为评估细胞Mechanosensing和Durotaxis简化系统

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

细胞外基质的成分和机械性能是组织类型之间高度可变。此结缔组织基质多样性大大影响细胞的行为，以调节正常和病理过程，包括细胞增殖，分化，粘附信令和定向迁移。在这方面，某些细胞类型的固有能力，以移向称为durotaxis较硬的，或更少的标准矩阵衬底。这种现象扮演胚胎发育，伤口修复和肿瘤细胞入侵期间起重要作用。这里，我们描述一个简单的试验来研究durotaxis， 在体外，用聚二甲基硅氧烷（PDMS）的基板。的描述durotaxis腔室准备创建相对软的PDMS凝胶和刚性玻璃盖玻片之间的刚性的接口。在提供的例子中，我们已经使用了这些durotaxis室展示为CDC42作用/ Rac1的GTP酶激活prote在，cdGAP，在mechanosensing和人类U2OS骨肉瘤细胞durotaxis调节。该测定是易于适应其它类型的细胞和/或利益的其他蛋白质的敲低，探讨在mechanosignaling和durotaxis各自的作用。

细胞外基质（ECM）是由结构和交联蛋白，包括胶原蛋白，纤连蛋白和层粘连蛋白的一系列复杂的。虽然它是公认的对ECM提供了细胞组织重要的结构支承，有越来越多的证据表明，细胞积极应对物理变化在其细胞外基质环境来调节多种细胞过程，包括细胞存活，分化和细胞迁移。例如，在ECM的刚性差异能驱动间充质干细胞向不同谱系，具有柔软基材（〜1千帕）促进神经谱系而僵硬（〜25千帕）衬底促进成骨分化^1。同样地，增加间质基质刚性已经显示出促进乳腺上皮细胞肿瘤的发生和侵袭到周围组织^2,3。

这mechanosign的一个特别有趣的方面阿玲活性导致称为durotaxis，其中细胞优先迁移朝着更刚性基板^4,5的处理。细胞不断通过整联蛋白受体感知它们的胞外环境的物理特性结合到ECM。这，反过来，促使许多结构性和信号蛋白的积累到其胞质结构域，以驱动被称为粘着斑或局灶性触点^6,7-粘合剂结构的形成。 自整联没有固有的酶活性，信号是从ECM中继通过这些辅助蛋白来协调细胞的反应其变化的环境^8。因此，参与调节mechanosignaling和durotaxis关键蛋白质的鉴定和表征是调查的一个重要领域。

各种模型系统已被开发，研究durotaxis 体外 ，但最有利用胶原包被的聚丙烯酰胺基质^4。然而，聚丙烯酰胺基片的制备中可以是技术上具有挑战性并在这些试验中使用的胶原必须是化学交联到基底^9。聚二甲基硅氧烷（PDMS）基片已被证明表现出的聚丙烯酰胺^基片10可比机械性能。然而，PDMS衬底被通过简单地混合碱的比率来制备交联剂和这些基片可以涂有ECM蛋白无需化学交联，从而使PDMS一个更简单的工具，研究刚性对细胞行为的影响。在此，我们介绍如何编写一个简单durotaxis室，其中软PDMS基板集成了硬质玻璃盖玻片。

该法，如下所述，为研究durotaxis一种快速，简便的方法。在这项研究中，我们使用人类U2OS骨肉瘤细胞结合的siRNA介导cdGAP击倒研究在durotaxis ¹¹本黏着蛋白的作用。重要的是，该协议可以很容易地适应个人的要求。其它细胞类型可被取代的U2OS细胞和任何蛋白质可以被击倒或过表达，以确定在durotaxis对细胞行为的影响。此外，该协议可以适于掺入荧光标记的蛋白来分析他们的动态和用FRAP行为或FRET方法。

