Análisis de ¹⁸FDG PET/CT la proyección de imagen como una herramienta para estudiar la tuberculosis del Mycobacterium infección y tratamiento en Primates no humanos

Aquí, presentamos un protocolo para describir el análisis de la proyección de imagen de ¹⁸F-FDG PET/CT en primates no humanos que han sido infectadas con M. tuberculosis para estudiar el proceso de la enfermedad, tratamiento farmacológico y la reactivación de la enfermedad.

Mycobacterium tuberculosis sigue siendo el principal agente infeccioso en el mundo hoy. Con la aparición de cepas resistentes a los antibióticos, se necesitan nuevos métodos clínicamente relevantes que evalúan el proceso de la enfermedad y la pantalla para potenciales tratamientos antibiótico y vacuna. Tomografía computarizada/tomografía por emisión de positrones (PET/CT) se ha establecido como una valiosa herramienta para el estudio de una serie de afecciones como el cáncer, la enfermedad de Alzheimer y la inflamación, infección. Aquí figuran una serie de estrategias que han sido empleados para evaluar imágenes de PET/CT en Macacos cangrejeros que infectan intrabronchially con dosis bajas de M. tuberculosis. A través de la evaluación del tamaño de la lesión en la TC y la absorción de ¹⁸F-fluorodeoxyglucose (FDG) en las lesiones y ganglios linfáticos en imágenes PET, estos métodos descritos muestran que la proyección de imagen PET/CT puede predecir el desarrollo futuro del activo versus enfermedad latente y la propensión a la reactivación del estado latente de la infección. Además, analizando el nivel general de inflamación del pulmón, estos métodos determinan antibióticos eficacia de drogas contra M. tuberculosis en el modelo animal existente más clínicamente relevante. Estos métodos de análisis de imagen son algunas de las herramientas más poderosas en el arsenal contra esta enfermedad no sólo pueden evaluar una serie de características de la infección y tratamiento de drogas, pero también son directamente traducibles a un ajuste clínico para su uso en humanos estudios.

Mycobacterium tuberculosis ha plagado a los seres humanos durante milenios y causa más mortalidad que cualquier otro agente infeccioso único en el mundo de hoy. En el año 2015, fueron 10,5 millones casos nuevos de tuberculosis (TB) a nivel mundial¹ con la mayoría de los casos provienen de la India, Indonesia, China, Nigeria, Pakistán y Sudáfrica. Estimaciones Coloque la cifra global de TB en 1,4 millones de personas durante el mismo período de tiempo. Este valor es casi un 25% inferior a la tasa de muerte hace 100 años. Aunque TB sensible de la droga es tratable, el régimen es prolongado que requieren múltiples medicamentos y cumplimiento es un motivo de preocupación. La aparición de multi resistente (MDR) cepas representaron ~ 580.000 de los nuevos casos de tuberculosis en 2015. La tasa de tratamiento exitoso de pacientes con cepas MDR de M. tuberculosis sólo se estima que aproximadamente 50%. Aún más alarmante es la aparición de la extensivamente resistente (XDR) las cepas de M. tuberculosis, que son resistentes a casi todos disponibles de la droga. Por lo tanto, se necesitan nuevas técnicas dentro del campo de investigación de TB que mejoran la capacidad de diagnosticar TB, aumentar la comprensión inmunológica del proceso de la enfermedad y permiten la proyección de nuevos tratamientos y estrategias de prevención como antibiótico regímenes y estudios de eficacia de la vacuna.

M. tuberculosis es un bacilo acid-fast aeróbico que físicamente se caracteriza por su muy compleja pared celular externa y la cinética de crecimiento lento. La infección generalmente ocurre por inhalación de bacterias individuales en aerosolized gotitas que son expulsadas de un individuo sintomático infectado al toser, estornudar o cantar. De los individuos expuestos que desarrollan la infección, sólo 5-10% de las personas desarrollan tuberculosis clínica activa. El 90% restante tiene un espectro variable de infecciones asintomáticas que va desde la infección subclínica a ninguna enfermedad, que se considera clínicamente de latente (ITBL) la infección de TB^2,3. De la población que tiene esta infección asintomática, aproximadamente el 10% desarrollará tuberculosis activa por la reactivación de la infección contenida en su vida. Dramáticamente el riesgo de reactivación aumenta si una persona con contratos de infección asintomática por VIH o somete a tratamiento con un fármaco inmunosupresor, como TNF inhibidores^4,5,6. Enfermedad TB activa también se presenta como un espectro, con la mayoría de las personas con TB pulmonar, que afecta a los pulmones y los ganglios linfáticos torácicos. Sin embargo, M. tuberculosis puede infectar cualquier órgano, de manera que la infección puede también en sitios extrapulmonares de la implicación.

El sello patológico de la infección por M. tuberculosis es una organizada estructura esférica de las células del huésped, llamado granuloma. Macrófagos, células T y las células de B son componentes principales del granuloma, con un número variable de neutrófilos⁷. El centro del granuloma a menudo es necrótico. Así, los granulomas funcionan como un microambiente inmunológico para matar o contienen los bacilos, prevención de propagación a otras partes de los pulmones. Sin embargo, M. tuberculosis puede subvertir la matanza por el granuloma y persisten dentro de estas estructuras durante décadas. Monitoreo regular y consistente para el desarrollo de la enfermedad de TB activa después de una nueva infección o la reactivación de la ITBL es impráctico, científicamente difícil y desperdiciador de tiempo. Técnicas que estudian estos procesos longitudinalmente, en seres humanos y en modelos animales como humanos, son extremadamente útiles para la comunidad científica para promover la comprensión de las muchas complejidades de M. tuberculosis infección y enfermedad.

