Medición de daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón Después crónica

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Exposición a la radiación en dosis bajas puede producir una variedad de efectos biológicos que son diferentes en cantidad y calidad de los efectos producidos por dosis altas de radiación. Abordar las cuestiones relacionadas con la seguridad ambiental, ocupacional y de salud pública de una manera adecuada y científicamente justificada en gran medida se basa en la capacidad de medir con precisión los efectos biológicos de los contaminantes de dosis bajas, tales como sustancias químicas y radiación ionizante. Daños en el ADN y la reparación son los más importantes indicadores tempranos de riesgos para la salud debido a sus posibles consecuencias a largo plazo, tales como el cáncer. Aquí se describe un protocolo para estudiar el efecto de la crónica exposición in vivo a dosis bajas de γ- y β-radiación en daños y reparación del ADN en las células de bazo de ratón. Utilizando un marcador comúnmente aceptada de ADN de doble filamento se rompe, la histona H2AX fosforilada llamado γH2AX, se demuestra cómo se puede utilizar para evaluar no sólo los niveles de daño en el ADN, pero también cambiaen la capacidad de reparación del ADN potencialmente producido por una baja dosis de exposición in vivo. La citometría de flujo permite la medición rápida, precisa y fiable de immunofluorescently marcado γH2AX en un gran número de muestras. Reparar el ADN de doble filamento romper puede evaluarse mediante la exposición de esplenocitos extraídos a una dosis de 2 Gy reto de producir un número suficiente de ADN se rompe para desencadenar la reparación y midiendo la inducida (1 hora después de la irradiación) y daño del ADN residual (24 hrs después de la irradiación). Daño en el ADN residual sería indicativo de reparación incompleta y el riesgo de la inestabilidad genómica a largo plazo y el cáncer. Combinado con otros ensayos y puntos finales que pueden ser fácilmente medidos en tales estudios in vivo (por ejemplo, las aberraciones cromosómicas, frecuencias de micronúcleos en reticulocitos de la médula ósea, la expresión de genes, etc.), este enfoque permite una evaluación precisa y contextual de los efectos biológicos de los factores de estrés de bajo nivel.

Controversia significativa sobre los posibles efectos nocivos de cualquiera de las dosis bajas o muy bajas de radiación y el temor del público de la radiación, impulsado por las imágenes de los bombardeos atómicos de Hiroshima y Nagasaki y de accidentes en plantas nucleares raras ionizante (exacerbada por los medios de comunicación), ha dado lugar a muy estricta regulación de la protección radiológica y normas que potencialmente no son científicamente justificada. En las tres últimas décadas, numerosos informes han documentado tanto la falta de perjudicial y la presencia de efectos biológicos potencialmente beneficiosos inducidos por la radiación de baja dosis ^1-4. El factor de riesgo para la salud de radiación mayor es la probabilidad de cáncer, que se calcula sobre la base de los estudios epidemiológicos de sobrevivientes de las bombas atómicas que reciben dosis altas o medianas de la radiación. Linear extrapolación de estos datos (los llamados lineal-no-umbral o modelo LNT) se utiliza para estimar los riesgos de cáncer a dosis bajas. Sin embargo, este enfoque no ha recibido la aceptación científica mundialy está fuertemente debatido ^5.

Es evidente que se necesitan más estudios para aclarar esta cuestión y, posiblemente, mejorar las normas de protección radiológica. Tales estudios deben incluir tratamientos crónicos (mejor aproximación de las exposiciones ambientales y ocupacionales), en modelos animales in vivo (en el mejor de los efectos para la salud humana) y la extrapolación de estos puntos finales como los tipos de daño en el ADN, la reparación del ADN y mutagénesis. Se sabe que el ADN es el principal objetivo de dañar efectos de la radiación y incompletos o mis-reparación puede conducir a mutagénesis y cáncer de desarrollo ^6.

