Andamios de impresión de núcleo/concha para la ingeniería de tejidos de estructuras tubulares

Aquí se presenta una configuración de bioimpresión tridimensional, núcleo/cáscara, fácil de usar, para la fabricación en un solo paso de andamios huecos, adecuado para la ingeniería de tejidos de estructuras vasculares y otras estructuras tubulares.

La impresión tridimensional (3D) de filamentos de núcleo/cáscara permite la fabricación directa de estructuras de canal con una carcasa estable que está reticulada en la interfaz con un núcleo líquido. Este último se retira después de la impresión, dejando atrás un tubo hueco. La integración de una técnica de fabricación aditiva (como la que se describe aquí con tintas [bio]hechas a medida, que imitan estructural y bioquímicamente la matriz extracelular nativa [ECM]) es un paso importante hacia la ingeniería avanzada de tejidos. Sin embargo, la fabricación precisa de estructuras bien definidas requiere estrategias de fabricación a medida optimizadas para el material en uso. Por lo tanto, es sensato comenzar con una configuración personalizable, fácil de usar y compatible con un amplio espectro de materiales y aplicaciones. Este trabajo presenta una boquilla de núcleo/cáscara fácil de fabricar con compatibilidad luer para explorar la impresión de núcleos/conchas de estructuras de pilas de madera, probada con una formulación de material de andamio bien definida y a base de alginato.

Podría decirse que el objetivo final de la ingeniería tisular (TE) es producir tejidos u órganos funcionales in vitro, que pueden utilizarse para regenerar o reemplazar partes lesionadas o enfermas del cuerpo humano^1,2,3. La investigación actual en ingeniería de tejidos (TE) se centra en aspectos individuales del campo (materiales de andamios, procedimientos de fabricación, fuentes celulares, etc.) ^4,5, así como el desarrollo de modelos simples in vitro de tejidos y órganos que imitan aspectos fundamentales de sus contrapartes in vivo. Estos modelos ya son útiles para muchas aplicaciones, como el cribado de fármacos y los estudios de toxicidad, especialmente en los casos en que los cultivos celulares 2D convencionales no imitan las respuestas dinámicas de los tejidos nativos^{6,7, 8,9}. Los modelos in vitro tridimensionales se construyen generalmente combinando las células¹⁰, las señales fisicoquímicas^11,y las moléculas biológicamente activas^12,13 en andamios, que se obtienen de tejidos descelularizados o construidos de novo a partir de materiales biológicos o biocompatibles^{14,15,16,17,18.}

Es crucial que los andamios recapitulen la compleja microarquitectura 3D y la estructura jerárquica de los tejidos nativos para permitir la funcionalidad de los tejidos de ingeniería, representativos de los tejidos in vivo^19. A pesar de los avances tecnológicos significativos en TE, el desarrollo de construcciones de tejidos artificiales fisiológicamente relevantes sigue siendo un desafío. Los tejidos gruesos (>200 m de espesor) son especialmente problemáticos, debido a limitaciones como la difusión de oxígeno y nutrientes²⁰. Se ha avanzado hacia construcciones de tejidos más grandes; sin embargo, la alta proximidad requerida de las células a los vasos sanguíneos con el fin de transportar oxígeno y nutrientes y promover la eliminación de residuos debe ser recapitulada. La vascularización de los tejidos (o alternativamente, la fabricación de redes vasculares 3D interconectadas dentro de las construcciones de tejidos) desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la viabilidad celular y la promoción de las funciones de los tejidos de ingeniería in vitro, lo cual es más difícil para modelos en experimentos prolongados^21,22. Además, la resolución requerida, la integridad estructural y la biocompatibilidad simultánea aún no se han logrado²³.

Se han propuesto varios enfoques de TE en un intento de construir estructuras similares a los vasos sanguíneos y facilitar la vascularización in vitro. Algunos ejemplos incluyen la sembración de células endoteliales (también co-cultivadas con otros tipos de células como fibroblastos) que se autoensamblan para generar redes microvasculares^24,uso de células progenitoras vasculares y pericitas que promueven células endoteliales crecimiento^21,25, la entrega de factores de crecimiento angiogénicos que inducen la vascularización^20,26, utilizando la tecnología de lámina celular que permite el control sobre las capas vasculares^20,y la fabricación de estructuras de andamios altamente porosas que promueven la angiogénesis^27. Los enfoques mencionados se centran en la inducción de la angiogénesis, que generalmente requiere cantidades considerables de factores de crecimiento adicionales (por ejemplo, VEGF) y tiempo para formar. Sin embargo, los mayores inconvenientes son su reproducibilidad limitada y control espacial restringido sobre el patrón vascular, por lo general resultando en una distribución aleatoria de la vasculatura dentro de la construcción del tejido que no necesariamente facilita la perfusión.

La fabricación aditiva (AM, como la bioimpresión 3D) está cada vez más involucrada en la fabricación de construcciones 3D utilizando materiales biológicos o biocompatibles para crear andamios adecuados para TE. Se están utilizando y desarrollando varios enfoques de AM en paralelo (por ejemplo, métodos basados en chorros de tinta y microextrusión, diferentes tipos de técnicas litográficas) para producir andamios que imitan los tejidos nativos en su arquitectura, bioquímica y funcionalidad . Las técnicas individuales exhiben ciertas ventajas y desventajas^28,razón por la cual se están explorando varias modificaciones (por ejemplo, micropatrones, angiogénesis inducida, etc.) para aumentar la medida en que grandes, complejos y estables vasculares las redes se pueden fabricar^22,29,30.

