无目标液相色谱-质量光谱学-小麦粒基代谢代谢学分析

提出了一种对小麦粒代谢物和脂质进行非靶向分析的方法。该协议包括醋酸代谢物提取方法和反向相液色谱-质谱方法，在正负电喷雾电相成像模式下采集。

了解基因、环境和农业实践中的管理之间的相互作用，可以更准确地预测和管理产品产量和质量。代谢组学数据提供了在给定时间时刻读取这些相互作用的信息，并且对生物体的生化状态信息。此外，代谢物的单个代谢物或面板可用作产量和质量预测和管理的精确生物标志物。据预测，植物美塔博洛米将包含数千种具有不同物理化学特性的小分子，为生物化学洞察生理特性和生物标志物发现提供了机会。为了利用这一点，代谢学研究人员的一个关键目标是在单个分析中捕获尽可能多的物理化学多样性。在这里，我们提出了一种基于液相色谱-质谱的非靶向代谢组学方法，用于分析田间生长的小麦颗粒。该方法使用液体色谱四元溶剂管理器引入第三个移动相，并将传统的反向相梯度与脂质梯度相结合。详细介绍了谷物制备、代谢物提取、工具分析和数据处理工作流程。观察了良好的质量精度和信号可重复性，该方法每电离模式产生约500个生物学相关特征。此外，还确定了小麦品种之间的代谢物和脂质特征信号显著不同。

了解农业中基因、环境和管理实践之间的相互作用，可以更准确地预测和管理产品产量和质量。植物代谢物受基因组、环境（气候、降雨等）等因素的影响，在农业环境中，作物的管理方式（即肥料、杀菌剂等的应用）都受其影响。与基因组不同，甲目瘤受所有这些因素的影响，因此代谢组学数据在特定时间提供这些相互作用的生化指纹。基于代谢组学的研究通常有两个目标之一:第一，加深对生物体的生物化学的理解，并帮助解释与生理学相关的扰动（非生物或生物应激）的反应机制;第二，将生物标志物与正在研究中的扰动联系起来。在这两种情况下，拥有这种知识的结果都是一种更精确的管理策略，以实现提高产量和质量的目标。

据预测，植物美塔博洛米含有数千^种具有不同物理化学性质的小分子。目前，没有代谢组学平台（主要是质谱和核磁共振光谱学）可以在单个分析中捕获整个甲胺。开发此类技术（样品制备、代谢物提取和分析），在单个分析运行中尽可能大地覆盖甲胺，是代谢学研究人员的主要目标。以前对小麦颗粒的无目标代谢组学分析将多个色谱分离和采集极性的数据和/或仪器相结合，以扩大甲目覆盖。然而，这需要为每个方式单独编制和获取样品。例如，Beleggia等人²为GC-MS的极性分析物分析，以及对非极性分析物的GC-MS分析，编制了一个派生样本。Das等人³使用GC和LC-MS方法提高分析覆盖率;然而，这种方法通常需要上述单独的样品准备以及两个独立的分析平台。以前使用GC-MS^{22、3、43,4}和LC-MS^33、55平台对小麦颗粒的分析为GC-MS产生了50至412（55个已识别）特征，409个用于GC-MS和LC-MS的组合，几千个用于LC-MS脂质分析^5。通过将至少两种模式合并为一种分析，可以保持扩展的美表体覆盖率，从而增加生物解释的丰富性，同时节省时间和成本。

为了允许通过反向相色谱法有效地分离各种脂质，现代脂质学方法在洗脱溶剂⁶中通常使用高比例的异丙醇，为可能通过色谱学而无法解决的脂质类提供方便。为了进行有效的脂质分离，起始移动相在有机成分⁷中也比典型的反向相色谱方法高得多，后者考虑其他类别的分子。梯度开始时的高有机成分使得这些方法不太适合许多其他类分子。最值得注意的是，反向相液色谱法采用二元溶剂梯度，从大部分水性成分开始，随着色谱的洗脱强度增加，有机含量增加。为此，我们力求将两种方法结合起来，在单个分析中实现代谢物的脂质和非脂类的分离。