Roturas de doble hebra de ADN (OSD) son uno de los tipos más perjudiciales de las lesiones del ADN y pueden conducir a la muerte celular y tumorigénesis ^7. Es, por lo tanto, importante para ser capaz de medir de forma fiable y precisa el nivel de DSB después de la exposición a bajas dosis de radiación y / o otros factores de estrés, tales como contaminantes químicos. Uno de los marcadores más sensibles y específicosde DSB de ADN es la histona H2AX fosforilada, llamado γH2AX ^8, sin embargo, otros marcadores y métodos Se han sugerido ^9,10. Se estima que miles de moléculas de H2AX, en las proximidades de un OSD inducida, están implicados en la formación de γH2AX que permite la detección de individuo OSD, mediante el etiquetado de inmunofluorescencia con un anticuerpo y microscopía de fluorescencia anti-γH2AX ^11. La respuesta es muy rápida, alcanzando su máximo entre 30 y 60 min. Existen pruebas de que γH2AX facilita la reparación de DSB de ADN mediante la atracción de otros factores de reparación a los sitios de las pausas y al modificar la estructura de la cromatina para anclar los extremos de ADN rotos y facilitar el acceso de otras proteínas de reparación (revisado en ^12). Sobre la terminación de la reparación de DSB de ADN, se γH2AX De fosforilada y / o se somete a la degradación, y las moléculas recién sintetizadas H2AX reemplazar γH2AX en las zonas afectadas de la cromatina ^10. La formación y la pérdida de γH2AX Vigilancia puede,por lo tanto, proporcionar una estimación precisa de la cinética de reparación del ADN OSD. Este enfoque ha sido utilizado para estudiar la reparación de DSB en diversas líneas celulares tumorales humanas irradiadas con altas dosis de radiación y su tasa de OSD y los niveles residuales se han demostrado que se correlaciona con la radiosensibilidad ^13-15.

Hemos modificado este enfoque experimental y lo aplicamos a un estudio en ratones in vivo para examinar los efectos de las dosis bajas de γ- crónica y β-irradiación en los niveles de ADN del OSD y reparación (Figura 1). En primer lugar, demostramos un método para realizar una exposición crónica a largo plazo de ratones para β-radiación sea emitida por tritio (hidrógeno-3) en forma de agua tritiada (HTO) o como tritio orgánico (OBT) disuelto en el agua potable . Se espera que las dos formas de acumular y / o distribuir de manera diferente en el cuerpo y por lo tanto, producir diferentes efectos biológicos. Ambas formas son posibles peligros en la industria nuclear. Este tratamientoes paralelo por la exposición crónica a la radiación γ-a una tasa de dosis equivalente para permitir una correcta comparación de los dos tipos de radiación, que es crucial para la evaluación de su eficacia biológica relativa. Beta-radiación se compone de electrones, lo que es muy diferente de la γ-radiación, fotones de alta energía. Debido a esta diferencia, Β-radiación representa peligro para la salud principalmente interna y puede producir diferentes efectos biológicos en comparación con γ-radiación. Esta complicación se tradujo en controversias significativas sobre la regulación de la exposición a β-radiación emitida por OTA. Por lo tanto, los niveles de regulación de HTO en el agua potable para el público varían de 100 Bq / L en Europa a 75.000 Bq / L en Australia. Es, por lo tanto, importante para comparar los efectos biológicos de HTO a dosis equivalentes de γ-radiación. En segundo lugar, la tasa de DSB de ADN se mide en esplenocitos aislados a la finalización de las exposiciones crónicas usando immunofluorescently marcado γH2AX detectared por citometría de flujo. Esto permite la evaluación de la extensión del daño de ADN infligido por las exposiciones in vivo. Sin embargo, es razonable esperar que tales exposiciones de bajo nivel pueden no producir ningún tasas detectables de ADN OSD; en cambio, / puede esperarse algunos cambios ocultos respuestas que afectaría a la capacidad de las células para reparar el daño del ADN. Estos cambios, si se encuentra, pueden ser o bien estimulador (produciendo un efecto beneficioso) o inhibidor (produciendo un efecto perjudicial). El protocolo propuesto permite revelar tales cambios desafiando a los esplenocitos extraídos con una alta dosis de radiación que produce una cantidad significativa de daño (por ejemplo, 2 Gy producir aproximadamente 50 DSB de ADN por célula o un 3 -. Incremento de 5 veces en nivel total γH2AX) . Posteriormente, la formación y la pérdida de γH2AX, lo que refleja el inicio y la finalización de la reparación de DSB, se controla mediante citometría de flujo. De esta manera, no sólo basal y los niveles inducidos por el tratamiento de DSB de ADN pueden medirse, perotambién su efecto potencial sobre la capacidad de las células para responder y daño del ADN inducido por la reparación de los niveles estresantes mucho más altas.