Entre ellos, la bioimpresión por extrusión es el método más utilizado, especialmente debido a la amplia gama de materiales compatibles (un proceso generalmente amigable con las células^28,31,32),así como una versatilidad excepcional en términos de las aplicaciones (por ejemplo, impresión integrada y sacrificial^23,33,fabricación de estructuras huecas^34,35,etc.). Los principales desafíos que preocupan a los estudios presentes incluyen la transferencia de estructuras 2D a 3D, la formación de una densa red de tubos huecos con alta resolución espacial, y la integridad mecánica general y la fidelidad de la forma durante el flujo de fluidos en el cultivo celular condiciones³⁰.

El enfoque más sencillo para el tejido perfundible es la fabricación de una red interconectada de canales dentro de la construcción. Se espera que la creación de estos canales perfundibles dentro de un andamio tisular resuelva muchos de los problemas antes mencionados, ya que permite inmediatamente la difusión de nutrientes y oxígeno mientras se retiran los productos de desecho. Por lo tanto, se evita la formación potencial de regiones necróticas dentro de la construcción³⁶. Estos canales también pueden ser sembrados con células endoteliales (ECs) y servir como vasos sanguíneos artificiales en los modelos de tejido 3D³⁷. En el sentido más elemental, un recipiente puede consistir en un canal hueco, una capa suave de ECs y un capa rígido. Recientemente, la extrusión 3D de dos materiales diferentes en forma de núcleo/cáscara utilizando agujas coaxiales para extrusión ha ganado mucho interés^38,39,40,41, ya que permite la fabricación de tubos huecos.

Al igual que la impresión 3D de microextrusión convencional, la impresión de núcleo/concha se realiza con una boquilla coaxial (porejemplo, dos agujas con diferentes diámetros alineados en el mismo eje de una manera, de modo que la aguja más ancha encierra la más estrecha). Por lo tanto, dos materiales se pueden extruir simultáneamente, con uno como filamento central o núcleo "interno" y un segundo como la cáscara "exterior"⁴¹. Hasta la fecha, la bioimpresión coaxial se ha utilizado para fabricar estructuras con⁴²sólidos, núcleo/cáscara⁴³y hebras huecas^40,44; sin embargo, los materiales utilizados no han sido optimizados tanto para la viabilidad óptima de la célula como para la robustez mecánica de las construcciones impresas. Como se ha mencionado, la técnica ofrece la posibilidad de combinar biomateriales con diferentes propiedades mecánicas, en las que el más rígido soporta el más suave. Más importante aún, si el material del andamio (por ejemplo, alginato, carboximetilcelulosa) se extruye como cáscara, mientras que el núcleo compuesto por el agente reticulación (por ejemplo, cloruro de calcio) se dispensa del capilar interno y luego se enjuaga después de la impresión, es posible fabricar un tubo hueco continuo en un solo paso⁴⁵.

Con esto en mente, se desarrolló un método simple y repetible de un solo paso para construir andamios bien definidos y perfundibles para la ingeniería de estructuras vasculares y otros tejidos tubulares. Para desarrollar una tecnología rentable, la fabricación debería ser idealmente un proceso de un solo paso. Por lo tanto, se adaptó e integró una configuración de núcleo/casco en la bioimpresora 3D. El diseño básico consiste en una boquilla central de metal para evitar la deformación durante la inyección, alrededor de la cual se coloca una segunda boquilla de un diámetro más grande. Esta configuración de boquilla coaxial permite la coextrusión de los dos flujos y la reticulación inmediata del canal de hidrogel extruido. Esto permite la fabricación directa de filamentos huecos multicapa, mientras que la posterior reticulación con concentraciones más altas de cloruro de calcio (CaCl₂) aseguran una estabilización más permanente desde el exterior.

Como tal, este método permite la impresión simultánea de andamios y microcanales, en los que los filamentos de hidrogel hueco sirven como un andamio para apoyar la integridad mecánica de las construcciones 3D y simultáneamente actúan como microcanales incorporados para entregar nutrientes para el crecimiento celular. Este protocolo proporciona un procedimiento detallado de la estrategia de bioimpresión 3D de núcleo/cáscara basada en el uso de una boquilla coaxial hecha a medida en la que las estructuras 3D de hidrogel con canales incorporados se fabrican mediante el control de la reticulación para producir filamentos huecos, que permanecen perfundibles durante el cultivo celular.

La configuración de impresión 3D utilizada en este trabajo está configurada como se describió anteriormente por Banovic y Vihar⁴⁶ y se puede dividir en tres componentes principales: A) una configuración mecánica CNC de tres ejes con una precisión de posicionamiento de 50 m en las direcciones X, Y y Z; B) dos extrusoras, adaptadas para jeringas desechables de bloqueo luer de 5 ml, con resolución de vóxeles de 1,2 l; y C) control de la electrónica y el software.

Para facilitar la impresión de núcleos/cascos, se desarrolló una boquilla adecuada que se puede montar en una de las extrusoras (extrusora primaria, impresión del núcleo) y es compatible con agujas de extremo romo G27. También tiene compatibilidad luer-lock para conectar con el segundo extrusor (impresión del shell). Los primeros prototipos se fabricaron insertando una aguja G27 de extremo romo (diámetro interior de 210 m, diámetro exterior a 410 m) en una aguja G21 (diámetro interior de 510 m, diámetro exterior a 820 m) o punta cónica G20 (diámetro interior a 600 m), y luego insertando una punta secundaria n eedle lateralmente para suministrar el material de la cáscara. Sin embargo, debido a la ligera flexión del eje de la aguja, no es posible producir una punta de boquilla con alineación concéntrica de las agujas internas y externas.