1.准备Durotaxis商会

1. 为了制备1 6-孔组织培养板，去皮用50毫升锥形管中的平衡。称取约10克，在50毫升试管中的PDMS碱溶液中（该溶液是非常粘稠）。
2. 对于90:1的衬底（符合性〜1千帕），通过90分在管与PDMS碱溶液的测定重量来确定的交联剂溶液所需的正确的金额。与PDMS交联剂溶液的计算量添加到同一管中。
   例如:10克/ 90 = 0.11克。添加0.11克PDMS交联剂溶液与PDMS碱溶液。
   注意:基地和交联剂溶液在试剂盒的PDMS都提供。
3. 大力5分钟在RT使用小刮勺混合PDMS基/交联剂混合物。在这个阶段，混合物将含有大量气泡。
4. 离心机在台式离心机5分钟的PDMS衬底在50×g离心在RT以除去泡泡糖BLES。在5分钟，离心后重新如果仍有气泡。
5. 吸管1毫升90:1的PDMS衬底进入组织培养的每孔处理的6孔板中。存在于PDMS任何残留的气泡可以在本阶段通过使用21g的针弹出它们被消除。允许PDMS散布在井30分钟。
6. 煮沸12个毫米的玻璃＃1盖玻片在蒸馏水中5分钟。重复两次，并存储在蒸馏水盖玻片。
7. 放置一个，干燥盖玻片进入组织培养板的各孔中，轻轻触摸盖玻片一侧插入的PDMS溶液然后删除盖玻片上的PDMS。作为盖玻片沉降，与PDMS将开始侵占过盖玻片边缘，但不会完全覆盖它。这将产生固化后的PDMS和玻璃之间的界面（见图1A 中的B）。
8. 孵育板在70℃的烘箱中16小时以固化（硬化）的PDMS。放置高原E在细胞培养罩和紫外线消毒10分钟。
   注意:最好是在使用了几天做出板。然而，板可以包在石蜡膜而没有任何缓冲，并储存在4℃达2周没有任何质量明显下降。

2.细胞电镀

注意:如果学习siRNA-介导击倒的效果，执行使用制造商的说明或所选择的细胞类型的优化的协议的击倒。

1. 涂层的每个durotaxis室用1毫升10微克/毫升纤连蛋白在PBS无钙和镁的1小时，在37℃。替代地，纤连蛋白可以在天在4℃下施加在分析前通过将与PDMS用10微克/毫升纤连蛋白在PBS中16小时。确保整个表面浸没在在PBS溶液中的纤连蛋白。
2. 制备热变性1％BSA中。称取0.5克BSA，溶于50毫升的PBS。过滤消毒通过0.22微米的过滤器和热的溶液，在80℃下12分钟。
   注意:准备该溶液与细胞电镀和储存在4℃下之前的一天。
3. 吸出纤连蛋白溶液和洗涤3次，用PBS洗涤。在PBS中添加1 ml热变性BSA的每个孔中，温育30分钟，在室温。
4. Trypsinize和计数选择的细胞，而durotaxis室阻挡的热变性BSA。
5. 板^1×10 5个细胞在一体积为2ml进入durotaxis室的每个孔中，使用所需的选择的特定细胞类型的介质。使细胞附着并在培养箱散布在基板上4小时，在_37℃，5％的CO 2。
   注:U2OS细胞例行维持在含10％FBS补充了2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，和10国际单位/毫升青霉素，10微克/毫升链霉素。
   注意:在本实施例中所用的细胞数目为优化U2OS细胞。可能需要优化的其他类型的细胞。该密度使细胞足够的空间，而无需与其他细胞相互作用显著迁移。