Todos los procedimientos de manipulación y tratamiento de ratones deben adherirse a las normas establecidas por los programas de la legislatura y / o cuidado de los animales y aprobados por un comité local de cuidado de animales. Todos los métodos descritos en este protocolo se realizaron de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales, con la aprobación del comité local de cuidado de animales.

ATENCIÓN: Todos los trabajos con radiactividad (incluyendo, pero no limitado a la manipulación de tritio, γ-irradiación externa, la manipulación de tejidos animales, residuos radiactivos de cama) deben adherirse a las normas establecidas por las autoridades de la legislatura y / o de protección radiológica y se realizará por personal autorizado personal de un laboratorio y / o instalación certificada.

1. Trabajar Animal

1. Agrupación Animal
   1. Si los ratones están llegando de una organización externa, aclimatar animales durante al menos 10 días en el animalario. Si el estudio incluye múltiples grupos de tratamiento, asegúrese de que el proveedor de los animales puede enviar all animales como un solo lote.
   2. Asignar aleatoriamente los ratones a grupos de tratamiento de 10 ratones por grupo. Si el uso de ratones macho de la cepa C57BL / 6, que el proveedor de los animales pre-organizar aleatorización de muy corta edad C57BL / 6 machos en sus instalaciones para mitigar problemas de agresión.
2. La exposición crónica de ratones de β-radiación interna
   1. Preparar las concentraciones de trabajo de tritio (10 kBq / L y 1 MBq / L) en el agua potable de ratón mediante la dilución de la población original de HTO y OBT (una mezcla de prolina tritiada, alanina y aminoácidos glicina) soluciones.
   2. Validar las concentraciones finales de tritio en el agua potable mediante la medición de la radiactividad utilizando un contador de centelleo líquido. Ajuste concentraciones, si es necesario.
   3. Tratar a los animales durante un mes mediante el acceso ad libitum al agua tritio. Si el agua de tratamiento se baja durante el período de dos semanas, añada más agua. De lo contrario, cambie las botellas a las dos semanas.
   4. Farsa irradiado Tratar de controlratones idénticamente. Manténgalos en una habitación "limpia" separada o en un estante separado "limpio" bajo la presión de aire positiva para evitar tritio contaminación cruzada desde el aire.
3. La exposición crónica de ratones a la radiación externa γ-
   Nota: facilidad de γ-irradiación / equipo variará dependiendo de la ubicación.
4. El uso de métodos disponibles de dosimetría, determinar las distancias de una fuente γ-radiación que tienen campos de radiación que producen las dosis deseadas. Garantizar la homogeneidad de los campos de radiación dentro de las áreas que cubren las jaulas de los animales.
   Nota: 1,7 μGy / h es equivalente a una tasa de dosis producida por 1 MBq / L tritio en el cuerpo.
5. Exponer los ratones mediante la colocación de jaulas de ratón en las distancias determinadas en el paso 1.3.1 para un mes. Minimizar interrupción diaria de la γ-irradiación a 30 min. Utilice dosímetros de termoluminiscencia para medir dosis total absorbida.