Para resolver este problema, se ideó un nuevo diseño de boquilla que cumplió con los siguientes criterios: 1) se puede fabricar utilizando un molino CNC de 3 ejes, 2) se puede hacer de diversos materiales (plásticos de alto rendimiento, como PEEK o metales), 3) tiene compatibilidad luer-lock para aplicar material de vaciado, y 4) es compatible con una aguja de extremo romo G27 y lo mantiene en su lugar en dos posiciones para alinear la punta con el eje central. En la Figura 1se muestra un esquema del prototipo de la boquilla.

1. Preparación de hidrogeles y soluciones de reticulación

1. Brevemente, mezclando vigorosamente, disolver los polvos de ALG y CMC en agua ultrapura para obtener un total de 3 wt% ALG y 3% wt% solución CMC.
   NOTA: En este trabajo, se utilizan jeringas de 5 ml para imprimir; por lo tanto, la cantidad final de material se ajusta a ese volumen. Sin embargo, para otros cartuchos de extrusión y tamaños de muestra impresos, la cantidad de material preparado debe escalarse en consecuencia.
2. Añadir 1.5 wt% nanofibras de celulosa a la mezcla ALG-CMC para un refuerzo mecánico adicional para alcanzar la viscosidad deseada, adecuado para la impresión.
3. Agitar la suspensión del hidrogel hasta que sea homogénea utilizando un mezclador superior.
   NOTA: No deben haber fibras ni burbujas en el hidrogel.
4. Preparar 10 ml de solución de cloruro de calcio de 100 mM (CaCl₂₎en agua ultrapura, que se utiliza como solución de reticulación primaria para la impresión.
5. Preparar 10 ml de 5 wt.% CaCl₂ solución en agua ultrapura, que se utiliza como solución de reticulación secundaria en el procesamiento posterior de andamios.
   NOTA: Generalmente, todas las formulaciones de hidrogel, que son adecuadas para la reticulación química inmediata, permiten la fabricación de tubos huecos en un solo paso y se pueden utilizar con este tipo de configuración de núcleo/cáscara. Los mecanismos de impresión y reticulación deben optimizarse en consecuencia. La viscosidad del hidrogel variará dependiendo de la composición deseada; sin embargo, se puede ajustar con concentraciones de polímeros y la adición de agentes espesantes (por ejemplo, nanofibras). La viscosidad ideal para la impresión 3D de estructuras estables es lo suficientemente alta como para que el filamento extruido conserve su forma y para que el andamio mantenga su propio peso antes de la reticulación.

2. Impresión de núcleo/concha de andamios perfundibles

1. Antes de imprimir, esterilizar la bioimpresora pulverizando 70% de etanol a fondo y exponerlo a la luz UV durante 1 h.
2. Encienda la bioimpresora y ejecute el software de control, que viene en un paquete con la impresora 3D.
3. Realice el procedimiento de localización pulsando el icono Inicio.
4. Usando el comando de la barra de herramientas Archivo ( barded Archivo) Importar G-Code, importe el código g-desconebl.
5. Transfiera el hidrogel a una jeringa estéril de 5 ml y colóquelo en uno de los soportes del extrusor de la impresora 3D. A través del bloqueo de luer y un tubo corto, conéctelo a la entrada lateral de la boquilla del núcleo/cáscara.
6. Transfiera la solución de reticulación (100 mM CaCl₂) a otra jeringa estéril de 5 ml con una aguja de extremo romo G27 conectada e insértela en el soporte superior de la aguja del núcleo/boquilla de la carcasa. La aguja interior debe sobresalir ligeramente (1 mm) de la boquilla exterior del núcleo/cáscara. Ajuste la alineación manualmente. Inserte la segunda jeringa en el soporte de extrusión.
7. Para insertar correctamente las jeringas en los soportes (configuración que se muestra en la figura 2), controle manualmente ambos soportes de extrusión haciendo clic en las flechas A y B y Arriba y Abajo.
8. Antes de que comience la impresión, extruya por separado el hidrogel y la solución de reticulación para eliminar todo el exceso de burbujas de aire en la boquilla del núcleo/cáscara y garantizar un flujo continuo de hidrogel.
9. Con las flechas Z y Arriba y Abajo, ajuste manualmente la distancia entre la boquilla y el sustrato de impresión. Se recomienda utilizar un sustrato plano de impresión de vidrio, que tenga buena adherencia. La boquilla de extrusión no debe estar en contacto con el sustrato para permitir un flujo ininterrumpido del hidrogel. La distancia óptima entre la boquilla y el sustrato (altura de la capa) suele ser la misma que la anchura del diámetro exterior de la boquilla, pero se ajusta al material utilizado y a los parámetros de impresión individuales. Ajuste la altura de impresión inicial según las necesidades individuales.
10. Pulse el botón Reproducir para iniciar el proceso de impresión.
    NOTA: Se recomienda incluir la impresión de una falda(Figura 3) que rodea el andamio para asegurar la colocación de un filamento hueco homogéneo antes de que comience la impresión del andamio real. Para lograr un flujo óptimo de hidrogel con la intención de imprimir andamios óptimos, variar la composición de la formulación, la composición de la solución reticulada y los parámetros de impresión (es decir, la velocidad de impresión, la presión de extrusión, la temperatura de impresión, la distancia entre el boquilla de sustrato y extrusión, etc.).
11. Después de imprimir, retire cuidadosamente el sustrato con el andamio impreso y vierta la solución de reticulación secundaria (5 wt.% CaCl₂) sobre todo el andamio para asegurar el enlace cruzado sobre todo el andamio. Incubar durante 1 min a temperatura ambiente (RT).
    NOTA: Asegúrese de que todo el andamio esté sumergido en la solución de reticulación. Este paso es crucial para lograr las propiedades de resistencia deseadas del andamio, pero variará dependiendo del material y el método de reticulación utilizado.
12. Usando un bisturí cortar manualmente el exceso de material de falda.
13. Esterilice los andamios bajo una luz UV durante 30 minutos.
14. Separe cuidadosamente el andamio del sustrato tirando suavemente de él hacia los lados. Si el andamio se adhiere fuertemente al sustrato, sepárelo insertando un borde afilado entre ellos.
15. Transfiera el andamio a un medio de cultivo celular incoloro (DMEM complementado con 5 wt.% FBS, 100 U/ml de penicilina y 1 mg/ml de estreptomicina), e incubarlo a 37 oC en una atmósfera que contenga 5 wt.% CO₂ durante al menos 24 h.