PET/CT es una técnica muy útil que se ha empleado para estudiar una amplia gama de Estados de enfermedad en humanos y modelos animales⁸. El PET es una técnica funcional que utiliza compuestos radiactivos emisores de positrones como reportero. Estos radioisótopos son funcionalizados típicamente un compuesto metabólico, como la glucosa, o a un grupo de objetivo que se diseña para atar a un receptor de interés. Puesto que la radiación emitida por isótopos PET es lo suficientemente potente como para penetrar el tejido, se pueden utilizar concentraciones muy bajas que permite estudio debajo de los niveles de saturación en compuestos dirigidos a receptores y a una concentración lo suficientemente baja para no tienen impacto en el metabolismo procesos al usar agentes tales como 2-deoxy - 2-(¹⁸F) Fluoro-D-glucosa (FDG). CT es una técnica de imagen de radiografía tridimensional que utiliza diferentes niveles de atenuación de rayos x para identificar las características físicas de los órganos dentro del cuerpo⁹. Cuando se combina con PET, CT se utiliza como un mapa para determinar localizaciones específicas y las estructuras que muestran la absorción de un radiotrazador PET. PET/CT es una poderosa herramienta para obtener imágenes en vivo de los seres humanos y modelos animales infectados con M. tuberculosis infección que ha llevado a muchos conocimientos profundos e importantes en la patogenia, respuesta a tratamiento farmacológico, espectro de la enfermedad, etcetera^{6 ,10,11,12}. Este trabajo describe métodos analíticos específicos de PET/CT para estudiar TB en modelos de primates no humanos longitudinalmente mediante parámetros tales como tamaño del granuloma, captación de FDG en las lesiones individuales, toda avidez FDG pulmonar y ganglionar y detección de extrapulmonar enfermedad^6,10,11,12.

Este manuscrito describe métodos de análisis en primates no humanos (NHPs), específicamente cangrejeros macacos, que se utilizan para evaluar longitudinalmente la progresión de la enfermedad y el tratamiento de la droga después de la infección con M. tuberculosis de de imágenes . NHPs son un modelo animal valioso porque cuando inoculados con una dosis baja de cepa Erdman de M. tuberculosis , los animales muestran una variedad de los resultados de la enfermedad con el ~ 50% desarrollo de TB activa y el resto de los animales con infección asintomática (es decir, control de la infección, ITBL), proporcionando el modelo más cercano al espectro clínico de la enfermedad en los seres humanos^{3,13,14,15,16}. Reactivación de ITBL en macacos se activa por los mismos agentes que causan reactivación en los seres humanos, que algunos ejemplos de virus de inmunodeficiencia humana (VIH, usando virus de la inmunodeficiencia de simian (SIV) como la versión de macaco del VIH), agotamiento CD4 o tumor necrosis factor (TNF) neutralización^13,16. Además, macacos presentan patología que es muy similar a la observada en los seres humanos, incluyendo los granulomas organizados que se forman en los pulmones o en otros órganos¹⁷. Así, este modelo ha proporcionado importantes conocimientos sobre las interacciones huésped-patógeno básica en la infección por M. tuberculosis , así como valiosos conocimientos sobre fármacos y vacunas para la tuberculosis^{14,18 , 19 , 20 , 21}.

Proyección de imagen PET/CT proporciona la capacidad para seguir la aparición, distribución y evolución de los granulomas. Este trabajo sobre todo ha utilizado FDG como una sonda que, como un análogo de la glucosa, incorpora host metabólicamente activa las células, como macrófagos, neutrófilos y linfocitos⁸, todos los cuales están en los granulomas. Así, la FDG es un proxy para la inflamación de host. Los procedimientos de análisis detallados en el presente documento utiliza OsiriX, un ampliamente utilizado Visor DICOM disponible para compra y uso. Los métodos de análisis de imagen se describe la forma, tamaño y actividad metabólica (vía captación FDG) de granulomas individuales la pista con el tiempo y utiliza la proyección de imagen como un mapa para identificar lesiones específicas sobre necropsia de animales. Además, se ha desarrollado un método independiente que cuantifica la suma de la absorción FDG en el pulmón por encima de un umbral específico (SUV ≥ 2,3) y este valor se utiliza para evaluar las diferencias entre el control y grupos experimentales a través de estudios que van desde vacunas ensayos a los modelos de coinfección. Estos datos apoyan que esta medida global de captación FDG en los pulmones se correlaciona con la carga bacteriana, proporcionando así información sobre el estado de la enfermedad. Similares análisis se pueden realizar en la captación FDG de ganglios torácicos para estudiar la progresión de la enfermedad así. El siguiente protocolo describe el proceso experimental de infección animal mediante análisis de imagen.

todos los métodos descritos en este trabajo han sido aprobados por la Universidad de Pittsburgh institucional Animal Care y Comité de uso. Todos los procedimientos siguieron requisitos institucionales de la seguridad de la radiación y bioseguridad. Exploración por TAC requiere ponerse delantal y garganta cubierta de plomo. Garb de bioseguridad nivel 3 (BSL3) y procedimientos para trabajar con primates no humanos deben seguirse según las directrices. Todo análisis se realizó en instalaciones BSL3.

1. procedimiento de infección animal

1. SEDAR animales con ketamina (10 mg/kg intramuscular) o telazol (5-8 mg/kg intramuscular) si el animal tiene reacciones adversas a ketamina.
2. Usando un laringoscopio, visualizar la epiglotis y cuerdas vocales. Anestesiar las cuerdas vocales mediante pulverización cetacaine aerosol para ~ 1 s (no más de 2 s).
3. Usar el laringoscopio, guía de un broncoscopio (2,5 mm de diámetro externo) en la tráquea a través de visualización directa en el lóbulo pulmonar caudal derecho.
4. Preparar una jeringa que consiste en aproximadamente 5-20 (dependiendo del estudio) colonias formando unidades de M. tuberculosis en 2 mL de solución salina estéril y administrar la solución a través del canal del broncoscopio. Preparar una jeringa separada de solución salina estéril de 2 mL y administrar la solución salina a través del canal del broncoscopio seguido por aire de 5 mL para asegurar completa deposición de bacterias ²².
5. Retirar el broncoscopio y observar el mono hasta que totalmente despierto y alerta.

