Un sistema simplificado para la evaluación de la célula Mechanosensing y Durotaxis

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Las propiedades de la composición y mecánicas de la matriz extracelular son muy variables entre los tipos de tejidos. Esta diversidad estroma de tejido conectivo en gran medida el comportamiento celular impactos para regular los procesos normal y patológico incluyendo la proliferación celular, la diferenciación, la señalización de adhesión y migración direccional. En este sentido, la capacidad innata de ciertos tipos de células para migrar hacia un sustrato de matriz más rígida, o menos compatible que se conoce como durotaxis. Este fenómeno juega un papel importante durante el desarrollo embrionario, la reparación de heridas y la invasión de células de cáncer. A continuación, describimos un ensayo sencillo para estudiar durotaxis, in vitro, usando sustratos (PDMS) de polidimetilsiloxano. Preparación del descrito durotaxis cámaras crea una interfaz de rigidez entre el gel PDMS relativamente blando y un cubreobjetos de vidrio rígida. En el ejemplo, hemos utilizado estos durotaxis cámaras para demostrar un papel para el cdc42 / Rac1 GTPasa prote activaciónen, cdGAP, en mechanosensing y durotaxis regulación en células de osteosarcoma U2OS humanas. Este ensayo es fácilmente adaptable a otros tipos de células y / o desmontables de otras proteínas de interés, para explorar sus respectivas funciones en mechanosignaling y durotaxis.

La matriz extracelular (ECM) se compone de una serie compleja de proteínas estructurales y de reticulación incluyendo el colágeno, fibronectina y laminina. Aunque está bien establecido que el ECM proporciona importante apoyo estructural a los tejidos celulares, cada vez hay más pruebas que indican que las células responden activamente a los cambios físicos en su entorno de ECM para regular diversos procesos celulares, incluyendo la supervivencia celular, la diferenciación y migración celular. Por ejemplo, las diferencias en la rigidez de la ECM pueden conducir las células madre mesenquimales hacia diferentes linajes, con sustratos blandos (~ 1 kPa) que promueven linajes neurogénicos mientras sustratos rígidos (~ 25 kPa) promueven la diferenciación osteogénica ^1. Del mismo modo, un aumento en la rigidez de la matriz estromal ha sido demostrado para promover la tumorigénesis mamaria de las células epiteliales y la invasión en el tejido circundante ^2,3.

Un aspecto particularmente interesante de este mechanosignresultados de la actividad aling en un proceso conocido como durotaxis, en el que las células migran preferentemente hacia un sustrato más rígido ^4,5. Las células constantemente sentido, las características físicas de su entorno extracelular a través de receptor de integrina de unión a la ECM. Esto, a su vez, promueve la acumulación de numerosas proteínas estructurales y de señalización a sus dominios citoplásmicos para impulsar la formación de estructuras adhesivas conocidas como adhesiones focales o contactos focales ^6,7. Desde integrinas no tienen actividad enzimática intrínseca, las señales se transmiten desde el ECM a través de estas proteínas accesorias para coordinar la respuesta de la célula a su entorno cambiante ^8. En consecuencia, la identificación y caracterización de las proteínas clave que intervienen en la regulación de mechanosignaling y durotaxis es un área importante de investigación.

Varios sistemas de modelos se han desarrollado para estudiar durotaxis in vitro, pero la mayoría tienenutilizados sustratos revestidos con colágeno de poliacrilamida ^4. Sin embargo, la preparación de los sustratos de poliacrilamida puede ser técnicamente difícil y el colágeno utilizado en estos ensayos debe ser reticulado químicamente al sustrato ^9. Sustratos de polidimetilsiloxano (PDMS) se ha demostrado que exhiben propiedades mecánicas comparables a los sustratos ^de poliacrilamida al 10. Sin embargo, los sustratos de PDMS se preparan por simple mezcla de una proporción de la base a agente reticulante y estos sustratos pueden estar recubiertos con proteínas ECM sin la necesidad de reticulación química, haciendo así más fácil PDMS una herramienta para estudiar los efectos de rigidez en el comportamiento celular. En este documento, se describe cómo preparar una cámara durotaxis simple en el que un sustrato suave PDMS se integra con un cubreobjetos de vidrio rígido.