3. Preparación de células endoteliales y solución de ensayo vivo/muerto

1. Para el cultivo celular, preparar el medio de cultivo celular DMEM avanzado con rojo fenol añadido y complementarlo con 5 wt.% FBS y 2 mM L-glutamina. Añadir 100 U/ml de penicilina y 1 mg/ml de estreptomicina.
2. Iniciar la línea de la célula endotelial de la vena umbilical humana (HUVEC) y pasarlas de acuerdo con los protocolos de cultivo HUVEC como se describe⁴⁷.
   NOTA: Se recomienda cultivar las células en medios de cultivo celular con rojo fenol añadido para una visualización simple durante la inyección de las células en andamios translúcidos blancos como se describe a continuación.
3. Para el recuento celular, pipeta 100 l de células suspendidas en medios de cultivo celular y las tiñen con 900 sL de 0,1 wt.% trypan blue solution.
4. Utilice un contador de células automatizado o un hemocitómetro manual para contar y obtener el número estimado de células en suspensión.
5. Para el ensayo vivo/muerto, prepare una solución de 4 mM de calceina-AM y yoduro de propidium de 2 mM en PBS estéril.
   NOTA: La solución viva/muerta debe prepararse directamente antes de realizar el ensayo.

4. Transferencia de células a andamios

1. Retire los andamios de los medios de cultivo celular y transfieralos a un plato Petri de vidrio suficientemente grande.
2. Inmediatamente antes de inyectar las células en los andamios, disociar los HUVEC de los matraces utilizando el tratamiento por 0,25 wt.% de trippsina.
   1. Brevemente, deseche los medios de cultivo celular e incubar las células con 0,25 wt.% de trippsina (2 ml) durante 5 min a 37 oC.
   2. Después de la incubación agregue 3 ml de medios de cultivo celular a las células taquifugadas y transfiera todas las células separadas a un tubo centrífugo.
   3. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
   4. Resuspenda las células en medios de cultivo celular fresco.
3. Cuente las celdas como se describió anteriormente. Ajuste la concentración celular total de acuerdo con las necesidades individuales. En este trabajo, se utiliza una concentración inicial de 340.000 células/ml.
4. Resuspenda las células en una jeringa estéril con una aguja G27 contundente conectada.
5. Encuentre un punto de entrada y comience a inyectar cuidadosamente las células en los andamios. El flujo de suspensión celular a través de un andamio translúcido debe ser visible. Asegúrese de que todo el andamio se llene con suspensión celular.
6. Sumerja los andamios en los medios de cultivo celular e incubarlos a 37 oC en una atmósfera que contenga 5 wt.% CO₂ durante un máximo de 10 días.
7. Reponer los medios de cultivo celular de acuerdo con las necesidades experimentales.

5. Ensayo vivo/muerto e imágenes celulares

1. Después de la incubación, enjuague los andamios con PBS.
2. Con una aguja de extremo romo, inyecte cuidadosamente la solución viva/muerta previamente preparada (4 mM de calceína-AM y yoduro de propidium de 2 mM en PBS) en los andamios e incubarla en PBS durante 30 minutos a 37 oC. Asegúrese de que la solución fluye a través de la longitud de todo el andamio.
3. Enjuague los andamios con PBS.
4. Transfiera cuidadosamente los andamios a un portaobjetos de vidrio.
5. Observe las células temidas directamente en los andamios bajo un microscopio de fluorescencia.
   NOTA: Las células viables producen fluorescencia verde y las células muertas emiten luz de fluorescencia roja.

El objetivo de este trabajo era desarrollar una boquilla de núcleo/cáscara fácil de fabricar con compatibilidad luer para la impresión de núcleos/conchas de estructuras de pilas de madera. Además, se describió un protocolo de impresión sencillo y repetible de un solo paso, que es fácil de modificar y se adapta a una amplia gama de materiales y diferentes mecanismos químicos de reticulación para construir andamios perfundibles y perfundibles bien definidos para ingeniería de estructuras vasculares y otras estructuras tubulares.