2. Sacrificio y Muestreo

1. Preparar instrumentos quirúrgicos estériles, 60 mm placas de Petri con coladores insertados celulares 70 micras, 15 ml y tubos de 1,5 ml, medio RPMI suplementado con 5% de suero fetal bovino (FBS) y el lugar todo dentro de una cabina de seguridad biológica. Asegurar la esterilidad de la obra es crucial.
2. Dispense 5 ml de medio RPMI en cada 60 mm placa de Petri.
3. Sacrificar los ratones utilizando un método aprobado por el comité local de cuidado de los animales. Dislocación cervical es una buena opción para el trabajo de esplenocitos se describe en este protocolo. Sin embargo, si se requieren muestras de sangre para otros ensayos (por ejemplo, para el mFISH, el bloque de micronúcleos citocalasina u otros ensayos genetoxicity común), utilice la punción intracardiaca después de la anestesia con isoflurano.
4. Colocar el animal en decúbito dorsal, con la cabeza apuntando lejos de usted. Rocíe el ratón hacia abajo con etanol al 70%. Con unas pinzas, agarre la piel en sentido anterior a la abertura de la uretra y hacer una pequeña incisión con tijeras en la región perineal.
   1. De esta incisión, corte a lo largo de la línea media ventral a la cavidad torácica, teniendo cuidado de cortar solamente la piel y no la pared muscular debajo. Diseccionar la piel lejos de la línea media.
   2. Agarre la pared abdominal con fórceps y cortar a lo largo del eje medio de la pared muscular de abrir la cavidad abdominal.
5. Extirpar el bazo ligeramente agarre con pinzas estériles y suavemente tirando de él y al mismo tiempo cortando el tejido conectivo con unas tijeras.
6. Corte un pequeño trozo del bazo (aproximadamente 1/10 del bazo) y colocar en un tubo de 1,5 ml. Snap congelar en nitrógeno líquido para su posterior almacenamiento a -80 ° C para los ensayos suplementarios.
7. Coloque el resto del bazo en un filtro de células dentro de una placa de Petri de 60 mm con 5 ml de medio RPMI pre-dispensado.
8. Continúe con el siguiente ratón.
   Nota: Extraído bazos se pueden mantener en placas de 60 mm con los medios de comunicación (para un máximo de 2 horas), mientras que el resto de los ratones son Sacrificed. Dependiendo del número de personas que participan, entre 5 y 15 ratones se pueden procesar en un día.

3. Preparación de cultivos de esplenocitos

1. Homogeneizar el bazo mediante el picado dentro de un filtro de células con unas pinzas estériles con un extremo curvo.
2. Retire el filtro de células y recoger la suspensión de células se filtra desde el plato de 60 mm en un tubo de 15 ml.
3. Enjuague el filtro de células con 5 ml de medio para recoger el resto de las células.
4. Tubos de centrifugar a 300 xg durante 5 min a TA.
5. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en 10 ml de RPMI.
6. Tubos de centrifugar a 300 xg durante 5 min a TA.
7. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en 5 ml de RPMI.
8. Transferencia de 4 ml de la suspensión celular en un matraz de cultivo de 25 ml de tejido y trasladarlo a un incubador de _CO2 (37 ° C, 5% de CO _2, 80% de humedad)

4. Desafiando irradiación y Fijación

1. Transferir elrestante 1 ml de suspensión celular desde el paso 3.8 en un tubo de 1,5 ml en hielo y centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Daño en el ADN medido en esta muestra representará tanto daño inducido por el tratamiento y t = 0 de datos punto para la construcción de una curva de reparación del ADN.
2. Aspirar con cuidado el sobrenadante utilizando una bomba de vacío. Suavemente volver a suspender el sedimento en 1 ml de tampón TBS (20 mM Tris pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 2,7 mM).
3. Tubos centrífuga a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar con cuidado el sobrenadante utilizando una bomba de vacío. Suavemente volver a suspender el sedimento en 300 l de TBS.
4. Mientras se mezcla en un vórtice a baja velocidad, añadir 700 l de -20 ° C 100% de etanol. Cierre la tapa e invierta varias veces para mezclar.
5. Almacenar las muestras a -20 ° C. Los esplenocitos fijos en etanol se pueden almacenar a -20 ° C durante al menos 12 meses sin ninguna pérdida notable en la señal de γH2AX.
6. Irradiar los cultivos de esplenocitos del paso 3.8 con un desafiante γ-rad iation dosis de 2 Gy a una tasa de dosis ≥ 200 mGy / min utilizando dispositivo de irradiación disponible.
   Nota: El propósito de esta irradiación es inducir ADN OSD para desafiar la maquinaria de reparación. Los rayos X también se pueden utilizar para este propósito.
7. Inmediatamente devolver las culturas para una incubadora de CO _2.
8. 1 hora después de la desafiante 2 Gy de irradiación, retire las culturas de la incubadora a una cabina de seguridad biológica. Para recoger una alícuota de la muestra representativa, suavemente volver a suspender las células utilizando una pipeta y la transferencia de 1 ml de la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml en hielo. Devolver los cultivos celulares a una incubadora de CO _2.
9. Tubos centrífuga a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar con cuidado el sobrenadante utilizando una bomba de vacío. Suavemente volver a suspender el sedimento en 1 ml de TBS.
10. Repita los pasos 4.3 a 4.5.
11. 24 horas después de la desafiante 2 Gy γ-irradiación, cosecha y fijar en = 24 hrs muestra como se describe en el paso 4.8 a 4.10.