3.活细胞成像

1. 在倒置显微镜下进行活细胞成像，使用了10X物镜相衬。该显微镜应装有一个封闭的环境，加湿室，允许温度的期间长期成像控制，在37℃和_5％的CO 2。
2. 在细胞已经扩散约3.5小时，组装板显微镜室。使样品（多个）在腔室中平衡30分钟。
3. 设置自动，多点来访显微镜上（如果可用）。聚焦90之间的界面上:1的PDMS和玻璃盖玻片并选择各地，平均每durotaxis室40点的接口点图像。图像将细胞每10分钟达16小时。
   注:重感兴趣只园将显示为两行以对应于盖玻片边缘和对应于PDMS和盖玻片之间的实际接口的内线路的外线路。参见图1B。

4.数据分析

1. 生成的电子表格，如表1。
2. 算的交叉事件从PDMS从生成的每个电影的玻璃表面，反之亦然数。记录在Excel电子表格相应列的交叉事件的数量。
   注意:交叉事件被定义为细胞核越过PDMS和玻璃在任一方向的边界。
3. 量化多个道口，计数细胞越过界面的次数。该号码应记录在对应于在其上电池位于电影结束基板excel的列。重复分析每一个跨越接口在T细胞他的电影。排除出视场的成像期间迁移的细胞。
   注:同样重要的是，以验证，通过细胞在实验开始时算起，该细胞能够同样附着在纤连蛋白涂覆的PDMS和玻璃盖玻片表面。
4. 计算细胞的从PDMS迁移到玻璃表面（即，经历durotaxis）的百分比。添加渡从软到硬且倍数交叉事件，通过交叉事件的总数结束了硬和分裂事件的数目。
5. 通过将多个横跨的数目由交叉的总数计算的多个交叉的百分比。

所述durotaxis室的示意图示于图1A。软PDMS衬底（90:1的混合物的PDMS碱与交联剂溶液）被铺在6孔皿，玻璃盖玻片放置在PDMS，然后部分地覆盖盖玻片的上表面的顶部上，从而产生一个接口不同的顺应的两个基板之间。软PDMS基板的刚性是〜1千帕，这与脑组织的典型合规性，而玻璃的刚性是大约1-2 GPA ^1。所述PDMS和玻璃之间的界面的相衬图像显示由白色箭头在图1B。星号表示两个控制RNA干扰细胞对硬的基体迁移。的参差不齐的边缘，该边缘可以看出（黑色箭头）对应于盖玻片的边缘。

量化数据，Microsoft Excel电子表格应生成如表1中</ STRONG>。交叉事件的数量应计入并组织相应的列。一些产生的电影不能被用于定量。电影可以从量化省略，如果有在PDMS中的气泡，与一个细胞进展干扰，或者如果将细胞过于密集，导致碰撞，可以大幅度地影响细胞方向性。细胞分裂还应进行监测，因为这也可以公开影响细胞的运动。

通常情况下，大多数贴壁细胞类型将优先迁移朝更严厉的衬底^2,4,12。为了理解的分子机制，其中机械线索在其环境中的细胞反应，特异性蛋白质可以使用​​的siRNA被击倒。在我们的例子中，大约70％的对照siRNA处理的细胞展出durotaxis 图2A。在鲜明的对比，当cdGAP用RNA干扰击倒，细胞没有偏好他们是否迁移到硬或软基质图2A。此外，cdGAP击倒细胞越过边界多次，而对照siRNA处理的细胞一般只能越过边界一次， 图2B。对照siRNA细胞的代表曲目表明，细胞横跨一次及优先停留在较为刚性表面相比，cdGAP siRNA处理细胞并没有表现出偏爱要么刚性和越过边界多次图2C的边界通常迁移。