在这里，我们提出了一种使用第三个移动相的色谱法，并使用单个样品制备和一个分析柱实现结合传统的反向相和脂质组学的色谱法。我们采用了许多质量控制措施和数据过滤步骤，这些措施以前在主要临床代谢组学研究中实施过。这些方法有助于确定具有高技术可重复性和生物相关性的强健特性，并排除不符合这些标准的特征。例如，我们描述对池质样本^8、QC校正^9、数据过滤^99、1010和缺失特征¹¹的归记分析。

此方法适用于 30 个样本（每个样本约 150 个种子）。这里使用了10个不同田间种植小麦品种的三个生物复制。

1. 谷物制备

1. 从-80°C储存中检索样品（全谷物）。
   注:如果从多个季节采集样品，建议在收获后不久冷冻干燥种子。这样可以最大限度地减少不同存储期后可能出现的代谢物浓度变化。为此，将种子转移到15 mL塑料离心管（大约300个种子将填充管），并盖上铝箔。用针刺穿铝箔两三次，将整个谷物冷冻过夜（约24小时）。在此阶段，样品可以退回至-80°C 冰柜，也可以执行下一步。
2. 使用实验室搅拌机研磨种子，在 20 s 的高模式下进行两次运行。
   注:用于此协议的搅拌机需要至少约 150 个种子，以填充搅拌机到刀片高度，并给出相对均匀的地粒样品。
3. 从底座上取下搅拌机，然后点击搅拌机的侧面，将任何粗糙的磨碎颗粒带到样品表面。粗糙的材料可以丢弃或存储。
4. 将粉末状细磨材料从搅拌机转移到 2 mL 塑料微离心管。
   注:用去离子水清洗搅拌机，并在样品之间用LC-MS级MeOH冲洗。在继续下一个样品之前，确保搅拌机完全干燥。
5. 将细粒样品退回冰箱或继续下一步（代谢物提取）。

2. 制备萃取溶剂

注:在执行萃取的同一天制备萃取溶剂。

1. 准备每个标准至少2 mL 1mg/mL。使用醋酸酯 （ACN） 制备 2-氨基甲苯酸、云母酮和 d₆-转氨酸酸。用水制备¹³C₆-山梨醇。
2. 每 1 mg/mL 标准采用 2 mL，并加入 100 mL 体积烧瓶。
3. 用醋酸酯将体积瓶填充到行中。确保 100 mL 的醋酸素含有 20 μg/mL 的每个内部标准:2-氨基甲苯乙烯、云母醇^、13C₆-山梨醇、d_6-转氨酸酸。

3. 代谢物提取

1. 将 200 毫克细磨颗粒称重到 2 mL 微离心管中。
2. 将500μL的萃取溶剂加入200毫克细粒样品中。
3. 在 6，500 rpm 转速下，使用均质器混合 2 次 20 s。
4. 在 4 °C 下离心 5 分钟，16，100 x g。
5. 将上清液转移到 2 mL 塑料管中。
6. 从步骤 3.1 到 3.5 重复此步骤，总上清量约为 1.5 mL。
7. 漩涡混合上清。
8. 将每个提取物的同等体积（55 μL）转移到单独的 2 mL 管中，以制作池粒提取物样品。
9. 将提取物的 50 μL 等位物转移到玻璃瓶中。
   注:此时可以冷冻提取物 （-80 °C）， 或继续下一步并遵循 LC-MS 分析。

4. 制备LC-MS分析解决方案

注意:对于浓缩酸，务必向水/溶剂中添加酸。

1. 准备 50 mL 的 1 M 铵用于配体液。重3.153克铵，并转移到50mL体积瓶。将体积瓶填充到具有 LC-MS 等级 H₂O 的生产线上。
2. 制备1L的移动阶段A包括10mM铵的mate，0.1%的酸。为此，在 1 L 体积瓶中加入约 500 mL 的 LC-MS 级水。加入10 mL的1M铵为mate股票和1 mL的formic酸。将体积瓶填充到 LC-MS 等级 H₂O. 转移到 1 L 瓶和声波 15 分钟到脱气。
3. 制备1 L的移动相B，由10mM铵组成，在79:20:1丙酸酯:同丙醇:水，0.1%的酸度比。将 200 mL 异丙醇添加到 1 L 体积瓶中。加入10 mL的1M铵为mate股票和1 mL的formic酸。用醋酸酯将体积瓶填充到行中。转移到1升瓶和声波15分钟去气。
   注:在加入ACN之前，将1M铵酯稀释到同丙醇（IPA） 中。甲酸铵不溶于CAN。
4. 制备1 L的移动相C，由10mM铵组成，以89:10:1等丙醇:乙酰氨基醇:水为等值。为此，将约500 mL的异丙醇、10 mL的1M铵和100 mL的醋酸酯添加到1升体积瓶中。用异丙醇填充到行中。转移到1升瓶和声波15分钟去气。
5. 制备LC-MS系统洗涤溶剂
   1. 用新的溶液更换泵头清洗液。使用 50% 甲醇、10% 同丙醇或其他制造商建议。
   2. 在注射样品之前和之后，准备强和弱针洗溶液，用于清洗注射液液。对于强洗涤，添加相等的 ACN 和 IPA 卷。对于弱洗，在单独的瓶子中准备 10% ACN 的解决方案（对于此协议和样品数量，每个强和弱洗涤分别需要大约 500 mL 和 1 L）。
   3. 将针洗量分别设置为 600 μL 和 1800 μL，用于强洗和弱洗。