El ensayo, como se indica a continuación, ofrece un método rápido y sencillo para estudiar durotaxis. Para este estudio se utilizaron células de osteosarcoma U2OS humanas combinadas con mediada por siRNAdesmontables de cdGAP para estudiar el papel de esta proteína de adhesión focal en durotaxis ^11. Es importante destacar que este protocolo se puede adaptar fácilmente a las necesidades individuales. Otros tipos de células pueden ser sustituidos por las células U2OS y cualquier proteína pueden ser derribados o sobreexpresa para determinar los efectos sobre el comportamiento celular durante durotaxis. Además, este protocolo puede ser adaptado para incorporar proteínas etiquetadas con fluorescencia para analizar su dinámica y el comportamiento utilizando FRAP o FRET enfoques.

1. Preparación de Durotaxis Cámaras

1. Para preparar un solo 6 pocillos placa de cultivo de tejidos, tarar la balanza con un tubo cónico de 50 ml. Pesar aproximadamente 10 g de la solución de base de PDMS en el tubo de 50 ml (la solución es bastante viscoso).
2. Para un 90: 1 sustrato (Cumplimiento de ~ 1 kPa), se divide el peso medido de la solución de base de PDMS en el tubo por 90 para determinar la cantidad correcta de solución de agente de reticulación necesario. Añadir la cantidad calculada de la solución reticulante PDMS al mismo tubo.
   Ejemplo: 10 g / 90 = 0,11 g. Añadir 0,11 g de la solución de agente de reticulación PDMS a la solución base de PDMS.
   NOTA: La base y reticulantes soluciones son a la vez proporcionan en el kit de PDMS.
3. Mezclar vigorosamente la mezcla base / reticulante PDMS durante 5 min a RT usando una espátula pequeña. En esta etapa la mezcla contendrá un gran número de burbujas de aire.
4. Centrifugar el sustrato PDMS en una centrífuga de mesa durante 5 min a 50 xg a temperatura ambiente para eliminar el bubbles. Aún si hay burbujas después del 5 min, se centrifuga de nuevo.
5. Pipeta 1 ml de 90: 1 PDMS sustrato en cada pocillo del cultivo de tejidos tratados placa de 6 pocillos. Cualquier burbuja de aire restantes presentes en los PDMS pueden ser eliminados en esta etapa haciendo estallar ellos usando una aguja de 21 G. Permitir que el PDMS se extiendan durante 30 minutos en el pozo.
6. Hervir 12 mm de vidrio # 1 cubreobjetos en agua destilada durante 5 min. Repetir dos veces y almacenar los cubreobjetos en agua destilada.
7. Coloque uno, cubreobjetos se secó en cada pocillo de la placa de cultivo de tejidos tocando suavemente un lado del cubreobjetos en la solución de PDMS a continuación, colocar el cubreobjetos sobre los PDMS. A medida que el cubreobjetos se asienta, los PDMS comenzarán a invadir lo largo de los bordes del cubreobjetos, pero no cubren completamente. Esto generará una interfaz entre el PDMS y el vidrio después del curado (ver la Figura 1A, B).
8. Incubar la placa a 70 ° C en un horno durante 16 horas para curar (se endurecen) el PDMS. Coloque el plate en una campana de cultivo celular y UV esterilizar durante 10 minutos.
   NOTA: Lo mejor es hacer las placas en un par de días de uso. Sin embargo, las placas pueden ser envueltos en Parafilm sin ningún tipo de tampón y se almacenaron a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas sin ninguna disminución notable en la calidad.

2. Celular Chapado

NOTA: Si el estudio del efecto de la caída siRNA mediada, realice la caída con las instrucciones del fabricante o el protocolo optimizado para el tipo de célula de elección.