2. Adquisición, histograma y el procedimiento de reconstrucción de imágenes

1. preparar animales para la proyección de imagen. Animal
   1. calmante con ketamina (10 mg/kg intramuscular) o telazol (5-8 mg/kg, intramuscular) si el animal tiene reacciones adversas a ketamina.
      Nota: Animales necesitan estar en ayunas durante la noche para reducir el riesgo de vómitos durante el procedimiento de proyección de imagen y mantener la coherencia en exploraciones del animal doméstico de FDG.
   2. Insertar un catéter intravenoso (IV) en la vena safena de cualquier pierna y asegure con cinta de tela.
   3. Diluir una dosis de aproximadamente 5 Millicurio de FDG con solución salina estéril hasta un volumen total de 5 mL en una jeringa de plástico.
   4. Registrar el nivel de radiactividad de la inyección en la jeringa usando un calibrador de dosis, registrar la hora y coloque la jeringa en un soporte de jeringa plomo.
   5. Inyecte la dosis radiactiva a través del catéter IV lentamente y seguir con 5 mL de solución salina estéril. Registrar el tiempo de inyección. Tiempo de inyección debe ser coordinada para ser aproximadamente 45min - 1 h antes de la proyección de imagen del animal doméstico.
   6. Registrar el nivel de radiactividad después de la inyección de la jeringa utilizando el calibrador de la dosis y el tiempo de registro. Deseche la jeringa en un recipiente de residuos adecuado.
   7. Usando un laringoscopio, visualizar la epiglotis y cuerdas vocales y anestesiar con cetacaine aerosol.
   8. Guía de un tubo endotraqueal (3,5 mm - 4.5 mm según tamaño de mono) en la tráquea e infle el manguito en el extremo insertado el tubo de.
   9. Una larga delgada franja de gasa estéril, fije el tubo de intubación envolviendo la tira alrededor del tubo, perforación de la Faja con cada colmillo del animal, entonces haga un nudo con la cantidad restante de gasa alrededor del puente de la nariz y finalmente alrededor de la espalda o f la cabeza.
   10. Cubrir los ojos con lágrimas artificiales para evitar que se sequen durante proyección de imagen de.
2. Exploraciones realizar TAC y PET.
   1. Animal lugar en escaneo cama.
   2. Tubo de intubación de conectar a un respirador con la siguiente configuración: tasa de respiración = 15, presión máxima = % de oxígeno de 15-17, = 40, PEEP (presión expiratoria del final positivo) = 3, el volumen Tidal = 60, C (tiempo inspiratorio) = 0.4, I: E (inspiratorio a tiempo expiratorio) cociente = 1:3. 4, T _meseta (pausa inspiratoria antes de la expiración) = 0.5, flujo máximo = 9.0 (estos valores pueden ajustarse dependiendo de la distensibilidad pulmonar específico animal o necesidades experimentales).
   3. Iniciar anestesia inhalante (2% isoflurano) a través del ventilador y continúe hasta que el animal no reaccione a estímulos físicos.
   4. Animal lugar en prono con la cabeza y las piernas apoyadas.
   5. Lugar animal dentro del campo de visión de la CT y llevar a cabo un análisis de vista previa para asegurarse de que el palmo entero de capacidad pulmonar se incluirán en el análisis completo.
   6. Adquirir una TC con los siguientes parámetros (exploración helicoidal, FOV Axial = 250 mm, voltaje = 140 kV, corriente = 2.0 mA, grosor de corte = 1,25 mm, filo = extra fuerte) mientras que llevar a cabo una respiración ventilador.
      Nota: Agente de contraste CT es opcional. Si se realiza una exploración de contraste, un retraso es necesario entre la inyección de medio de contraste y adquisición de la imagen porque la puesta en común de medio de contraste en el corazón interfiere con la reconstrucción de la imagen adecuada del espacio pulmonar en la exploración del animal doméstico y crea artefactos en los pulmones en la exploración del CT
   7. Asegúrese de bajar la concentración de isoflurano de 0.7 - 0.8% durante el procedimiento de exploración de.
   Animal
   8. lugar dentro del campo de visión del animal doméstico.
      Nota: El sistema en lugar de este trabajo es un sistema en línea con un tomógrafo PET y una CT. Coordenadas para el posicionamiento de PET manualmente se calcularon en base a coordenadas CT.
   9. Adquirir 600 imágenes de animal doméstico de s para cada posición de la cama.
      Nota: El sistema de enfoque de 220 tiene un FOV axial de 7,6 cm. Este trabajo se realizó con cuatro posiciones de cama que se cosen manualmente durante el proceso post.
   10. Apagar isoflurano, destetar animales off ventilador gradualmente, eliminar el aire de la muñequera de tubo ventilador y retire el tubo una vez que el animal ha recuperado reflejos de tos y respira normalmente. Retirar catéter IV y mantiene la presión en el sitio de la inyección hasta que haya parado el flujo de sangre.
3. Histograma de imagen PET realizar y reconstrucción.
   1. Histograma de imagen PET realizar con los siguientes parámetros: histograma 3D con no suavizado, útil: 3, diferencia de anillo: corrección global deadtime promedio 47,.
   2. Reconstrucción de imágenes PET de realizar con los siguientes parámetros = OSEM3D algoritmo (ordenó subconjunto expectativa máxima-3 dimensiones) con atenuación basada en el CT, filtro de proyección de rampa y corrección de dispersión, dando una imagen de 284 cortes.
4. Imágenes registro Co PET y CT.
5. Imágenes de exportación Co-registered PET y CT DICOM para el software (por ejemplo, OsiriX).

