مردوخ). تم دعم التجارب الميدانية وجمع عينات الحبوب من قبل حكومة برنامج الإتاوات للمناطق في غرب أستراليا. نحن نعترف غرانتلي ستاينر وروبير الفرنسية لمساهماتهم في التجارب الميدانية. يتم الاعتراف بالمنصات الحيوية الأسترالية الممولة من NCRIS لتمويل المعدات.