1. Escudo durotaxis cada cámara con 1 ml de 10 mg / ml de fibronectina en PBS sin calcio y magnesio durante 1 hora a 37 ° C. Alternativamente, la fibronectina se puede aplicar el día antes del análisis mediante la incubación de los PDMS con 10 mg / ml de fibronectina en PBS durante 16 horas a 4 ° C. Asegúrese de que toda la superficie se sumerge en el fibronectina en solución PBS.
2. Preparar desnaturalizado por calor 1% de BSA. Pesar 0,5 g de BSA y se disuelven en 50 ml de PBS.Filtrar esterilizar la solución a través de un filtro y el calor de 0,22 micras a 80 ° C durante 12 min.
   Nota: Prepare esta solución el día antes de la célula de recubrimiento y se almacena a 4 ° C.
3. Aspirar la solución de fibronectina y lavar 3 veces con PBS. Añadir 1 ml de BSA desnaturalizado calor en PBS a cada pocillo e incubar durante 30 min a TA.
4. Trypsinize y contar las células de elección, mientras que las cámaras de durotaxis están bloqueando con la BSA desnaturalizado por calor.
5. Plate 1 x 10 ⁵ células en un volumen de 2 ml en cada pocillo de la cámara durotaxis, utilizando los medios necesarios para el tipo de célula particular de elección. Permitir que las células se adhieran y se extendieron sobre el sustrato durante 4 horas en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO _2.
   NOTA: las células U2OS se mantienen rutinariamente en DMEM con 10% FBS, complementado con 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, y 10 IU / ml de penicilina, 10 mg / ml de estreptomicina.
   NOTA: El número de células utilizado en este ejemplo está optimizado paraCélulas U2OS. Se puede requerir optimización para otros tipos de células. Esta densidad de las células da suficiente espacio para migrar sin interacciones significativas con otras células.

Imaging 3. Células vivas

1. Realizar imágenes de células vivas en un microscopio invertido, con contraste de fase con un objetivo de 10X. El microscopio debe estar equipado con una, cámara húmeda del medio ambiente cerrado, lo que permite el control de la temperatura a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante la exploración a largo plazo.
2. Después de que las células se han extendido durante aproximadamente 3,5 horas, montar la placa en la cámara microscopio. Permitir que la muestra (s) se equilibre en la cámara durante 30 min.
3. Establecer automatizado, multi-punto de visita en el microscopio si está disponible. Centrarse en la interfaz entre las 90: 1 PDMS y el cubreobjetos de vidrio y elegir los puntos a la imagen en todo el interfaz con un promedio de 40 puntos por durotaxis cámara. Imagen de las células cada 10 min durante un máximo de 16 horas.
   NOTA: La reregión de interés aparecerá como dos líneas, con la línea externa correspondiente al borde del cubreobjetos y la línea interior correspondiente a la interfaz real entre el PDMS y el cubreobjetos. Ver Figura 1B.

Análisis 4. Datos

1. Generar una hoja de cálculo como en la Tabla 1.
2. Cuente el número de eventos de cruce de los PDMS a la superficie de vidrio y viceversa de cada película generada. Anote el número de eventos de cruce en la columna correspondiente en la hoja de cálculo Excel.
   NOTA: Un evento de cruce se define como el núcleo de la célula que pasa sobre el límite entre el PDMS y productos de vidrio en cualquier dirección.
3. Para cuantificar múltiples cruces, contar el número de veces que el celular cruzó la interfaz. Ese número se debe registrar en la columna de excel correspondiente al sustrato sobre el que la célula se encuentra en el extremo de la película. Repita el análisis de todas las células que atraviesa la interfaz en tpelícula que él. Excluir las células que migran fuera del campo de visión durante la exploración.
   NOTA: También es importante verificar, por recuento de células al inicio del experimento, que las células son capaces de adherirse igual a los PDMS recubiertas de fibronectina y superficies cubreobjetos de vidrio.
4. Calcular el porcentaje de células que migró de PDMS a la superficie de vidrio (es decir, se sometió a durotaxis). Añadir el número de cruzar eventos de suave a duro y los múltiples eventos de cruce que terminaron en el disco y se dividen por el número total de eventos de cruce.
5. Calcular el porcentaje de múltiples cruces dividiendo el número de cruces de múltiples por el número total de cruces.