Boquilla de núcleo/cáscara
La boquilla se compone de una aguja de extremo romo G27 (para imprimir el filamento axial interno) y el cuerpo de la boquilla, que mantiene la aguja en su lugar y crea una boquilla externa para el filamento de la cáscara con un puerto de conexión para la entrada de material. En la Figura 1se muestra un esquema. Dos jeringas de 5 ml, que se colocan en las extrusoras individuales y proporcionan el núcleo y los materiales de la cáscara. Tubo conecta el cuerpo de la boquilla con la jeringa, proporcionando el material de la cáscara.

El conjunto completo de la boquilla de núcleo/cáscara y la configuración de la jeringa se muestra en la Figura 2. El primer prototipo funcional del cuerpo de la boquilla fue fabricado por fresado CNC un bloque de polioximetileno (POM). La compatibilidad y el sellado entre el elemento, una aguja G27 y un tubo se probaron mediante la instalación en Vitaprint. No se observó ninguna fuga del material de la cáscara en la boquilla, el conector de bloqueo luer, o entre el cuerpo y la aguja. El cuerpo de la boquilla encaja firmemente con el cubo de la aguja (conector luer), asegurando el movimiento sincronizado de toda la boquilla con el extrusor.

Edificio de andamios
El enfoque más sencillo para fabricar andamios es depositar materiales capa por capa donde la dirección de impresión se cambia cada capa consecutiva, normalmente en un ángulo de 90o. Debido a las propiedades viscoelásticas e higroscópicas de los hidrogeles, la fidelidad de la forma de retención de las estructuras impresas sigue siendo un reto. El propósito principal de esta sección de protocolo es la impresión 3D de andamios de núcleo/concha perfundibles utilizando dos polímeros, que previamente han mostrado resultados prometedores para la construcción de andamios (ALG y CMC) con la adición de nanofibras de celulosa (NFC) para aumentar estabilidad mecánica. Tanto ALG como CMC son copolímeros lineales solubles en agua⁴⁸ y ambos contienen grupos de carboxilo, que pueden ser reticulados con la adición de cationes divalentes. Las partículas Ca²⁺ forman enlaces iónicos con dos grupos funcionales simultáneamente, formando conexiones entre cadenas de polímeros, aumentando la rigidez del gel.

Impresión de andamios perfundibles
El objetivo de este proceso es imprimir en 3D estructuras simples de andamios de pila de madera, que se extienden sobre varias capas y conservan su fidelidad de forma, así como la perperforibilidad hasta que se vuelven completamente reticuladas. Esto requiere incluso la coextrusión del núcleo y el vaciado sin movimientos cruzados o de retracción, que pueden interrumpir el flujo. Por lo tanto, los métodos típicos de modelado y corte CAD son menos adecuados. En este trabajo, se utiliza un código g diseñado manualmente, y se desarrolló un generador de código g basado en python para una rápida preparación del código g.

Los andamios fueron estructurados en forma de rejilla de madera y construidos sobre una superficie plana de vidrio. La fabricación se realizó capa por capa, depositando las líneas de cruce de cada capa siguiente en un ángulo de 90o a la anterior. Además, cada capa siguiente era un 2% más estrecha en las direcciones X e Y, lo que garantiza el soporte continuo de filamentos por capas anteriores. La distancia entre filamentos (tamaño de los macróporos) se puede diseñar con precisión en el código g teniendo en cuenta el diámetro exterior del filamento extruido (0,8 mm) y la distancia entre las líneas de rejilla (3 mm).

Se requería ncaffolding para cumplir los criterios clave de inclusión para su ulterior consideración. En primer lugar, se requerían andamios con al menos 4 capas de altura para conservar su integridad estructural y geometría (por ejemplo, tamaño de los macroporos) durante la impresión, para ser elegibles para un mayor desarrollo. En segundo lugar, los andamios debían permanecer perfundibles (microcanales estables) incluso después de ser incubados durante 7 días en medios de cultivo celular a 37 oC. En los intervalos de tiempo apropiados (1, 2, 5 y 7 días) se sacaron de los medios de cultivo y se probaron para ver si todavía eran perfundibles. En la Figura 4A, la sección transversal de un andamio recién impreso y post-procesado muestra un canal hueco claramente visible dentro del filamento. En la Figura 4B,está claro que incluso después de 72 h de incubación en medios de cultivo celular a 37 oC, el filamento retiene la estructura hueca a través de toda la longitud del andamio.

Varias formulaciones fueron imprimibles, permanecieron estructuralmente estables, conservaron la geometría impresa y permanecieron perfundibles; sin embargo, se eligió una sola para pruebas adicionales (es decir, 3 wt.% ALG + 3 wt.% CMC + 1.5 wt.% NFC), lo que permitió la impresión de andamios perfundibles con hasta 10 capas. El proceso de impresión con la boquilla personalizada se muestra en la Figura 5A. La impresión de núcleos/conchas era posible con formulaciones menos viscosas; sin embargo, los geles con concentraciones más altas no permitían un flujo continuo a través de la boquilla. Para la reticulación primaria (material central, entregado durante la impresión) se utilizaron 100 mM CaCl_2, que estabilizaron adecuadamente la formación continua de un filamento hueco, sin causar la solidificación del gel dentro de la boquilla. Después de la impresión, los andamios se empaparon en una solución de 5 wt.% CaCl₂ para cruzar completamente el hidrogel para una fidelidad de forma a largo plazo. En la Figura 5Bse muestra una muestra de andamio terminada. Durante la optimización, proceso de la formulación se utilizó un tinte artificial en la solución central, para permitir la evaluación visual y el examen de la calidad del filamento extruido. El tinte no se utilizó para la fabricación de los andamios finales, que se prepararon para la sembración celular y el cultivo.