3. Identificar y analizar las lesiones individuales

1. abierto PET y CT DICOM las imágenes de la OsiriX de base de datos en la orientación axial (voluntad de imagen de CT se fundió con la imagen de la mascota y allí será una ventana de imagen independiente de mascotas).
2. Definido como exploración (o análisis seriales) orientación axial.
3. , Haga clic en (lugar) en la exploración del CT y cambiar el " WL/WW " en la barra de menú superior para " CT – pulmonar ".
4. Voluta a través de la exploración para determinar donde comienzan lóbulos pulmonares y final. (Identificar fisuras del pulmón).
   1. Desplazarse a través de la exploración toda, centrándose en áreas pequeñas del espacio pulmonar en una vez.
   2. Aviso que el pulmón normal aparece oscuro y características anatómicas aparecen más ligeros (dependiendo de la densidad). Vías respiratorias aparecen en negras mientras que la vasculatura aparece casi blanca.
   3. Seguir los vasos y las vías respiratorias que aparecen moverse mientras se desplaza en cortes axiales.
   4. Fisuras pueden ser identificados en las zonas donde no hay vasos o vías respiratorias. (Estas son las áreas en el pulmón que sólo aparecen oscuras con ninguna otras estructuras anatómicas).
5. Uso de la PET/TC fusionada para identificar lesiones.
   1. Desplazarse a través de la exploración toda, centrándose en áreas pequeñas del espacio pulmonar a la vez.
      Nota: Centrarse en el lóbulo de un pulmón en un momento para identificar y contar lesiones.
   2. FDG-ávidos de identificar lesiones en el pulmón. Parecen esferas caliente - muy diferente del fondo del pulmón. Las lesiones pequeñas, frío será mucho menos evidente y más difícil de identificar. Aparecen en la exploración como estructuras densas que no se muevan mientras se desplaza (como barcos).
      Nota: Los recipientes y pequeñas lesiones se parecen mucho. Una manera fácil de distinguir entre los dos es que pase el cursor sobre la estructura en cuestión y moverse arriba y abajo una rebanada o dos. Si la estructura se mantiene por debajo del cursor, la estructura es una lesión. Si la estructura se aleja el cursor mientras se desplaza hacia arriba o hacia abajo un trozo, es más probable barco o vía aérea.
   3. Para fines de identificación, use el " flecha " herramienta para apuntar a cada lesión en la exploración del.
   4. Para efectos de ubicación, utilice el " punto de " de la herramienta y haga clic en la lesión para que el ROI (región de interés) es directamente en el centro del granuloma. Información contenida en este retorno de la inversión incluirá las coordenadas cartesianas (XYZ-coordenadas) donde se encuentra la lesión.
6. Uso la " largo " y " Oval " herramientas para medir el tamaño (mm) y la avidez FDG (SUV) de cada lesión.
   1. Para medir el tamaño de una lesión, extraer la señal de la PET sólo el CT visible.
   2. Elige la " largo " herramienta.
   3. Desplácese hasta el segmento que contiene la mayor parte de la lesión es identificado (el segmento donde la lesión parece ser más grande).
   4. Trace una línea a través de la mayor longitud de la lesión. La información incluida en este retorno de la inversión representará la longitud (en mm) del diámetro de la lesión.
   5. Para medir la avidez FDG de una lesión, primero haga clic en la exploración del animal doméstico y que la PET. Ir a la " WL/WW & CLUT " Osirix menú en la parte superior de la pantalla y elija " WL/WW ajustar manualmente " en el menú desplegable de WL/WW. En el cuadro de diálogo, escriba 0 en el " de " y 20 en " a " con objeto de limitar la ventana de 0 a SUV 20.
   6. Elige la " Oval " herramienta de la " función del botón del ratón " menú herramienta.
   7. Voluta sobre la lesión para evaluar la parte más caliente de la lesión. Dibuja un óvalo alrededor de la lesión. El " Oval " herramienta información ROI incluye estadística descriptiva de los SUVs en vóxeles dentro de la región. Grabar el SUV máximo dentro de la región.
   8. Como cada uno " Oval " ROI sólo representa los valores SUV de ese plano axial específico de la lesión y las lesiones típicas son esféricas en forma, dibujar óvalos en varios segmentos para asegurar que el SUV máximo real de la lesión es capturado.
      Nota: Si manualmente se reconstruyen las exploraciones de PET/CT, las imágenes PET y CT pueden no ser perfectamente. Si este es el caso, se deben realizar todos los análisis SUV y ROIs en la exploración del animal doméstico en lugar de la exploración de PET/TC fusionada. Ya que muchas lesiones son más pequeñas que la resolución de los cristales de detector de mascotas, todos medido SUV para las lesiones individuales se introducen en una recuperación coeficiente calculadora hoja de cálculo que realiza una corrección de volumen parcial para cada lesión ²³.