5. 制备LC-MS分析样品

1. 根据制造商的标准操作规程，制备400纳克/μL白细胞宁，将7.5mL的水放入含有3毫克白氨酸-苯甲林的12 mL白细胞-苯甲林小瓶中。在-80°C下冷冻50μL等位。
2. 准备100 mL的5%ACN含有200纳克/mL白细胞-苯甲苯甲林（50μL400纳克/μL白细胞素）。在 LC-MS 分析的同一天做好准备。
3. 将950 μL的5%醋三醇含有注射标准白氨酸-苯丙氨酸添加到步骤 3 制备的 50 μL 样品等位。
4. 涡旋混合制备的样品。

6. LC-MS 设置

注:制造商的用户指南中详细介绍了仪器和采集方法设置。概述以下一般指南和特定于此协议的详细信息。在获取数据之前，可以随时完成以下步骤。

1. 打开 LC-MS 硬件配置文件。
2. 设置表 1中概述的色谱方法。确保 LC 系统配备四元溶剂管理器来设置此梯度。
   注:IPA 是粘稠溶剂。它应该以低流速引入，在将组合物增加到98.0%之前，应使用足够的平衡时间。这些步骤将防止 LC 系统过度加压和停止。
3. 设置m/z范围 50-1，300 范围内每个正极和负 ToF-MS 模式的质谱仪采集方法。
   注:此处介绍的工作所用的仪器需要分别校准和运行正负方法（即方法内的极性切换是不可能的）。
4. 如果 LC 列是新的，则根据制造商的建议对列进行条件条件。
   注:在数据采集之前，应直接完成以下步骤。
5. 在"仅限 MS"硬件配置文件中，根据制造商的建议校准质谱仪。在每个采集模式之前完成此步骤，确保系统在校准前在每个给定模式中稳定下来。
6. 使用 LC-MS 级溶剂（包括移动相和洗涤溶剂）清洗和冲洗 LC 流体系统。
7. 使用LC方法启动条件对LC系统进行平衡，确保柱压稳定。
8. 在样品序列（如下所述）的开头注射钠前配钠（90% IPA中的0.5 mM），以检查仪器校准。
9. 设置仪器序列表，以便首先分析溶剂和制备（提取）空白;后跟用于系统调节的集中 QC 样本 （6-10）;然后，带有 QC 样本的随机样本列表作为技术复制定期运行（例如，每五次注射）。在序列末尾运行两个 QC 样本。
   注: 在示例文件名中包括日期和注入/采集顺序以及示例 ID 是很有帮助的。例如:YYYyyMMDD_Injectionnumber_Variety_Biological复制。在按下起动之前，确保 LC 柱压力稳定，并确保 LC 连接到 MS。