Ensayo vivo/muerto
Después de la incubación, se utilizó un ensayo vivo/muerto para visualizar los CE y distinguir entre los células vivas (verdes) y las muertas (rojas) dentro del andamio incubado. Esto sirvió para dos propósitos principales: A) para determinar si los andamios proporcionan un entorno biocompatible para promover el crecimiento y la adhesión sin exhibir efectos nocivos en la célula, y B) para visualizar la integridad estructural de las estructuras tubulares y sus sistema de canales internos con más detalle.

Los resultados del ensayo vivo/muerto se muestran en la Figura 6. En presencia de esterasas intracelulares, la membrana plasmática permeable Calcein-AM se convierte en Calceina, emitiendo luz de fluorescencia verde en células vivas. Por otro lado, las células apoptóticas son visualizadas por membrana impermeable yoduro propidium, que fluoresce en rojo cuando se intercala n.o en la doble hélice del ADN. Se combinaron imágenes en vivo/muertas e imágenes de campo brillante de andamios para ayudar a visualizar las células dentro de los canales huecos. Se inyectó la solución de tinción y el ensayo se realizó directamente en los andamios impresos en 3D después de la incubación de células de andamios durante 48 horas.

Cabe señalar que se utilizó una densidad de semilla relativamente pequeña de los CE (340.000 células/ml), ya que este estudio sólo sirvió como prueba de concepto para la impresión de núcleos/cascos de andamios perfundibles. La conclusión más significativa del ensayo vivo/muerto es que incluso después de 48 h, no se observaron células muertas (rojas), lo que demuestra que ni el material del andamio en sí, ni sus productos de degradación presentaban efectos tóxicos. Además, los CE se adhirieron y permanecen unidos dentro de los andamios y parecían formar aglomerados distribuidos uniformemente cuando se cultivaban dentro de los canales. Esto sugiere que el método de fabricación descrito y la formulación del andamio proporcionan un marco adecuado para la construcción in vivo, relevante, morfologías de tejido tubular. Además de imitar las interacciones célula-ECM y la comunicación célula-célula apretada en las tres dimensiones espaciales, la ingeniería de tejidos complejos también requiere la exposición celular constante a un medio fresco para mantener su viabilidad. Esto a su vez se puede lograr mediante una densa red de canales bajo perfusión continua, lo que justifica una investigación adicional en futuros trabajos, y requerirá optimizar los parámetros de material y crecimiento para facilitar la ingeniería de tejidos a largo plazo de la vasculatura.

Figura 1: Prototipo de boquilla de núcleo/cáscara. (A) Se muestran el diseño general y los componentes principales del prototipo del cuerpo de la boquilla. La boquilla se completa insertando una aguja G27 de extremo contundente a través de la parte superior. Los porta agujas superior e inferior inmovilizan y realinean la aguja con el eje de la boquilla, asegurando que la punta se extienda desde la boquilla hasta el centro.  Para conectar la boquilla con material "shell" extruido de la jeringa secundaria, el tubo con un conector de bloqueo de luer se une a la entrada lateral. Desde aquí, el material se reenvía a la boquilla a través de un canal estrecho. La fabricación del canal mencionado requiere perforación en dos posiciones, produciendo agujeros que necesitan ser tapados después de la fabricación). (B) Se muestra un primer plano de la boquilla con una aguja G27 insertada, que se extiende fuera de la boquilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Configuración final del núcleo/shell. (A) Se muestra la boquilla de núcleo/cáscara completada con jeringas correctamente conectadas que contienen el hidrogel (derecha), la construcción de la "cáscara" y la solución de reticulación (izquierda) extruida como el "núcleo". (B) Se muestra la configuración del núcleo/casco instalado en el sistema Vitaprint con dos extrusoras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Código G del andamio tubular. Aquí se muestra una captura de pantalla del software de la impresora, específicamente la vista previa de la ruta (A) y el código g sin procesar de la primera capa (B). El código g es un conjunto de instrucciones con coordenadas de destino en direcciones espaciales absolutas (X, Y, Z), así como extrusión (A,B) en direcciones relativas. El comando G determina el tipo de instrucción, mientras que G1 representa el movimiento lineal hacia las coordenadas de destino y G92 determina la posición inicial. Además, la velocidad de avance de los siguientes comandos se determina con la instrucción F en mm/min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Sección transversal de un andamio con un interior hueco. (A) Se muestra el corte transversal del andamio recién impreso y post-procesado. (B) Se muestra la porción transversal del andamio después de ser incubado en medios de cultivo celular durante 72 h. Mientras que la forma de la boquilla define la extrusión de un tubo con una sección transversal redonda, el filamento parece estar algo aplanado en la deposición. El canal interno, sin embargo, permanece intacto y conserva su forma durante la incubación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Impresión de núcleo/concha de andamios. Aquí, se muestra la fabricación (A) de un andamio de tubo hueco de tres capas y su forma final (B). Para mejorar la visualización, la solución de reticulación en el núcleo se tiñó con un tinte rojo. La formulación presenta suficiente estabilidad mecánica para retener la estabilidad del andamio, incluso si se fabrican estructuras más gruesas (hasta 10 capas, datos no mostrados). Las dimensiones exteriores de la estructura final fueron de aproximadamente 27 mm x 27 mm x 3,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Ensayo vivo/muerto realizado directamente en los andamios. Se inyectó una suspensión de los HUVEC en el canal del andamio interno, se incubaba durante 48 horas y se trataba con un tinte vivo/muerto. Los HUVEC viables emiten luz de fluorescencia verde, que se representa en los puntos brillantes de la imagen. Las células muertas emiten luz de fluorescencia verde; sin embargo, ninguno es visible en el andamio observado. La distribución de las celdas también significa la forma y las capacidades de perfusión retenidas de los canales. En menor medida, la solución de ensayo vivo/muerto también tiñó el material de andamios, produciendo fluorescencia ligera bajo el microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diseño de boquillas
Utilizando la boquilla de núcleo/cáscara desarrollada, integrada en un sistema Vitaprint de dos extrusoras, se fabricaron tubulares huecos en un proceso de un solo paso. Para lograr un espesor uniforme de la pared del tubo a través de la mayoría de los andamios preparados, la aguja debe colocarse centralmente en el eje del anillo de extrusión exterior. Las agujas de calibre estándar a menudo exhiben una excentricidad leve, pero significativa fuera del eje. Por lo tanto, el cuerpo de la boquilla fue diseñado para sostener la aguja en dos lugares, una vez en la parte superior (fijando el cubo) y una vez antes del núcleo final / cámara de la cáscara (fijando la cánula en sí), corrigiendo su alineación axial. La precisión de la alineación axial aumenta con la distancia entre el punto de fijación. Sin embargo, existe un equilibrio entre la longitud de la aguja y el volumen de la cámara de la boquilla disponible. Para mejorar aún más la funcionalidad de la configuración, se pueden implementar ciertas modificaciones de la boquilla: A) un soporte de boquilla con estabilidad mejorada, B) boquillas adicionales para una gama más amplia de compatibilidad de agujas, C) un mecanismo de ajuste preciso para la aguja a posicionamiento de la boquilla y D) integrando entradas adicionales y dispositivos microfluídicos para la preparación de materiales sobre la marcha.