4. Total pulmonar FDG avidez procedimiento de medición para determinar inflamación del pulmón Total

1. abierto PET y CT DICOM las imágenes de la OsiriX de base de datos en la orientación axial (voluntad de imagen de CT se fundió con la imagen de la mascota y allí será una ventana de imagen independiente de mascotas).
2. Realizar una segmentación del volumen pulmonar en la imagen de CT.
   1. Haga clic en cualquier parte de la exploración del CT para asegurarse de que es la ventana activa.
   2. Vaya al menú desplegable ROI y seleccione " segmentación de la región crecer (2D/3D) … ".
   3. Para captar la densidad del pulmón normal, ajuste el umbral más bajo para-1024 y el umbral superior a -200. Estos son indicativos de unidades Hounsfield, aunque el cuadro de segmentación no les nombre como tal.
   4. Una vez que se establecen los umbrales superiores e inferiores, haga clic en cualquier lugar dentro del pulmón. El pulmón entero debe aparecer resaltado en verde.
   5. a continuación, haga clic en " calcular " en el cuadro de diálogo de parámetros de segmentación. Esto ampliará la región crece de una rebanada del volumen pulmonar total.
3. Mover el " crecer región " de los pulmones de la TC para la TEP.
   1. Haga clic en el icono pequeño a la izquierda del nombre de la exploración del CT y arrastrar el icono a la exploración del animal doméstico.
   Seleccione
   2. " copiar ROIs ". Ahora debe haber un recubrimiento de los pulmones en la exploración del animal doméstico.
4. Borrar el ROI de la exploración del CT (opcional).
   Nota: Ayuda a poder ver el pulmón entero sin ROIs en la exploración del CT para asegurarse de que toda patología en el pulmón es capturada. Para ello, elimine el ROI. Asegúrese de que la ventana de CT es activo (haga clic en la exploración del CT) Seleccione el ROI desplegable y seleccione " ROIs todos eliminar en esta serie. "
5. relleno en áreas de alta densidad del pulmón que aparecen como huecos en la exploración del animal doméstico.
   Nota: En muchas ocasiones, hay agujeros en el retorno de la inversión en la exploración del animal doméstico donde el tejido pulmonar era más denso que el HU-200 en la exploración del CT (este paso puede omitirse si no se produce).
   1. Destacar el menú desplegable ROI y seleccione " cepillo ROIs " → " cierre. " cuando aparezca el cuadro de diálogo, deslice la flecha a 3 para que la parte superior del cuadro de diálogo se lee " estructuración Elemento radio: 3 " y " aplicar a ROIs todos con el mismo nombre. "
      Nota: cuando hay grandes porciones de la enfermedad (como consolidaciones que son más densas que el tejido pulmonar circundante), cerrando a menudo el pincel ROIs no será suficiente para llenar el pulmón entero. Si este es el caso, los vacíos deben rellenarse manualmente.
   2. Ir a la " función del botón del ratón " área en la parte superior del menú y haga clic en la pequeña flecha a la derecha.
   3. Seleccionar la " cepillo " herramienta.
   4. Una vez seleccionada esta herramienta, dibujar manualmente en el ROI para rellenar los agujeros de.
6. Aislamiento pulmonar retorno de la inversión en la exploración del animal doméstico.
   1. Ahora que hay una representación del pulmón entero sobre el PET escanear, eliminar todos los píxeles fuera del pulmón.
   2. Seleccione el menú desplegable ROI y seleccione " establece los valores de píxeles a … ".
   3. Haga clic en la casilla de verificación Fuera de ROI y todos los píxeles fuera del ROI se establece en 0.
7. Aislar " caliente " patología.
   1. Usar ningún umbral que se desee utilizar como " caliente. " mayor a 2.3 se considera SUV " caliente " basado en los valores de la literatura por las lesiones de tuberculosis ²⁴.
   2. Seleccione el menú desplegable ROI y " establece los valores de píxeles a … ".
   3. Haga clic en la casilla de verificación Dentro de ROI. Asegúrese de hacer clic en el " y " de la caja para que todos los valores entre 0 y 2.3 se establecen en 0.
8. Asegúrese de que la patología de la enfermedad sólo se contabiliza en el ROI.
   1. Nota que hay zonas (como el hígado) que son más calientes que 2.3. Asegúrese de que sólo zonas deseadas son capturadas mediante la eliminación de los ROIs y crear otro crecer región. Otros tejidos comunes que interfieren en este tiempo incluyen el corazón, nodos de linfa mediastínicos, vértebras y costillas.
   2. Seleccione el menú desplegable ROI y seleccione " ROIs todos eliminar en esta serie. " a continuación, vaya a ROI y seleccione " segmentación de la región crecer (2D/3D) … ".
   3. Cambiar el umbral a umbral inferior a 2.3 y el umbral superior a 100.
   4. Voluta a través de la ventana de PET entera, clic en la patología de la enfermedad y en " Compute. " repetir para cada área de la enfermedad caliente. Asegúrese de guardar todo pulmón ROI mediante el " ROIs guardar " en opción del menú ROI.
9. Valores crudos de exportación en una hoja de cálculo.
   1. Vaya a 2D Viewer en el menú desplegable y seleccione " Revert serie. "
   2. a continuación, ir al bar de menú desplegable de Plugins
   3. Select " herramientas de ROI " → " exportación ROIs. " nombre y guarde el archivo de datos exportado. Seleccione " CSV " en la parte inferior de este cuadro de diálogo.
10. Calcular el Total avidez de FDG de los datos en bruto. Cada fila de esta hoja de cálculo representa una sola rebanada de la exploración. La columna de interés es " RoiTotal. "
    1. para calcular el " avidez FDG Total " añadir la " RoiTotal " de las láminas juntas. Calcular la suma de la columna F (RoiTotal). Esta suma es la medida de la avidez de FDG Total.
    2. OsiriX si no tiene el ROI Export plug-in, ir a Plugins en el menú desplegable. Seleccione " administrador de Plugins … " haga clic en el " descargar … " en la parte superior del cuadro de diálogo. Seleccione " ExportROIs " de la " plugins disponibles " menú desplegable. Seleccione " descargar & Install. "

5. Procedimiento analítico para determinar la absorción de FDG en " caliente " los ganglios linfáticos

1. abierto PET y CT DICOM imágenes de OsiriX de base de datos en la orientación axial (voluntad de imagen de CT se fundió con la imagen de la mascota y allí será una ventana de imagen independiente de mascotas).
2. Asegurarse de que al realizar análisis ROI manual en imágenes PET que la ventana de intensidad de la imagen sea coherente.
   1. Haga clic en la ventana de imagen PET para sea la ventana activa.
   2. En el menú de OsiriX, haga clic en el " WL/WW " menú desplegable y haga clic en " establecer manualmente WL/WW ".
   3. Cuando aparezca el cuadro desplegable de la ventana activa del animal doméstico, rellenar el valor de la intensidad mínima deseada en el " de " campo y la intensidad deseada de máximo valor en la " a " campo (por ejemplo, a la ventana la imagen de la mascota de 0 a 20 SUV, escriba 0 en el " de " campo y 20 en el " para " campo).
   4. Alternativamente, si se desea siempre cargar imágenes con los mismos valores de intensidad, en el menú principal resalte Osirix - > PET - > entonces en " nivel de ventana & anchura " sección, haga clic en el Uso fija niveles de burbuja e introduzca los valores deseados en el " de " y " a " campos.
3. Una vez el nodo de linfa deseado, dibujar manualmente un retorno de la inversión alrededor de los bordes del ganglio linfático.
   1. Resaltar la imagen de fusión PET/CT para asegurar que sea la ventana activa.
   2. Ya que es útil usar una tabla de búsqueda de color multicolor para este análisis, para cambiar esta configuración: haga clic en el " CLUT " desplegable de la caja en la barra de herramientas principal de OsiriX y seleccione el ajuste de la tabla de búsqueda deseada (UCLA preferido).
   3. Para dibujar un ROI manual en el nodo de linfa, haga clic en el menú a la derecha del desplegable el " la función del botón de ratón " en la barra de herramientas principal y seleccione " polígono cerrado ". Haga clic en el borde del ganglio linfático, basado en el aspecto de ventanas PET tabla para establecer el primer punto de la ROI.
   4. Haga clic en otro punto del borde externo del ganglio linfático y continuar seguimiento hasta que el nodo de linfa es casi incluido.
   5. Para establecer el punto final del retorno de la inversión, haga doble clic para cerrar en el ROI.
   6. Repita este proceso en varias rebanadas para determinación del SUV máximo en el nodo de linfa.
   7. Grabar los datos deseados SUV en una hoja de cálculo separada.