7. 数据处理

注: 一般数据处理工作流如图1所示。

1. 在序列运行时检查数据质量（内部标准质量精度（下面计算）和信号可重现性。为了检查信号的可重复性，对叠加光谱进行目视检查就足够了。
   注:质量误差（ppm） = （理论质量 = 测量质量） / 理论质量） x 10⁶
2. 生成包含样本 x 内部标准的对齐峰值强度矩阵（按保留时间和m/z值对齐）。
   1. 打开数据处理软件（参见材料表）。在"主页 > 打开"下，单击"数据"。导航到相应的文件位置并打开所有数据文件。
   2. 在"主页 > 序列 > 处理类型"下，从下拉菜单中选择"量化"。
   3. 在"主页 > 方法 > Quan"下，单击校准组件。使用表 2中提供的详细信息填写每个字段。单击"确定"。
   4. 在数据文件旁边的列的左侧面板上，通过右键单击单元格并选择"未知"来填充示例类型。将级别填写为n/a。
   5. 在"主页 > 处理"下，选择序列。选择一个位置来保存序列，然后单击"进程"。
   6. 在"主页 > 结果"下，选择"泉"。从Quan查看器中，选择"导出运行"到矩阵分析器。
   7. 从矩阵分析器结果查看器中，单击"导出到 csv"。将文件另存为电子表格文件。
   8. 在电子表格软件中，计算每个内部标准的强度（峰值面积）的平均、标准差和相对标准差。
3. 生成包含样本 x 非目标要素的对齐峰值强度矩阵（按保留时间和m/z值对齐）。
   1. 打开小分子发现分析软件（参见材料表），然后选择"文件>新建"以创建新的实验。命名实验并选择保存和存储实验文件的位置。单击"下一步"。
   2. 选择使用的仪器类型（高分辨率质谱仪）、数据格式（轮廓）和极性（正极或负极性）。单击"下一步"。选择库中提供的所有加道，并根据需要编辑加道库。单击"创建实验"。将加载一个新页面，其中其余数据处理将继续/发生。
   3. 导入数据文件。选择文件格式，然后选择导入。浏览到数据位置并选择要导入的数据文件。页面左侧面板上每个文件的进度将显示。
   4. 导入数据文件后，选择"开始自动处理"。选择用于选择对齐参照的方法。让软件评估所有运行是否合适，给出合适的样品列表（即QC样品），或者选择最适合的参考，即中序QC样品。选择"是"，自动对齐我的跑步>下一个。
   5. 在实验设计页面上选择"下一步"（稍后可以设置）。
   6. 选择执行峰值领料，然后设置参数。在"峰值领料限制"选项卡下，选择"绝对 Ion 强度"并输入100。选择应用最小峰值宽度并输入 0.01 分钟。选择"确定"> 完成。处理完成后，选择"关闭"。
      注:峰值领料限制可以根据需要针对其他数据文件类型进行优化。
   7. 在屏幕右下角，选择"完成部分"。查看对齐的运行，并确保每个示例与引用对齐。此处显示的数据的对齐分数为 >90%。选择"完成部分"。
   8. 在下一页中，在主题设计之间进行选择。命名设计。选择手动对运行进行分组并创建设计。添加条件，单击条件 1并相应地命名组。单击"完成部分"。
      注: 继续根据需要添加条件以在软件中使用统计信息。由于我们只使用该软件生成非目标矩阵，我们使用了标记为"all"的单一条件。
   9. 在下一页上，选择"完成部分"。不要重新进行峰值领料。
   10. 查看"完成"，然后单击"完成部分"。
   11. 转到文件>导出化合物测量。取消选择输出中不需要的任何属性。单击"确定"。选择保存 .csv 文件的位置。单击"保存 +gt; 打开文件 +gt;打开文件夹"或"关闭"。
4. 使用提取空白筛选数据以删除伪影（电子表格软件）。
   1. 对于每个 RT x m/z要素，在新列中，计算提取空白中的平均响应。
   2. 对于每个 RT x m/z特征，计算所有其他样本（包括 QC 样本）的平均响应。
   3. 计算样本中空白的峰值强度百分比（样本 x 100 中空白的平均响应/平均响应）。
   4. 对贡献百分比列从最低值到最高值进行排序。
   5. 从空白中删除具有 >5% 强度贡献的要素。
5. 筛选缺失值并将特征信号校正为池式 QC 样本中的信号。
   1. 打开数据处理软件 （材料表）。单击"查看矩阵分析器"按钮。单击"打开数据文件"按钮。
   2. 导航到包含每个样本（非目标矩阵）RT x m/z 要素的峰值强度的 .csv 文件位置。选择"打开"。
   3. 在"QC 样本"选项卡下，根据需要填写每个参数。对于此处描述的数据集，使用 QC 类别_QC，忽略类别 =空，归因类型 =无，覆盖阈值 =80，使用缩放[无缩放，取消检查日志转换，正确使用=平滑样条线，平滑=0.25。
   4. 在矩阵面板的右上角，单击播放按钮QC 校正。
   5. 在矩阵面板的右上角执行更正后，单击"保存结果"。导航到适当的位置并保存 .csv 结果文件。
6. 筛选数据以删除 QC 样本中具有 >20% RSD 的功能。
   1. 排列数据，使示例位于行中，要素以列表示。
   2. 在新列中，计算 QC 样本的平均峰值强度。
   3. 在新列中，计算 QC 样本峰值强度的标准偏差。
   4. 计算 QC 样本峰值强度的相对标准差:（QC 标准差/QC 平均值） x 100。
   5. 从最低到最高的 %RSD 对要素进行排序，并删除具有 QC RSD >20% 的功能。
7. 筛选数据以删除 RSD_采样/RSD_质量控制比率低（例如<1）的要素。
   1. 在新列中，计算样本的平均峰值强度。
   2. 在新列中，计算样本峰值强度的标准差。
   3. 计算样本峰值强度的相对标准差:（样本标准差/样本平均值） x 100。
   4. 在新列中，将样本 RSD 除以 QC RSD。
   5. 将值（RSD_样本/RSD_QC比率）从最高到最低进行排序，并删除比率 <1 的要素。
8. 归因缺少值（多种方法可在线获取）。
   1. 设置电子表格的格式，以便示例以行表示，要素以列形式排列。第一列应为示例文件名。在文件名旁边创建一个附加列，然后输入示例分组。在这种情况下，样本按品种分组。
   2. 将电子表格另存为 .csv 文件。
   3. 转到基于 Web 的分析管道的主页，了解高通量元代谢组（请参阅材料表），然后单击"单击此处开始"。
   4. 单击统计分析。在"上传数据"下，选择"数据类型:峰值强度表"，"格式:行中的样本（未配对）"，然后选择"文件"。
   5. 导航到 .csv 文件，选择"打开"，然后选择"提交"。
   6. 在下一页上，选择"缺少值估计"。取消选中步骤 1（这在 AnalyzerPro XD 中执行）。在步骤 2 中，选择一种方法来估计缺失的值。
      注: 对于此处显示的数据 - 选择了"KNN"的"估计缺失值"。
   7. 在此阶段，可以下载数据矩阵（从网页左面板中选择下载）或继续执行进一步的统计分析。