Optimización de Hidrogel
Para determinar la relación óptima DE ALG:CMC, se evaluaron varias iteraciones de material. Generalmente, la impresión de núcleo/cáscara con concentraciones superiores al 3% de ambos componentes se hizo imposible, porque no permitía un flujo continuo de hidrogel o daba lugar a la obstrucción de la boquilla. Específicamente, la concentración de ALG por encima del 3 wt.% aumentó la viscosidad excesivamente y dio lugar a obstrucciones de boquillas, mientras que las concentraciones más bajas de ALG y mayores concentraciones de CMC (>3 wt.%) ralentizaron los tiempos de reticulación y, por lo tanto, no proporcionaron suficientes soporte estructural del andamio. La impresión de núcleos/conchas era posible con formulaciones menos viscosas; sin embargo, la viscosidad del gel extruido debe ser suficiente para mantener la fidelidad de la forma a largo plazo. Al final, se demostró que una relación ALG:CMC de 1:1 era la opción más adecuada, lo que confirma un estudio previo de Maver et al.⁴⁹. La adición de NFC mejoró significativamente la imprimibilidad y la rigidez estructural de los andamios impresos de núcleo/casco, pero no tuvo ningún efecto significativo en las propiedades de reticulación del material.

Las aplicaciones personalizadas, optimizadas para tipos de celdas específicos y configuraciones experimentales, requerirán materiales de andamios bien adaptados, que variarán en la composición y los mecanismos de reticulación. El método descrito en este trabajo se basa en una solución de polímero mixto de alginato-celulosa, que se recruza ionicamente utilizando iones Ca^2+. El alginato en sí es un polímero lineal de bloques de (1,4) residuos de -d-mannuronato (M) y -l-guluronato (G) que pueden ser reticulados de forma reversible ionínicamente mediante la aplicación de Ca²⁺ y otros cationes divalentes como Sr²⁺, Br²⁺, Mg ²⁺. Sin embargo, el ion más utilizado para la reticulación de alginato sigue siendo Ca²⁺ en forma de CaCl₂. Ca²⁺ también se puede utilizar en forma de CaSO₄ o CaCO₃; sin embargo, la baja solubilidad de CaSO₄ en relación con CaCl₂ significa una gelación más lenta. CaCO₃ produce tiempos de gelificación aún más lentos que pueden resultar en propiedades mecánicas débiles e inconsistentes.

Los tiempos de gelitación más largos suelen producir una construcción más homogénea, sin embargo, ciertas aplicaciones, como la impresión de núcleos/cáscaras, requieren tasas de gelidación rápidas⁵⁰. Mg²⁺ iones también inducen gelación; sin embargo, su eficiencia de reticulación es aproximadamente 5x-10x menor, en comparación con Ca^2+,con tiempos de reticulación de 2-3 h. Además, los iones de magnesio son más selectivos hacia las unidades gulurónicas, por lo tanto, la reticulación depende más de la composición química del ALG^51. En este caso, una tasa de gelación rápida es esencial para asegurar la formación continua del canal hueco antes de que la estructura hueca pueda colapsar. CaCl₂ produce la tasa de gelización más rápida, que es crucial para la deposición directa de filamentos huecos. Se utilizaron 100 mM CaCl_2, que estabilizaron adecuadamente la formación continua de un filamento hueco sin causar solidificación del gel dentro de la boquilla.