Nota: Por lo general, 15 a 30 muestras por día pueden immunofluorescently etiquetados y se analizaron por citometría de flujo en una sola corrida. Para garantizar una comparación exacta entre los grupos de tratamiento, incluyen la muestra (s) de cada grupo. Ver también Referencia ¹⁶ para más detalles.

1. Preparar un conjunto marcado de tubos para el número de muestras a procesar y el lugar en el hielo. Utilice 12 x 75 mm tubos de vidrio debutantes. La esterilidad no se requiere para este trabajo. Incluir una muestra de control histórica adicional para el marcaje con anticuerpo secundario solamente ("segunda Ab única"). Utilice esta muestra histórica de control en todos los citometría de flujo funcionar dentro de un estudio.
2. Añadir 0,5 ml de TBS helado a cada tubo.
3. Eliminar esplenocitos fijos de -20 ° C, vórtice durante 5 s y transferir una alícuota de 0,5 ml a tubos preparados con TBS. Coloque el resto de las muestras de vuelta a -20 ° C y almacenamientomantener como muestra de respaldo.
4. Esplenocitos centrifugar a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de hielo-frío TBS que contiene 1% de FBS
5. Células centrifugar a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 1 ml de tampón TST (0,05% de Triton X-100, 2% de FBS en TBS). Incubar durante 20 min en hielo.
6. Células centrifugar a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 200 l de anticuerpo primario anti-γH2AX diluidos 1: 150 en tampón TST. Utilice 200 l de TST para el "segundo Ab única" muestra de control.
7. Tubos de posición en un agitador que gira a un ángulo de 45 - 60 ° y agitar durante 1,5 horas a 300 xg a temperatura ambiente.
8. Mientras que los tubos están incubando, preparar un volumen suficiente (200 l / muestra) de la cabra anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con Alexa-488 en una dilución 1: 200 en tampón TST.
   Nota: Todos los trabajos que Alexa-488anticuerpo conjugado (pasos 5.10 a 5.16 más abajo) debe hacerse bajo condiciones de luz tenue y muestras etiquetadas debe protegerse de la luz, envolviendo los tubos en papel de aluminio.
9. Una vez completada la incubación 1,5 hrs, añadir 1 ml de TBS frío con hielo que contenía FBS al 2% a cada tubo y centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 1 ml de TBS que contenía 2% de FBS.
10. Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 200 l de la solución de anticuerpo secundario desde el paso 5.8.
11. Incubar las muestras en una plataforma de agitación durante 1 hora como en el paso 5.7.
12. Añadir 1 ml de TBS frío con hielo que contenía 1% de FBS.
13. Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de TBS enfriado con hielo.
14. Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 0,5 ml de TBS que contenía 50 mg / mlyoduro de propidio.
15. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz.
16. Analizar las muestras en un citómetro de flujo a través de protocolos específicos de los instrumentos ^16. Leer al menos 10.000 células por muestra.