6. Determinación de la absorción de FDG músculo fondo para la normalización de los valores

Nota: para mantener la consistencia en varios puntos de tiempo imagen en materia de captación FDG y la variación de la actividad metabólica en el animal en diferentes, todos los análisis PET deben ser normalizado al músculo y presentado como tal. Todos los datos PET cuantitativos presentados en este trabajo se representa como un SUVCMR (captación de valor cilindro muscular relación estándar).

1. Abierto PET y CT DICOM imágenes de OsiriX de base de datos en la orientación axial (voluntad de imagen de CT se fundió con la imagen de la mascota y allí será una ventana de imagen independiente de mascotas).
2. Haga clic en la imagen Co-registered PET y CT para asegurar que sea la ventana activa.
3. Desplácese por la imagen hasta que el segmento que contiene el punto de encuentro de los principales bronquios (carina).
4. ROIs dibujar en la espalda, músculo para obtener fondo valores SUV.
   1. Seleccionar la herramienta ROI desplegable a la derecha de la " opción de botón de ratón " en el menú principal de OsiriX.
   2. Relieve " Oval " como la herramienta ROI.
   3. Dibujar ROIs de aproximadamente el mismo tamaño en los músculos situados posterior y lateral a la columna vertebral.
   4. Haga clic en el icono a la izquierda de la Co-registered PET/CT scan y arrastrar el icono a la ventana de PET.
   Seleccione
   5. " copiar ROIs ". El ROI debe verse ahora en la ventana de exploración del animal doméstico.
   6. En el menú principal, seleccione el " modo " casilla de verificación y asegúrese de que " MIP – proyección de intensidad máxima " se selecciona en el menú desplegable inmediatamente para el derecho.
   7. Asegurarse de que el " losa espesor " escala se establece en 10. Esto indica que 10 rebanadas se combinan en la imagen de PET como una elaboración de proyección de máxima intensidad un " cilindro de " volumen de interés (origen del cociente del músculo de cilindro).
5. Grabar los valores promedio de SUV de dos ROIs en una hoja de cálculo.
6. Promedio de los dos valores para obtener el fondo valor de captación FDG del músculo. Este es el valor utilizado para obtener los valores de la relación entre la absorción en el sitio de destino y la absorción metabólica basal.

Identificación y análisis de las lesiones individuales

Los granulomas pueden visualizarse por número, tamaño y absorción de FDG cualitativo comprender el alcance general del proceso de infección (figura 1). Usando estas imágenes, granulomas en el tiempo es una medida cuantitativa de la diseminación de la enfermedad. Figura 2 muestra granuloma individual cuenta con el tiempo en un grupo de 10 animales. De los 10 animales, tres desarrollaron enfermedad activa y seis desarrollaron infección latente. Un animal no mostró signos de enfermedad activa pero de vez en cuando la cultura positiva (en gástrico aspirado o broncoalveolar lavado las muestras) para M. tuberculosis, colocándola dentro del espectro de la enfermedad entre activos y latentes y así fue quitado a partir del análisis de este particular experimento. De los tres animales con enfermedad activa, un animal desarrollado enfermedad miliar por infección después de 12 semanas y era eutanasia (esto se identifica en la figura 2 como TNTC [demasiado numerosas para contar]). Desde 6 semanas después de la infección y después de eso, los animales que más tarde se convertiría en enfermedad activa mostró estadísticamente un número mayor de granulomas que animales que desarrollarían infección latente.

Para mejor caracterizar y distinguir granulomas entre animales activos y latentes, las lesiones individuales en exploraciones del animal doméstico fueron analizadas para determinar si había una diferencia en el patrón de captación FDG entre los dos grupos. En todos los animales de una infección activa, hubo un aumento en la absorción de FDG en cada granuloma de tres a seis semanas post infección (Figura 3A). Por el contrario, granulomas en los animales que desarrollaron infección latente mostraron una variación en la absorción de FDG con algunas lesiones aumentando, disminuyendo o mostrando la misma captación de tres a seis semanas (figura 3B). Estos resultados se comparan con grupos que muestra la diferencia en cambio entre los animales latentes y activos tres semanas vs seis semanas (figura 3) y tres semanas y 24 semanas (figura 3D). En ambos casos, los granulomas activos animales demostraron un cambio positivo y significativamente diferente en SUV (dentro de cada animal individual (Figura 3A y 3B) y cuando se compara por grupos de animales (figura 3 y 3D).

Análisis de captación FDG en los ganglios linfáticos "Caliente"

Como nodos de linfa mediastínicos no son fácilmente visualizados en TC a menos que grandemente ampliada, imágenes PET deben utilizarse para identificar estos tejidos enfermos. Al analizar los ganglios linfáticos, es fundamental que la imagen se ajusta siempre a la misma escala de PET máxima y mínima para mantener la coherencia durante todo el proceso. Al comparar MLNs de animales que desarrollaron la enfermedad activa o latente, Lin et al demostró a través del análisis del ROI de MLNs que mientras que la absorción de FDG en los ganglios linfáticos fueron similares entre los animales activos y latentes en 3 semanas, MLNs de animales activos mostraron significativamente absorción más alta en 6 semanas¹¹. Se observaron diferencias en mayor grado a las 8 y 12 semanas (figura 4). Así, datos de TEP/TC pueden utilizarse para evaluar diferencias significativas en los ganglios linfáticos además de estudiar los granulomas en animales infectados.

Pulmonar total avidez FDG

Como ejemplo del poder de la evaluación pulmonar total avidez FDG, Lin et al demostró que la inflamación pulmonar elevada en animales clínicamente clasificadas como ITBL se correlaciona con riesgo de reactivación⁶. En este estudio, Macacos cangrejeros de ITBL (infectados con M. tuberculosisde la bajo-dosis) fueron PET/CT reflejada (infección después de 6 meses) antes de la neutralización del factor de necrosis tumoral (TNF) para evaluar el espectro de las lesiones vistas en ITBL clínicamente definida y determinar el riesgo de reactivación. Animales con mayor pulmón total avidez FDG eran más propensos a reactivar (figura 5). Sobre el 90% de los animales con más de 10³ pulmón avidez FDG o visible (por análisis) al menos un sitio extrapulmonar de la infección reactivada después de la neutralización del TNF. Sólo un animal que no reactivar supera este umbral de avidez FDG pulmonar total. Por lo tanto, parámetros de PET/CT pueden ser una poderosa herramienta para predecir el resultado clínico aunque los parámetros específicos deben ser identificados científicamente.

