Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones

Hipofunción de la glándula salival es una consecuencia frecuente de la terapia de radiación y enfermedad autoinmune. Evaluación reproducible de la función de la glándula salival en modelos de ratón de estas enfermedades es un desafío técnico. Aquí, se describe un método simple de medida preciso y reproducible de la producción de saliva de ratones.

Pacientes con síndrome de Sjögren, una enfermedad autoinmune que afecta las glándulas exocrinas, desarrollan inflamación de la glándula salival y han reducido la producción de saliva. Del mismo modo, la producción de saliva está comprometida seriamente en pacientes que reciben radioterapia para cánceres de cabeza y cuello. Modelos de roedores, desarrollados para imitar estas condiciones clínicas, facilitan la comprensión de la patogénesis de la enfermedad y permitan el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Por lo tanto, la capacidad precisa, reproducible y varias ocasiones medir la función de la glándula salival en modelos animales es fundamental. Basándose en procedimientos previamente descritos en la literatura, que cumple estos criterios y se utilizó para evaluar la función de la glándula salival en ratones se desarrolló un método. Una ventaja adicional de este nuevo método es que se domina fácilmente y tiene poca variación inter-operador. Función de la glándula salival se evalúa como la cantidad (peso o volumen) o (mL/min) de la saliva producida en respuesta a la estimulación de la pilocarpina. La recogida de la saliva es una buena fuente para el análisis de contenido de proteína, las concentraciones de inmunoglobulinas y otras biomoléculas.

Las glándulas salivales producen la saliva en respuesta a una variedad de estímulos neurológicos y mecánicos¹. Los estímulos son llevados a través del sistema nervioso simpático y parasimpático a los receptores adrenérgicos y colinérgicos en la glándula. La pilocarpina es un agente colinérgico, párr simpaticomimético que actúa predominantemente sobre los receptores muscarínicos. En las glándulas salivales, induce la producción de saliva actuando sobre el receptor muscarínico M3¹. La producción de saliva tras la administración de pilocarpina es un indicador de la capacidad de responder a la estimulación de las glándulas salivales y es comúnmente usada como una medida de la función de la glándula salival.

Medición precisa de la producción de saliva es importante en el estudio de enfermedades de las glándulas salivales como síndrome de Sjögren² y lesión por radiación después de tratamiento de cáncer de cabeza y cuello³. Varios métodos se han desarrollado para medir la producción de saliva de roedores. Estos incluyen directa canulación del conducto excretor salival⁴, colección de saliva desde la cavidad bucal bajo vacío⁵y colección mediante tubos capilares de cristal⁶ o una micropipeta^{7,8, 9}. dirigir la canulación del conducto salival proporciona la más precisa y pura saliva. Sin embargo, este es un procedimiento técnicamente difícil, y el potencial para causar lesión ductal excluye colecciones repetitivas saliva del mismo animal. Recogida de saliva bajo vacío puede llevar a resultados variables debido a la sequedad de la saliva del tubo. Esta pérdida es aún más exagerada en ratones con disminución de la salivación. Capillares de vidrio permiten la recogida de saliva para análisis posteriores, sin embargo, cambios en la viscosidad de la saliva secretada en el estado enfermo impide eficiente llenado del tubo capilar. Además, intenta barrer la cavidad bucal para recoger saliva residual puede provocar lesiones. El método de pipeta permite la colección completa, y para el mismo operador, es notablemente consistente entre experimentos. Sin embargo, por razones desconocidas, este método muestra una variación significativa entre los diferentes operadores. Por lo tanto, para permitir comparaciones apropiadas, resulta imprescindible que el operador mismo realiza todos los experimentos relacionados con un proyecto específico. Claramente, esto representa una gran desventaja para un laboratorio.

Para superar estos problemas, se desarrolló un procedimiento que combina métodos de recolección de saliva se utilizan para los seres humanos y roedores. El método del hisopo, que se describe a continuación para medir el volumen de saliva inducida por la pilocarpina es simple, reproducible, no influenciado por el operador y puede realizarse varias veces en el mismo animal. Además, permite recoger la saliva para el posterior análisis de las proteínas, inmunoglobulinas o de otras biomoléculas.