Impresión y postprocesamiento de andamios
Durante esta parte del proceso se deben considerar los siguientes pasos, incluyendo 1) asegurando que todas las soluciones y materiales, incluida la bioimpresora 3D, estén debidamente esterilizados antes de imprimir. 2) Al preparar el hidrogel, la homogeneidad del material es crucial para la impresión continua. Se debe evitar la introducción de impurezas o burbujas de aire, ya que pueden obstruir la boquilla y/o interrumpir la extrusión. 3) Las jeringas deben estar correctamente conectadas a la boquilla del núcleo/cáscara a través del mecanismo de bloqueo de luer y se deben insertar correctamente en los soportes del extrusor como se ve en la Figura 2A,B. 4) Antes de imprimir una estructura compleja, se recomienda extruir previamente una pequeña porción del gel y la solución de reticulación para eliminar el exceso de burbujas de aire en la boquilla del núcleo/cáscara y asegurar un flujo continuo de hidrogel. Esto se puede incorporar directamente en el código g para mejorar la repetibilidad. 5) Es útil añadir una falda que rodea el andamio para asegurar la colocación de un filamento hueco homogéneo antes de que comience la impresión del andamio.

Además, 6) para mejorar la adherencia entre el filamento de impresión y el sustrato, se recomienda utilizar una superficie plana con buena adherencia (es decir, un portaobjetos de vidrio o una placa Petri). 7) La boquilla de extrusión no debe estar en contacto directo con el sustrato para permitir un flujo ininterrumpido del hidrogel. La distancia inicial afectará fuertemente a la calidad de la impresión, pero el grosor del filamento extruido es una buena aproximación del ajuste inicial. 8) La altura de impresión inicial en el código g debe ajustarse de acuerdo con las necesidades individuales. Una vez optimizados los parámetros de impresión, el código g de andamios debe importarse al software Planet CNC y el proceso de impresión se inicia como se describe en el protocolo. 9) Para controlar y optimizar el flujo de hidrogel con la intención de imprimir andamios óptimos, tanto la composición de la formulación como los parámetros de impresión deben ser variados (es decir, la velocidad de impresión, la presión de extrusión, la temperatura de impresión, la distancia entre el sustrato y la extrusión, altura de la capa, tamaño del andamio, etc.).

En general, se requieren caudales más altos para imprimir formulaciones con mayor viscosidad. Como se mencionó, todas las formulaciones de hidrogel, que son adecuadas para la reticulación química inmediata, permiten la fabricación de tubos huecos en un solo paso y se pueden utilizar con la configuración de núcleo/cáscara descrita. Los mecanismos de impresión y reticulación deben optimizarse en consecuencia. Después de la impresión, todos los andamios fueron post-procesados por reticulación secundaria con 5 wt.% CaCl₂ solución, que aseguró la reticulación completa del componente ALG-CMC y esterilizado desde ambos lados bajo una luz UV durante al menos 30 min. Debe garantizarse que envuelva completamente el andamio con la solución de reticulación e incubar durante el tiempo suficiente para completar el proceso de reticulación. El postprocesamiento variará en función del material y del mecanismo de reticulación utilizado, que debe considerarse previamente. Después del post-procesamiento, los andamios deben ser retirados cuidadosamente del sustrato, transferidos a medios de cultivo celular, e incubados en una atmósfera controlada durante al menos 24 h antes de la sembración celular. El uso de un medio incoloro mejorará la visibilidad de la suspensión celular durante la inyección en los andamios.

Ensayo vivo/muerto
La solución viva/muerta debe prepararse directamente antes de realizar el ensayo y mantenerse en la oscuridad antes de realizar el ensayo, ya que contiene tintes de fluorescencia que son propensos al blanqueo. Después del tiempo de incubación deseado, los medios de cultivo celular deben desecharse cuidadosamente alrededor de los andamios y enjuagarse con PBS. Idealmente, se debe utilizar el mismo punto de entrada para la sembración celular seguido del ensayo vivo/muerto que se inyecta en los andamios.

Importancia de los resultados
Tanto ALG como CMC ya se han utilizado para promover la angiogénesis in vitro. Basado en sus características ECM-miméticas, reticulación física y biocompatibilidad, ALG se ha empleado comúnmente como un componente para la entrega y liberación controlada de factores de crecimiento angiogénicos (por ejemplo, bFGF, HGF, VEGF164, y Ang-1*respectivamente)^{52 ,53,54}. Además, en combinación con gelatina, CMC también se ha utilizado para encapsular células endoteliales vasculares debido a sus capacidades de reticulación rápida en condiciones fisiológicas⁵⁵. Se añadieron NFC para aumentar aún más la estabilidad mecánica y la fidelidad de la forma de los andamios. Cabe destacar que el objetivo no era mejorar la vascularización, sino demostrar la posibilidad de producir andamios ALG-CMC huecos y perfundibles, impresos en forma de núcleo/concha, lo que también facilita el apego y la proliferación de HUVECs. La elección de utilizar una mezcla ALG-CMC se basó en hallazgos de materiales base de uso común, de fácil acceso y biocompatibles que podrían permitir la impresión de núcleos/cascos de canales huecos. Muchos otros materiales pueden ser opciones más viables para mejorar la angiogénesis; sin embargo, algunos no son adecuados para la impresión de núcleos/cascos, ya que no facilitan la gelión rápida/reticulación cruzada, lo cual es crucial en este enfoque.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los autores desean reconocer el apoyo financiero a este proyecto recibido de la Agencia Eslovena de Investigación (números de subvención: P3-0036 e I0-0029), y del Ministerio de Ciencia, Educación y Deporte (número de subvención: 5442-1/2018/59).