植物美谱受其基因组和环境的组合影响，此外，在农业环境中，作物管理系统。我们证明，小麦品种之间的遗传差异可以在代谢物水平上观察到，在这里，500多种测量化合物表明，仅在谷物中品种之间的浓度就明显不同。对于负电化和正电化模式，观察到内部标准（下图2）的良好质量精度（<10 ppm 误差）和信号重现性（<20% RSD）。Table 3所述样品制备和液相色谱-质谱分析在负电化模式下产生了 >900 脱硫特征，在正电化模式下获得了 >1300 分光特征。包括制备空白（图3），以确定样品制备和分析方法是否引入了表面特征，从而消除了数据矩阵中的所有非生物影响。结果发现，421个负模式信号和835个正模式信号的信号强度等于或大于颗粒样品中平均信号强度的5%。这些功能被删除，在进一步的数据筛选步骤（步骤 7 和图 1）后，负模式返回 483 特征，正模式返回 523 个要素，形成代谢快照。该方法在检测功能上是成功的，小麦品种的强度显著不同（图4），具有两种电理模式的特数500显著特征。在负电化模式下，大多数显著特征处于反向相位梯度和正电化模式，大多数显著特征在脂质梯度（图4）。

图 1:此分析中使用的用于数据检查、处理和筛选的工作流。步骤 1 使用仪器上的数据采集/查看软件进行，以便进行"动态"评估。这包括计算内部标准的质量误差 （ppm） 和叠加内部标准峰值，以便直观地评估数据可重现性。步骤 2-7 描述了协议第 7 步中概述的数据处理过程。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 2:提取的 ion 色谱图。提取的电离色谱图为¹³C_6-血小脂醇（深蓝色），白氨酸-苯丙胺（粉红色），d_6-跨辛纳酸（橙色），2-氨基纳西苯（绿色）和云母（浅蓝色）内部标准在正（顶部）和负（底部）电喷雾电离（ESI）模式。显示了内部标准保留时间和强度。ESI + 和 ESI -请单击此处查看此图形的较大版本。