El protocolo que se describe a continuación fue aprobado por el cuidado institucional de Animal y uso y sigue las normas éticas establecidas por los institutos nacionales de salud. Todos los datos presentados en este informe se generaron mediante el uso de ratones femeninos que fueron 10-12 semanas de edad. Se utilizaron las siguientes cepas de ratones: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S y F1 (B6XA/J). Todos los ratones fueron alojados en jaulas de barrera (a 5 animales por jaula) en condiciones libres de patógenos específicas y proporciona alimento y agua ad libitum.

1. preparación

1. Para preparar una solución de clorhidrato de pilocarpina, pesan 10 mg de compuesto y disolver en 1,776 mL de solución salina isotónica estéril con un vórtex, para dar una solución stock de 5,63 mg/mL. No hay necesidad de esterilizar esta solución. Pero si lo desea, filtrarla por un filtro de 0.2 μm. Almacenar esta solución en múltiples alícuotas en un congelador de-80 ^oC hasta por 3 meses. Cada helado es de un solo uso. Una vez descongelado, no vuelva a congelar la solución de pilocarpina.
2. Tomar 0,6 mL de los tubos del microfuge y cuidadosamente perforar un pequeño agujero en la parte inferior de cada tubo con una aguja de calibre 18 climatizada. Coloque estos tubos en tubos de 2 mL. Los tubos no necesitan ser estériles.
3. Usando una hoja de afeitar afilada, estéril, cortar esponjas absorbentes cilíndricos en trozos de unos 2 cm de longitud. Cortar cada 2 cm diagonal para dar 2 torundas de forma cónicas. Coloque una torunda en cada uno de los tubos de microcentrífuga de 0.6 mL.
4. Pesar el tubo de microcentrífuga de 0.6 mL que contiene el hisopo seco.
5. La transferencia de los ratones que se estudiarán en una nueva jaula limpia con botellas de agua. Mantener los ratones sin alimentos durante al menos 2 h antes del inicio de la colección de saliva para evitar que las partículas de alimentos contaminen la saliva recogida.
   Nota: No es necesario tener 1 ratón por jaula para este procedimiento. Sin embargo, el número de ratones en cada jaula depende de reglas específicas de la institución y de uso animal.
6. Justo antes del final de 2 h, preparar la solución de pilocarpina de trabajo (0,0563 mg/mL) diluyendo la solución madre 100 x en solución salina estéril. No es necesario más filtro esterilizar esta solución. Mantenga siempre la solución de trabajo de la pilocarpina en el hielo.
   Nota: La tabla 1 muestra la cantidad de pilocarpina que se inyecta para un rango de peso corporal de ratón para darle una última dosis de 0,375 mg/kg peso corporal.