Un ejemplo de utilidad en escenarios de tratamiento de drogas, Coleman et al realizaron un estudio de pruebas oxazolidinonas en seres humanos y cangrejeros macacos donde pulmonar total avidez FDG fue medición tratamiento farmacológico previo y uno y dos meses después del tratamiento¹⁰. Veces cambios se calcularon para mostrar la respuesta de la droga un mes (figura 6A) y dos meses después del tratamiento (Figura 6B). En ambos puntos del tiempo, control animales mostraron significativamente mayor avidez FDG en el espacio pulmonar total de animales tratados con drogas. En todos los animales tratados con el fármaco, inflamación del pulmón total disminuyó durante el régimen de tratamiento de dos meses, mientras que en la mayoría de los animales de control, total inflamación pulmonar aumentada con el tiempo o era sin cambios.

Figura 1. Serial de la FDG PET-TAC imágenes mostrando una difusión y patrón estable de Granuloma evolución durante el curso de la infección temprana.
(Fila superior) Granulomas primarios (flechas blancas) primero fueron establecidos en infección después de 3 semanas, mientras que los granulomas nuevo desarrollaron adyacente (flechas verdes) las lesiones existentes o en nuevos sitios (flechas amarillas). Animales que más tarde se convertiría en tuberculosis activa desarrollaron lesiones más durante el curso de la infección. (Fila inferior) Primarios granulomas (flechas blancas) de animales latentes generalmente se mantuvo estables, con algunos granulomas nuevo desarrollo a través del curso de la infección. WKS PI, post-infección semanas. Figura tomada de Coleman et al¹¹ haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Datos del representante de representar la mediana y el rango de Granuloma contando desde CT analiza comparando animales con infección activa (símbolos rojo) a la infección latente(Símbolos verdes).
Infección activa animales tenían más granulomas que animales infectados latente tan pronto como la infección después de seis semanas. P < 0.05 (*) por la prueba de Mann-Whitney. Semanas PI, post-infección semanas. TNTC, demasiado numerosos para contarlos. Figura adaptada de Coleman et al¹¹ haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Utilización del análisis del ROI en PET imágenes para mostrar metabólico actividad de pulmón Granulomas diferencia entre activo y latente infectados los animales durante la infección temprana.
Los granulomas en los animales activados [A] tienen un aumento significativo en la actividad metabólica (medido como valor de captación estándar normalizado a captación muscular [SUVCMR]) entre 3 y 6 semanas después de la infección mientras que latente la infección animales [B] no. El cambio en la actividad metabólica en las lesiones entre animales latentes y activos como los grupos se compararon 3 vs 6 semanas [C] 3 vs 24 semanas [D] que muestran que animales activamente infectados (cuadrados rojos) tienen un cambio significativamente mayor en la absorción de latente animales (círculos verdes) en ambos puntos del tiempo. Líneas negras sólidas representan la mediana. La prueba de suma de rango de Wilcoxon fue utilizada para analizar los datos en paneles A y B. Para los paneles C y D, los valores se analizaron por el test de Mann-Whitney. P < 0.0001 (*) para todos los paneles. Figura adaptada de Coleman et al¹¹ haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Análisis del ROI de las imágenes de PET para mostrar diferencias en la absorción de FDG en nodos de linfa mediastínicos entre animales con enfermedad activa (cuadrados rojos) y la enfermedad latente (círculos verdes).
La absorción fue mayor en animales activamente infectados en 6, 8 y 12 semanas post infección. Cada punto representa un nodo de linfa individual. Líneas negras sólidas representan la mediana. P < 0.05 (*), P < 0.01 (*) y P < 0,001 (*) por la prueba de Mann-Whitney. Figura adaptada de Coleman et al¹¹ haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Análisis del ROI de las medidas de avidez FDG pulmonar Total en seis meses Post infección, destacando las diferencias en la absorción de FDG en los animales que reactivación de infección latente (rosa plazas) en comparación con los animales que permanecen latentes (círculos verdes).
Tres de los cuatro animales "reactiva" que se encuentran por debajo de la línea de puntos tenían enfermedad extrapulmonar antes de la neutralización del TNF (tumor necrosis factor). Cada punto representa un animal. Línea punteada representa el valor de umbral para el riesgo de reactivación probable. Líneas negras sólidas representan la mediana. P < 0.01 (*) de Mann-Whitney Test. Data adaptado de Lin et al.⁶ haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Representante Total pulmón FDG avidez ROI medidas destacando en general cambian de inflamación en los pulmones que comparan sin tratar (círculos rojos) y Linezolid tratados a monos (círculos azules).
Avidez FDG se midió antes del tratamiento de linezolid (30 mg/kg diarios) y se midió el cambio de doblez en la total absorción de FDG en 1 mes [A] y [B] 2 meses post-tratamiento. Cada mono es representado por un círculo individual. Líneas negras sólidas representan la mediana. P < 0,01 (*) por Mann-Whitney Test. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los datos adquiridos de TEP/TC pueden utilizarse como medidas sustitutas para muchos aspectos de la infección por M. tuberculosis que sería inobservable sin dicha tecnología. PET/CT es más sensible que la tecnología de rayos x, que a menudo se utiliza en estudios de macacos. PET-TAC proporciona información estructural, espacial y funcional. Los análisis descritos anteriormente tienen muchas aplicaciones prácticas como seguimiento de la progresión de la enfermedad, evaluar la eficacia del tratamiento farmacológico y proporcionando los factores de riesgo para reactivación^{6,10,11, 13}.