图1原理图Durotaxis室设置的。（A）的软PDMS铺展在6孔培养皿的每个孔中，并在玻璃盖玻片放置在PDMS的顶部。在PDMS将染指过盖玻片顶部的两侧，BEF矿石它变硬，以形成在两个基片之间的界面。 Durotaxis通过刻划细胞渡PDMS /玻璃界面的方向性来确定。 （B）中示出的软PDMS和硬质玻璃基板的界面代表相衬图像。星号显示控制RNA干扰治疗的U2OS细胞进行durotaxis。白色箭头表示PDMS和玻璃盖玻片和箭头之间的接口指示下，PDMS玻璃盖玻片的边缘。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1. Microsoft Excel电子表格的原理建立起来。列被确定为包括电影的数量，使用的siRNA，细胞从柔软的PDMS迁移数量到硬质玻璃基板，或反之亦然，以及细胞分析的总数。列也设置为跨越所述接口多次，并结束在任一软PDMS或在玻璃基板的细胞。如果一个小区跨越边界多次迁移，这些细胞的多个交叉事件的数目被记录在基片在其上电池位于电影结束的列中。

在U2OS细胞图2击倒cdGAP会导致durotaxis的损失。（A）对照 siRNA处理的细胞优先迁移到硬质玻璃基板，而cdGAP siRNA处理的细胞没有显示出任何偏好。 （B）的对照siRNA处理的细胞越过PDMS和玻璃一次之间的边界。然而，cdGAP的RNAi处理的细胞迁移的来回将boundary多次。代表性的细胞（C）曲目用对照治疗，或cdGAP的siRNA用手动跟踪插件ImageJ的中产生。的p值是使用学生氏t检验确定的和错误棒代表95％置信区间。从Wormer 等。2014年¹¹转载的许可。 请点击此处查看该图的放大版本。

在此我们描述了一个简单的实验来研究durotaxis在细胞迁移。此法的主要优势是易于使用准备PDMS中durotaxis室的。基片的刚性可以通过改变碱的PDMS溶液的比率交联剂，以允许在测定中的各种刚性的研究很容易被操纵。然而，该系统中的一个潜在的限制是，细胞仅暴露于基板的刚性的单一变化，而 ​​不是经历由更复杂的系统⁴提供一个刚性梯度。重要的是，不象聚丙烯酰胺基质中，ECM组分不必是化学交联至PDMS。的确，纤连蛋白涂层近似等于上都PDMS和玻璃表面，如通过使用特定于纤维连接蛋白¹¹抗体染色来确定。由于以前的研究表明，细胞具有相同的行为在任PDMS或聚丙烯酰胺基质，采用Ò˚FPDMS基板提供了一个更容易的模型来研究机械传导细胞^10,12。

在的PDMS衬底的制备中最重要的步骤是确保在基座和交联剂溶液充分混合。如果他们没有充分混合足够的话，基板不会完全经热处理固化。这将导致在盖玻片下沉太远进入PDMS或成像期间盖玻片漂流在PDMS中。如果离心分离力过高，基体和交联剂溶液可以分离在管。这可以通过减小离心速度或通过使用真空室30分钟脱气混合物进行补救。最后，细胞密度是非常关键的，因为太多的细胞会影响其传播充分和不受阻碍地durotax通过接触与邻近细胞的能力。本文所报道的密度为U2OS细胞进行了优化。然而，如果其它类型的细胞时，最佳的cel升号码将不得不凭经验确定。

最近，我们用这个实验来研究如何黏着信号蛋白cdGAP调节mechanosensing和durotaxis ^11。显然，有除了粘着斑，如细 ​​胞骨架元件，蛋白质运输组件和离子通道参与机械信令并且因此也可能有助于durotaxis ¹³的调节许多细胞成分^{- 15。}每个组件可以在我们的系统中使用类似的RNAi方法容易地进行评价。此外，这个实验是非常适合于引进各类药物激活剂或抑制剂。该分析还可以适于允许分析的更复杂的形式，如荧光标记的蛋白质的掺入，结合FRET或FRAP方法，研究蛋白质动力学和时空活化。

The authors have no conflicts to disclose.

这项工作是由美国国立卫生研究院R01 GM47607，CA163296和NSF 1334493至CET支持。我们感谢特纳实验室成员的手稿批判性阅读。本报告中显示的所有数据均来自Wormer 等2014 ¹¹转载许可。