2. procedimiento

1. Peso de cada ratón y determinar la dosis de la mezcla anestésica para cada ratón utilizando la tabla 1. Inyectar el primer ratón con el volumen adecuado de la mezcla anestésica por vía intraperitoneal. Ajuste el temporizador durante 2 min (mayoría de las cepas de ratón en este protocolo de ir a dormir por 2 min). Asegúrese de que el ratón correctamente está anestesiado por la falta de caminar cuando se coloca sobre una superficie plana. Si el ratón está caminando todavía, espere 2 minutos adicionales antes de proceder al siguiente paso. Aplique una gota de lubricante pomada oftálmica en ambos ojos para evitar que se sequen.
   Nota: En la tabla 1, la dosis de la mezcla anestésica es 0,007 mL/g de peso corporal. El rango óptimo para este procedimiento es 0.006 a 0.008 mL/g de peso corporal. Sin embargo, después de 4 minutos, si el ratón está todavía caminando o exhibir movimientos espasmódicos, consultar con el veterinario institucional para aumentar adecuadamente la dosis del anestésico.
2. Determinar la dosis de pilocarpina para el ratón utilizando la tabla 1 e inyecte la cantidad apropiada por vía intraperitoneal. Ajustar el temporizador de 2 minutos y colocar el ratón en el tubo de limitador de 50 mL hasta que la cabeza y las orejas sobresalen el extremo cortado. Coloque el tubo en un ángulo de 45 grados, con la cabeza hacia abajo y la superficie ventral hacia arriba. Con cinta adhesiva el tubo a la Junta Directiva de procedimiento para guardarlo de la mudanza.
   Nota: Tabla 1 proporciona dosis de ratones más de 17 g, como este procedimiento no se ha intentado en ratones debajo de 17 g de peso.
3. Al final de 2 minutos, suavemente inserte un par cerrado de micro fórceps de disección en la boca y levante la mandíbula inferior hacia arriba para abrir la boca. Empujar la pinza 1-2 mm más en la boca, asegurándose de que la lengua se ve apoyada en el brazo superior de las pinzas. Con otro par de Pinzas finas, mantener el hisopo seco previamente pesado cerca de su extremo cónico.
4. Deslice suavemente el extremo cónico de la esponja en la boca. Retirar las pinzas dejando la punta de la torunda en la cavidad bucal.
5. Sujete el extremo más ancho de la torunda que se extiende fuera de la boca y girar para permitir que la superficie máxima de contacto con la boca. Mantener el hisopo en esta posición durante 15 minutos.
   Nota: Esto asegura que el hisopo permanezca en la boca para la duración de la colección. Tenga en cuenta que el extremo cónico de la torunda actúa como una mecha y la parte más ancha de la esponja permanece fuera de la boca.
6. Al final de 15 minutos, suavemente gire el hisopo para recoger cualquier saliva que no ha sido absorbida y colocar el hisopo mojado en el tubo de microcentrífuga de 0.6 mL. Cierre el tubo y colóquelo en el tubo de 2 mL a hielo.
   Nota: En este momento, la mucosa oral aparece completamente seca. El ratón puede ahora mover hacia atrás en su jaula para la recuperación de la anestesia.
7. Transferir el ratón en la jaula. Coloque bolitas de alimento húmedo en la jaula después de la recolección de saliva para ayudar a la rehidratación más rápida.
   Nota: Los ratones se despiertan dentro de 10 minutos después del final de la colección. Inyección subcutánea de solución salina isotónica con 0.2 mL se puede administrar también para acelerar la recuperación.
8. Proceder al próximo ratón. Todos los ratones deben ser vigilados hasta que han recuperado completamente y son ambulatorios.

3. las mediciones

1. Al final de todas las colecciones, pesar los tubos 0.6 mL con el hisopo mojado. Calcular la diferencia entre el peso húmedo y peso seco para obtener el peso de saliva producida. Coloque el tubo de 0.6 mL con saliva en el tubo de 2 mL.
2. Cortar las tapas de los tubos de 2 ml. Luego, centrifugar los tubos de 2 mL por 2 min a x 7500 g, a 4oC en una micro centrífuga para recuperar la saliva. Medir el volumen de saliva obtenido usando una micropipeta.
3. Los resultados se expresarán como saliva peso (mg)¹⁰ sobre 15 minutos o como una relación de peso de saliva (mg) / peso (g) del ratón.
   Nota: Si se ha medido el volumen de saliva extraída de la torunda, expresar los resultados como el volumen de saliva recuperado (mL) o el cociente del volumen de saliva (mL) peso (g) de ratón.

En los sistemas de modelo experimental de ratón, la capacidad de producir saliva en respuesta a la estimulación de la pilocarpina se utiliza como un indicador de la función de la glándula salival. La producción de saliva se midió en ratones hembra de 11 semanas de edad C57BL/6 por el método de esponja. En la figura 1A, los resultados se expresan como la cantidad de saliva (mg) recogido después de cada vez mayor dosis de pilocarpina. A la dosis de 1 mg/kg de peso corporal, algunos de los ratones comenzaron exponiendo la angustia (temblores involuntarios y temblando). Por lo tanto, dosis más altas de pilocarpina, más allá de 1 mg/kg de peso corporal no fueron probadas en este estudio. En la figura 1B, los resultados se representan como el cociente del peso de la saliva (mg) para el peso del ratón (g). Colectivamente, estos datos muestran una relación de buena dosis respuesta entre la producción de saliva y la cantidad de pilocarpina. También se midió el volumen de saliva que se recuperó de la torunda. Como se muestra en la figura 1, existe una concordancia significativa entre saliva peso y volumen que 1 mg de saliva es igual a 0,001 mL.