Seguimiento de la propagación de granulomas y la absorción de FDG de las lesiones individuales puede compararse entre control y grupos experimentales no sólo proporcionar la ubicación específica de la infección, sino también seguir la difusión de la enfermedad²⁵. Por ejemplo, en el trabajo de Coleman et al describir la infección temprana en Macacos cangrejeros, siguiendo la progresión de la infección puede determinar si la infección en un animal va a permanecer activo y empeorar o ser contenida por el sistema inmune (es decir, ITBL)¹¹. Esto es sólo un ejemplo del poder que tiene la proyección de imagen PET/CT en el estudio de la progresión de la enfermedad con respecto a los granulomas. El mismo método puede utilizarse para estudiar una amplia variedad de parámetros experimentales con el tiempo. Por ejemplo, enumeración de granulomas que establecen por infección después de 4 semanas puede proporcionar una medida de resultado de gran alcance para una vacuna, ya que las vacunas mejor prevenir o limitar el establecimiento de granuloma tras desafío. Otra medida de resultado para las vacunas podrían limitar la difusión. Estas medidas de resultado cuantificables proporcionan datos importantes sin la necesidad de realizar necropsias tempranos en los animales. Una limitación de la evaluación de los granulomas es la sensibilidad del tomógrafo; visualización de granulomas < 1 mm de tamaño es a menudo posible.

Evaluación de los ganglios linfáticos mediastínicos (MLNs) es importante al estudiar la infección por M. tuberculosis también. MLNs son importantes para T-cell de cebado y el tráfico de células inmunes durante la infección. Sin embargo, en casi todos los macacos, al menos uno y a veces varios MLNs pueden infectarse. Así, MLNs son un sitio adicional de persistencia bacteriana activa TB y ITBL y puede servir como un reservorio de bacterias, posiblemente contribuyendo a la reactivación^26,27. En casos de afectación severa del MLN, se pueden comprimir las vías aéreas. Grandes MLNs necróticos pueden erosionar a las vías respiratorias, conduciendo a la diseminación de la infección. Análisis de los datos de la PET-TAC en los ganglios linfáticos es más complejo que los granulomas porque los componentes estructurales de los nodos no son fácilmente visibles en TC. Además, sólo los ganglios linfáticos que están metabólicamente activos pueden ser analizados debido a la absorción de FDG. Debido a esto, al analizar el caliente de los ganglios linfáticos, es importante asegurarse de que la imagen PET se ajusta a la misma escala de intensidad máxima y mínima para cada análisis de imagen asegurar la consistencia. Pueden ser estructuras de gran tamaño, el centro necrótico puede ser negativo para la avidez FDG, y así puede aparecer la avidez FDG a reducirse con el tiempo, incluso cuando la enfermedad está aumentando en el MLNs.

Pulmonar total avidez FDG representa la inflamación total dentro de los pulmones. La cantidad de inflamación pulmonar es una indicación de la severidad de la enfermedad y se correlaciona con la carga bacteriana^6,10,28 por lo tanto este cuantitativa y evaluación objetiva tiene numerosas aplicaciones. Para medir la avidez FDG total, vóxeles todos dentro de una imagen del animal doméstico que un SUV de más de 2.3 se combinan en un solo volumen de interés (VOI) y el valor total de la SUV del VOI todo es el valor final de la avidez. Este valor fue seleccionado de la literatura que en comparación con valores SUV de captación FDG en los tumores de pulmón en diversas patologías infecciosas en los seres humanos²⁴. Es importante señalar que este valor total de la avidez FDG se limita sólo a la enfermedad en el espacio del pulmón y no debe considerarse todos FDG absorción enfermedad no relacionada o situado en proximidad cercana a los pulmones. Además, pulmonar total avidez FDG no incluye MLNs. Mientras que la avidez de los granulomas y los ganglios linfáticos nos permite observar la variabilidad de los resultados de TB en el host, avidez FDG del pulmón total es esencial para evaluar el host como un todo. Estos métodos también funcionan como herramientas de análisis para medir la respuesta de drogas para tuberculosis. Trabajo previo ha demostrado que el tratamiento farmacológico de TB puede reducir el tamaño y la avidez de la FDG de los granulomas en tiempo¹² y estos cambios se asociaron con menor carga bacteriana. Cambios en la inflamación en el transcurso completo de fármacos también pueden utilizarse para evaluar la eficacia de la droga o el fracaso.

Debido a la naturaleza altamente detallada de estos procedimientos, una buena cantidad de solución de problemas puede ser necesaria para obtener los datos más constantes durante los estudios. Es el objetivo de este documento para delinear los procedimientos para permitir a individuos en todo el mundo a usar estas técnicas mientras que teniendo en cuenta precisa atención al detalle es esencial. Evaluación de imágenes de personas deben ser muy familiarizadas con la anatomía y fisiología para reconocer la anormalidad dentro de análisis particular. Lectores de imagen tienen que reconocer la absorción de la sonda no normal por todo el cuerpo porque TB puede propagarse más allá de la cavidad torácica. Además, registro de PET y TAC en proyección de imagen no es un proceso perfecto y pueden ocurrir desviaciones ocasionales en registro de la imagen; Reconociendo esto puede ser vital importancia cuando se evalúan las características de la enfermedad muy pequeño (es decir, granulomas de 1-2 mm). Una infección previa puede ser particularmente útil como un comparador normal del pulmón (y otros órganos) las estructuras y patrones del animal doméstico y reconocer a aquellos que son nuevos o modificados después de la infección. Otro componente importante de este análisis es la medida de fondo. Todos los datos del animal doméstico se normalizan a captación muscular como base fisiológica debido a absorción de FDG se basa en el metabolismo. Una combinación de los músculos romboide y Serrato en la parte posteriora se utilizan para mediciones de fondo debido a la proximidad a la cavidad torácica y la consistencia relativa en la absorción de FDG en ayunas animales. En el caso de M. tuberculosis -infectados macacos, es preferible al uso de otro órgano, como el hígado, para las medidas de fondo como M. tuberculosis puede infectar el hígado y metabolismo hepático puede ser afectado en el tratamiento de animales con varias drogas anti-TB. Tomando los factores anteriores en cuenta, así como garantizar que se guardan las imágenes todas las regiones de interés al final del análisis debe generar resultados altamente reproducibles.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores desean reconocer a Mark Rodgers para contornear los procedimientos de infección y L. Eoin Carney y Brian Lopresti de orientación en el establecimiento de estos procedimientos por imágenes. Fondos para este trabajo ha sido facilitada por la Fundación Bill y Melinda Gates (J.L.F., PLL), National Institutes of Health, institutos nacionales de alergia y AI111871 de R01 de enfermedades infecciosas (PLL), National Heart Lung and R01 HL106804 (J de sangre Instituto . L.F.), R01 HL110811.