Un diagrama esquemático de la cámara de durotaxis se muestra en la Figura 1A. Sustrato PDMS Soft (a 90: mezcla 1 de la base de PDMS a reticulante soluciones) se extiende en una placa de 6 pocillos y un cubreobjetos de vidrio se coloca en la parte superior de los PDMS, que luego cubre parcialmente la superficie superior del cubreobjetos, creando de este modo una interfaz entre los dos sustratos de diferente cumplimiento. La rigidez del sustrato PDMS blando es ~ 1 kPa, que es comparable con el cumplimiento típico de tejido cerebral, mientras que la rigidez de vidrio es alrededor de 1-2 GPa ^1. Una imagen de contraste de fase de la interfaz entre el PDMS y el vidrio se muestra por las puntas de flecha blancas en la Figura 1B. Los asteriscos denotan dos células de ARNi de control que migran hacia el sustrato más difícil. El borde desigual que puede ser visto (flecha negro) corresponde al borde del cubreobjetos.

Para cuantificar los datos, una hoja de cálculo Microsoft Excel debe ser generado como en la Tabla 1 </ strong>. El número de eventos de cruce debe ser contado y organizó en la columna correspondiente. Algunas de las películas generadas no puede ser utilizado para la cuantificación. Una película puede omitirse de cuantificación si hay una burbuja en el PDMS que interfiere con un progreso células o si las células son demasiado densas, dando como resultado colisiones que pueden influir drásticamente direccionalidad celular. La división celular también debe controlarse, ya que esto también puede influir abiertamente el movimiento celular.

Típicamente, los tipos de células más adherentes se migran preferentemente hacia un sustrato más rígido ^2,4,12. Para comenzar a entender el mecanismo molecular por el cual las células responden a las señales mecánicas en su entorno, proteínas específicas pueden ser derribados usando siRNA. En nuestro ejemplo, alrededor del 70% de las células siRNA tratados de control exhibió durotaxis Figura 2A. En marcado contraste, cuando cdGAP fue derribado utilizando RNAi, las células tenían ninguna preferenciaen cuanto a si emigraron a la fuerza con la figura sustrato 2A. Además, las células desmontables cdGAP cruzaron la frontera varias veces, mientras que las células tratadas de control siRNA generalmente sólo cruzaron la frontera una vez, la figura 2B. Pistas representativos de células siRNA control muestran que las células en general, migran a través del límite de una vez y preferentemente se quedaron en la superficie más rígida en comparación con las células tratadas con siRNA cdGAP que no demuestran una preferencia por cualquiera de rigidez y cruzaron la frontera varias veces la figura 2C.

Figura 1. Esquema de la cámara de Durotaxis configurar. (A) Soft PDMS se extiende en cada pocillo de una placa de 6 pocillos y un cubreobjetos de vidrio se coloca en la parte superior de los PDMS. Los PDMS se invadir lo largo de los lados de la parte superior del cubreobjetos, befde mineral se endurece, para formar una interfaz entre los dos sustratos. Durotaxis se determina al anotar la direccionalidad de las células que cruzan la interfaz de PDMS / vidrio. Imagen de contraste de fases representativo que muestra la interfaz entre los PDMS suaves y sustrato de vidrio rígido (B). Los asteriscos indican las células U2OS RNAi tratados de control sometidos durotaxis. Las puntas de flecha blancas denotan la interfaz entre el PDMS y cubreobjetos de vidrio y la flecha indica el borde del cubreobjetos de vidrio bajo el PDMS. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Esquema de Microsoft Excel hoja de cálculo para este compromiso. Las columnas se establecen para incluir el número de películas, siRNA utilizado, el número de células que migraron de los PDMS blandosal sustrato rígido de vidrio o viceversa, así como el número total de células analizadas. Las columnas también se establecen para las células que cruzan la interfaz varias veces y terminan en cualquiera de los PDMS blandos o el sustrato de vidrio. Si una célula migra a través del límite varias veces, el número de eventos múltiples de cruce de estas células se registra en la columna del sustrato sobre el que la célula se encuentra en el extremo de la película.