Los resultados obtenidos con el método del hisopo son similares a los obtenidos con el método de recogida de pipetas. Figura 2A muestra que la cantidad media de saliva recogida por el método de la esponja y el método de la pipeta es muy similar y las diferencias son estadísticamente no significativas. Figura 2B 2C y 2D muestran que el método del hisopo no afectan el cálculo de biomoléculas en la saliva. De hecho, en comparación con el método de la pipeta, el método del hisopo mostró una tendencia general mayor en los niveles medios de proteína salival total (figura 2), actividad de la lisozima salivar (Figura 2D) y IgA salival (Figura 2E). Sin embargo, estas diferencias fueron estadísticamente no significativas.

El método de colección de saliva descrito aquí es capaz de detectar diferencias en la cantidad de saliva producida por las cepas de ratón diferente (figura 3) y la hipofunción de la glándula salival inducida por condiciones de enfermedad diferentes (figura 4). Figura 3A muestra resultados de pilocarpina inducida por la producción de saliva de ratones femeninos C57BL/6 y BALB/c, DBA1/J, 129S6 de 10-12 semanas de edad. Los ratones de 129S6 produjeron la menor cantidad de saliva frente a las otras cepas. Cabe señalar que las diferencias en el peso corporal de estos ratones no fueron significativamente diferentes (figura 3B). A continuación, se utilizó el método de esponja para detectar hipofunción de la glándula salival, y se muestran dos ejemplos en la figura 4. Figura 4A muestra un resultado representativo de hipofunción de glándulas salivales inducido por la activación de la inmunidad innata, después de la inyección de lipopolisacáridos (LPS) (10 μg/ratón, intraperitoneal). Control de ratones fueron inyectados con solución salina¹¹. Los ratones tratados con LPS muestran una caída significativa en la saliva, en comparación con controles. Transferencia pasiva de anticuerpos reactivos con el antígeno del síndrome de Sjögren A Ro52 induce la hipofunción de la glándula salival y este modelo imita ciertos aspectos del síndrome de Sjögren⁹. Como se muestra en la Figura 4B, ratones inyectaron con alumbre adyuvante más anticuerpos anti Ro52 juntos tuvieron menor producción de saliva, en comparación con los ratones no tratados o ratones trataron sólo con alumbre.

El método de esponja es fácil de implementar y operador independiente. La figura 5 muestra la producción de saliva de ratones femeninos C57BL/6 10-13 semanas de edad, en experimentos llevados a cabo en 6 momentos diferentes por 2 operadores diferentes. Operador empecé con sólo 2 meses de ratón manejo experiencia operador II tenía 6 meses de ratón previo manejo de experiencia, pero fue introducido solamente en el método de recogida de saliva para una semana. Estos datos fueron generados en experimentos que llevó a cabo casi un año, utilizando dosis de pilocarpina de 0,375 mg/kg. Las proporciones de saliva obtenidas por ambos operadores muestran una gama de lecturas (1.84 a 5.87). Operador experimentos abarcó un período de 10 semanas mientras que los experimentos de operador II se llevaron a cabo durante 3 días consecutivos, casi un año más tarde (figura 5A). En particular, las proporciones de saliva obtenidas con el tiempo no fueron significativamente diferentes (p = 0,064; Prueba de Kruskal-Wallis). Además comparar las variaciones inter-operador, los cocientes del peso de saliva por g de peso corporal de 3 experimentos para cada operador se agruparon y se muestran en la figura 5B. Proporciones de saliva obtenida por operador I (media + SEM; 4,45 + 0.152, n = 38) no son significativamente diferentes del operador 2 (media + SEM; 4.21 + 0.169; n = 25; p = 0.296 por prueba de Mann Whitney).