图 3:显示负模式（粉红色）和正模式（蓝色）采集的假定空白的总电位色谱图 （TIC） 叠加。显示了一个内部标准，即云母。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 4:总电位色谱图 （TIC） 叠加，显示负模式（粉红色）和正模式（蓝色）采集以及小麦品种之间在色谱梯度中显著不同的特征数。在负模式下，当移动相 B 组合量高时，发现显著特征的数量最大。在正模式下，当移动相 C 组成量高时，发现显著特征数量最多。显示了一个内部标准，即云母。请点击此处查看此图形的较大版本。

表1:流动相构图的液相色谱计时程序。

表 2:正（和负）采集模式下内部标准的峰值检测参数。

表3:样品（n=30）内部标准质量精度（ppm）和信号重复性前后的QC校正表示为相对标准差（%）。

在这里，我们提出了一种基于LC-MS的无靶向代谢组学方法，用于小麦颗粒分析。该方法通过将第三个移动相引入反向相梯度，将四种采集模式（反向相位和脂质抗逆相与正负电离）合并为两种模式。该组合方法每电离极性产生约500个生物学相关特征，其中大约一半在小麦品种的强度上明显不同。不同小麦品种颗粒代谢物浓度的显著变化表明生物化学的变化，这可能与抗病性、耐应力性和其他对谷物质量和产量很重要的类比特征有关。例如，元代谢学方法被用来描述新的防御机制^12，并提出代谢物在抗旱¹³中的作用。该协议的未来应用也许能够进一步将特定品种的生化概况与某些环境和管理做法所期望的遗传性特征联系起来。反过来，这将允许生产选定的基因型的最佳谷物质量和产量。

包含内部标准对于该协议至关重要，以便用户确定信号、保留时间偏移和质量精度指标的变化。例如，信号的变化可能表示次最佳提取、喷射（包括流体系统堵塞）或探测器性能。保持时间偏移可能表示泵性能差、移动相梯度平衡不当或 LC 柱固定相位已恶化。质量精度差可能表示漂移校准，并且系统需要重新校准。在上述所有情况下，应停止系统，并执行相应的部件维护/更换。我们在用于制备谷物的萃取溶液中包括四个标准，在注射前添加的最终样品中包括一个标准。已注意确保标准适用于每种电位模式，并涵盖一系列保留时间;然而，我们承认，通过加入标有脂质标准，这一系列标准可以得到改善。已经表明，小麦粒含有数百个三甘油（TAGs）5，其中任何一个是本⁵协议的适当补充。包含准备空白和集合 QC 样本⁸也是该协议中的关键步骤。在非靶向质谱方法中检测到数千个ion特征，在整个分析过程中排除那些只存在于空白样品中以及未被重新检测（即高%RSD）的ion特征非常重要。

虽然目前的方法节省了大量的时间和资源，但如果四元溶剂管理器不可用，可以使用标准反转相和脂质方法来实现相同的结果。该协议中使用的提取量足以分析其他采集模式。该协议描述了醋酸酯提取。虽然成功，替代萃取溶剂，或溶剂的组合，将提供不同的代谢物覆盖，这反过来可能提供更多的功能和/或给予更好（或较小的）萃取效率的某些化合物。我们尚未试图建立该协议中解析的统计显著性测量的代谢物标识;然而，植物代谢物和脂质的光谱数据库是可用的，并开发^{5,5，14，15。,15}为了识别代谢物，除了完整的扫描数据外，还需要收集串联质谱 （MS/MS）。在确定感兴趣的代谢物后，可以使用池样本和适当的 MS/MS 方法或在保留提取物（存储在 -80°C）上收集这些样本。我们观察到品种之间化合物的折叠变化较大，因此我们建议在二次使用已知含有高浓度的感兴趣化合物的品种中同时使用，以获得最高质量的 MS/MS 光谱。

作者没有什么可透露的。

作者感谢西澳大利亚州总理的农业和食品奖学金计划（西澳大利亚州政府就业、旅游、科学和创新系）和总理研究员西蒙·库克教授（该中心数字农业、柯廷大学和默多克大学）。现场试验和谷物样品收集得到了西澳大利亚州政府区域版税计划的支持。我们感谢格兰特利·施泰纳和罗伯特·法兰西对现场审判的贡献。NCRIS资助的澳大利亚生物平台公司因设备融资而得到认可。