Figura 2. Desmontables de cdGAP en células U2OS causa una pérdida de durotaxis. Las células de control tratadas siRNA (A) migran preferentemente sobre el sustrato de vidrio rígida, mientras que las células tratadas cdGAP siRNA no mostraron ninguna preferencia. Células tratadas (B) Control siRNA cruzaron la frontera entre el PDMS y vidrio una vez. Sin embargo, las células tratadas con RNAi cdGAP emigraron hacia atrás y adelante a través de la boundary varias veces. (C) Pistas de células representativas tratados con control o cdGAP siRNA se generaron usando el plugin de seguimiento manual en ImageJ. Los valores de p se determinaron mediante la prueba t de estudiante y barras de errores representan el intervalo de confianza del 95%. Reproducido con permiso del Wormer et al. 2014 ^11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí se describe un ensayo simple para estudiar durotaxis en la migración de las células. Una de las principales de este ensayo es la facilidad de preparación de las cámaras durotaxis utilizando PDMS. La rigidez de los sustratos puede ser manipulado fácilmente cambiando la relación de la solución de base de PDMS a reticulante para permitir el estudio de diversas rigideces en el ensayo. Sin embargo, una limitación potencial del sistema es que las células sólo están expuestos a un solo cambio en la rigidez del sustrato en lugar de experimentar un gradiente de rigidez que es proporcionada por sistemas más sofisticados ^4. Es importante destacar que, a diferencia de los sustratos de poliacrilamida, los componentes de ECM no tienen que ser químicamente reticulado a PDMS. De hecho, el recubrimiento de fibronectina es aproximadamente equivalente tanto en los PDMS y las superficies de vidrio, tal como se determina por tinción con un anticuerpo específico para la fibronectina ^11. Dado que los estudios anteriores han demostrado que las células se comportan de la misma en cualquiera de PDMS o sustratos de poliacrilamida, el uso of PDMS sustratos proporciona un modelo mucho más fácil con el que estudiar mecanotransducción en las células ^10,12.

El paso más importante en la preparación de los sustratos de PDMS es asegurar que la base y las soluciones reticulantes se mezclan a fondo. Si no se mezclan bastante bien, entonces los sustratos no curarán completamente tras el tratamiento térmico. Esto resultará en el cubreobjetos que se hunde demasiado lejos en el PDMS o el cubreobjetos a la deriva en los PDMS durante la exploración. Si la fuerza de centrifugación es demasiado alta, las soluciones de base y el reticulante se puede separar en el tubo. Esto puede remediarse mediante la reducción de la velocidad de centrifugación o por desgasificar la mezcla durante 30 min usando una cámara de vacío. Por último, la densidad celular es crítico, ya que demasiadas células influirán en su capacidad de propagarse totalmente y para durotax sin obstáculos por el contacto con las células vecinas. La densidad reportada en este documento se ha optimizado para las células U2OS. Sin embargo, si se utilizan otros tipos de células, cel óptimanúmeros l tendrán que ser determinado empíricamente.

Hemos utilizado recientemente este ensayo para estudiar cómo la adhesión focal proteína de señalización cdGAP regula mechanosensing y durotaxis ^11. Claramente, hay numerosos componentes celulares, además de las adhesiones focales, tales como elementos del citoesqueleto, componentes tráfico de proteínas y canales iónicos que están involucrados en la señalización mecánica y por lo tanto también puede contribuir a la regulación de durotaxis ^13-15. Cada uno de estos componentes podría evaluarse fácilmente en nuestro sistema utilizando enfoques similares RNAi. Además, este ensayo es muy susceptible a la introducción de diversos activadores o inhibidores farmacológicos. El ensayo también se puede adaptar para permitir formas más sofisticadas de análisis, tales como la incorporación de proteínas etiquetadas con fluorescencia, en combinación con FRET o FRAP enfoques, para estudiar la dinámica de proteínas y la activación espacio-temporal.

The authors have no conflicts to disclose.

Este trabajo es apoyado por el NIH R01 GM47607, CA163296 y NSF 1.334.493 de CET. Damos las gracias a los miembros del laboratorio Turner para la lectura crítica del manuscrito. Todos los datos que se muestran en este informe fueron reproducidas con permiso de Wormer et al. 2014 ^11.