Figura 1: producción de Saliva es dependiente de la dosis de pilocarpina. Se inyectaron ratones C57BL6/J (hembras de 11 semanas de edad, 5 por grupo) con diferentes dosis de pilocarpina (0,25 mg/kg, 0.5 mg/kg y 1.0 mg/kg de peso corporal) y se midió la producción de saliva durante 15 minutos (A) resultados se representan como la cantidad de saliva de mg (media ± SEM). (B) los datos son representados como cociente medio de la saliva (saliva mg por peso corporal del ratón g). (C) Saliva de ratones C57BL/6 femeninos 11 semanas de edad (n = 5) fue recogida por el método de esponja. Pilocarpina se utiliza en una dosis de 0,375 mg/kg de peso corporal. Los hisopos húmedos se pesaron para medir la cantidad de saliva producida en mg. La saliva en los hisopos de entonces se recuperó por centrifugación y se midieron los volúmenes de la saliva recuperado. El acuerdo es visto entre el peso de la saliva en mg y saliva volumen en μl. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: el método del hisopo no afecta el análisis de biomoléculas en saliva. Saliva de 2 grupos de ratones C57BL/6 mujeres 11 semanas de edad (n = 5 ratones por grupo), fue colectado por el método de esponja o por el método de la micropipeta. Las diferencias en los volúmenes promedios de saliva (A), significa las cantidades de proteína (B), significan la cantidad de actividad de la lisozima (C) y significan cantidades de IgA entre los 2 grupos son estadísticamente no significativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: el método de hisopo de colección de saliva detecta diferencias en la producción de saliva de línea de base por diferentes cepas de ratones. (A) se recolectaron Saliva de ratones femeninos (10-12 semana de edad) durante 15 min mediante el uso de una dosis de pilocarpina de 0,375 mg/kg de peso corporal. (B) el peso corporal promedio entre los grupos de ratones no fueron significativamente diferente. Se analizó la significación estadística de Kruskal-Wallis test, seguido de Dunn del test de comparaciones múltiples. P < 0.05 se consideró significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: método del hisopo detecta la hipofunción salival. (A) (B6 X A / J) F1 hembra ratones fueron inyectados con cualquier solución de LPS (0,1 mg/mL, 0.1 mL por ratón, intraperitoneal) o solución salina y la saliva se midió 26 h más tarde. Un experimento representativo muestra un significativo (p = 0.0079) baja (60%) en la producción de saliva en los ratones tratados con LPS. (B) hipofunción de la glándula salival se midió en un sistema de modelo experimental de ratón de síndrome de Sjögren. El modelo de transferencia pasiva previamente publicados para la inducción de disfunción glandular fue usado⁴ con pocas modificaciones. Mujer ratones C57BL/6 (10-12 semanas) se inyectaron con coadyuvante de alumbre. En los días 14 y 20 ratones fueron inyectados con 0,05 mL de suero de conejo anti Ro52 y la producción de saliva se midió después de 24 h. nota un significativo (p = 0,0003) baja (50%) en la producción de saliva en los ratones tratados con alumbre y anti Ro52 suero. Se analizó la significación estadística de Kruskal-Wallis test, seguido de Dunn del test de comparaciones múltiples. P < 0.05 se consideró significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: el método del hisopo obtienen resultados reproducibles en el tiempo (A) y entre operadores (B). El método de esponja muestra resultados comparables entre dos operadores con diferentes longitudes de ratón manejo experiencia en experimentos realizados durante un año. La producción de saliva basal en ratones hembra C57BL/6 (10-13 semanas de edad) fue medida por cada operador. Resultados se expresan como peso de saliva producido (mg/g de peso corporal). Las fechas de colección de la saliva están en el eje x y se muestran los resultados de los datos recogidos con el tiempo (A). Cada punto de datos representa un ratón, y el número de ratones analizados en cada momento se muestra entre paréntesis. Referencia saliva ratios (media + SEM) de 3 experimentos aparecen (B)y no son significativamente diferentes entre los operadores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La producción de saliva es un proceso complejo y está influenciada por muchos factores. Por lo tanto, la función de la glándula salival en animales de laboratorio de medición puede ser un desafío. Un desafío adicional es que mediciones repetidas de la función de la glándula salival en el mismo animal son necesarias para establecer el inicio de la enfermedad o para demostrar la recuperación después del tratamiento.

El método de hisopo que se describe en este informe es técnicamente fácil de realizar con múltiples opciones para representar los datos. Los resultados son reproducibles, con poca variación inter-operador. El método puede detectar una reducción en la producción de saliva en diferentes modelos de disfunción de las glándulas salivales. Una ventaja importante es el uso de polímeros altamente absorbentes, inertes y recuperación eficiente de la saliva recogida, permitiendo medir de biomoléculas salival. Otra ventaja de este método es que es posible llevar a cabo este procedimiento simultáneamente en hasta 2 ratones a la vez por un solo operador. Esto es significativamente más eficiente que algunos de los otros métodos, donde se realiza en un solo ratón a la vez.

La variabilidad en las mediciones de producción de saliva ha sido la pesadilla de todas las técnicas de medición saliva. Para minimizar la variabilidad, es importante seguir estrictamente el protocolo. Pasos críticos incluyen: seleccionar el mismo tiempo del día para los ratones de ayuno y la recogida de saliva, apropiada dosificación de anestésico, pilocarpina (tabla 1) y registros de peso exacto de torundas secas y húmedas. Gestión del cuidado del tiempo es necesaria para establecer hasta 2 ratones a la vez para la colección de saliva.

Como se muestra en la figura 3, la cantidad de saliva producida por los ratones es dependiente de la cepa. Apropiado así, cepa, edad y sexo ratones emparejados deben usarse como controles. Titulación de la dosis de pilocarpina, para la cepa específica y la condición experimental investigado, es muy recomendable. Aunque una dosis mayor de pilocarpina más allá de 0.5 mg/kg induce aumento de la producción de saliva, para evaluar la hipofunción glandular, se recomienda utilizar una dosis más baja. Esto permite la identificación de aún pequeñas diferencias en la producción de saliva entre el enfermo y el control de ratones. Dosis de 0.5 mg/kg de peso corporal y 0,375 mg/kg de peso corporal han sido utilizados exitosamente para demostrar la hipofunción de la glándula salival. Sin embargo, debe señalarse que ciertos sistemas de modelo experimental pueden requerir períodos más cortos o más largos de la colección que se describe en este protocolo. Esto debe ser probado por cada laboratorio.

Una limitación de este método y más técnicas de medición de la saliva es la necesidad de anestesia. El informe con el método vacío no incluye el uso de anestésico⁵. Sin embargo, la ausencia de anestesia induce niveles variables de ansiedad en los ratones. Tienden a luchar y morder el tubo, y que a su vez, puede influir en eficiencia de producción y colección de saliva. Anestesia isoflurano en ratas induce una gota pilocarpina inducida por saliva producción¹². En contraste, la ketamina aumenta las secreciones bronquiales y salivales a través de la estimulación simpática¹³. Nosotros y otros han utilizado con éxito la ketamina y xilacina mezcla como un anestésico para la medición de pilocarpina indujo saliva producción^4,7,8,9. El intervalo recomendado para la anestesia quirúrgica es 100-200 mg/kg de ketamina y 5-16 mg/kg de xilacina¹⁴. La dosis de 0.008 0.006 mL/g de peso utilizado en este método (corresponde a 60-80 mg/kg de ketamina y de 6-8 mg/kg de xilacina) cae en el extremo inferior de la gama recomendada y es suficiente para proporcionar un nivel consistente de inmovilización sin anestesia profunda .

El método del hisopo se estableció como una alternativa al método habitualmente utilizado micropipeta. La desventaja principal del método de la pipeta fue la alta variabilidad entre operador y la necesidad de recoger saliva de un ratón a la vez. El método del hisopo aborda ambos problemas. Los beneficios incluyen limitar el número de animales necesario para alcanzar el poder en los análisis estadísticos y aumento de la eficiencia. Reemplazando los bastoncillos de algodón con hisopos de polímero inerte ofrecen una mejor opción puesto que hisopos de algodón son conocidos por afectar la cuantificación de moléculas biológicamente activas¹⁵.

Dada la sencillez del método de hisopo y su alta reproducibilidad entre diferentes individuos, es de esperar que el método del hisopo facilitará mejores comparaciones de los modelos de ratón entre investigadores en diversos laboratorios e instituciones.

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

El estudio fue apoyado por una subvención de los institutos nacionales de salud, Instituto Nacional de Dental e investigación craneofacial (DE025030).