La Figura 2 muestra ejemplos de gráficos de citometría de flujo esperados para esplenocitos preparados usando el método descrito aquí. Las células se gated primero basado en el gráfico de dispersión (Figura 2A y 2D; volumen electrónico es equivalente a dispersión frontal). Histogramas de yodo FL3 / propidio (Figura 2B y 2E) confirman la distribución del ciclo celular normal. Señal γH2AX calculado utilizando el canal FL1 promedio confirma un aumento> 2 veces en la DSB de ADN en 2-Gy células (Figura 2F) irradiados en comparación con el control sin tratar (Figura 2C). A continuación, se analizó la sensibilidad del método descrito de medir immunofluorescently etiquetada γH2AX por citometría de flujo de esplenocitos de ratón. Figura 3A muestra niveles γH2AX, indicativo de ADN OSD, en esplenocitos de ratón de 1 hora después de la exposición ex vivo ya sea bajo (0,1Gy) o alto (2 Gy) dosis de γ-radiación en relación con el control no tratado. Se puede observar que 0,1 Gy indujo un ligero aumento en el nivel de DSB y que el aumento fue estadísticamente significativa. Se esperaba que la fuerte inducción de 3 veces y se detectó después de la exposición a 2 Gy. Para validar la especificidad de etiquetado de inmunofluorescencia γH2AX como se describe en el protocolo, las células marcadas se examinaron con un microscopio de fluorescencia. El patrón de focos como marcado observado indica que la señal de fluorescencia se origina de la DSB de ADN individual dentro de la cromatina (Figura 3B).

Los resultados representativos de la evaluación de la tasa de DSB de ADN y su reparación en esplenocitos de ratones expuestos durante un mes a concentraciones muy bajas de agua tritiada (10 kBq / L) se presentan en la Figura 4. Se puede ver (Figura 4A) que, aunque la tratamiento resultó en un aumento del 10% del nivel basal γH2AX, el cambio fue sint estadísticamente significativa (N = 5, una muestra de t de Student). Además, la formación de medición y la pérdida de γH2AX después de la desafiante 2 Gy de irradiación, lo que representa la cinética de la reparación de DSB de ADN, no fue diferente entre las células del control y ratones tratados con HTO (Figura 4B).

Figura 1. Diagrama experimental para evaluar el efecto de la irradiación crónica in vivo sobre el daño del ADN y la reparación del ADN. Después del tratamiento in vivo de ratones con irradiación crónica durante un período de tiempo deseado, los ratones se sacrificaron y los cultivos de esplenocitos se establecen y expuestos a un desafío irradiación. Alícuotas de esplenocitos se recogieron y se fijaron en diversos momentos después de la dosis desafiante. Los niveles de γH2AX continuación, se midieron utilizando la inmunofluorescenciabeling y detección mediante citometría de flujo. La trama en la parte inferior de la figura es un esquema de datos esperados. Nivel-H2AX gamma aumenta drásticamente temprano después de la irradiación desafiante seguido por una disminución de nuevo al valor de control, si la reparación del ADN es completa. Daño en el ADN Δ representa el daño producido por el tratamiento experimental de ratones y Δ reparación del ADN representa el efecto del tratamiento de ratones en la capacidad de reparación del ADN OSD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fluya Figura 2. Representante citometría de datos en bruto. (A, D) Gráficos de dispersión y las regiones de activación periódica para esplenocitos y restos de células y eritrocitos. (B, E) histogramas de ADN que representan las distribuciones del ciclo celular. (C, F) γ-H2AX histograma de fluorescencia y la media de los valores de fluorescencia. Los datos en conjuntos (AC) se obtuvieron de un representante de las células del bazo de control no tratados, mientras que los datos en conjuntos (D- F) se obtuvieron a partir de células irradiadas con 2 Gy γ-radiación y cosecharon 1 hora después de la irradiación. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 3. Detección de H2AX γ por citometría de flujo es sensible y específica. (A) esplenocitos recién aislados de ratones machos CBA se irradiaron con 0,1 ó 2 Gy de γ-radiación, o sham-tratada y permitido desarrollar respuesta γH2AX durante 1 hr. Las células fueron fijadas, immunofluorescentlymarcada con anticuerpo anti-γH2AX y se analizaron por citometría de flujo. Se muestran los valores medios normalizados ± SD (N = 12). * Y *** significar diferencia estadística con p <0,05 yp <0,001, con respeto (una muestra de t-test de Student). (B) microfotografías representativas de control sin tratamiento (UT) o 2 Gy irradiado esplenocitos immunofluorescently etiquetados con anti-γH2AX anticuerpo. El patrón de los focos como de fluorescencia verde confirma la especificidad del etiquetado de inmunofluorescencia para γH2AX. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Los resultados representativos que muestran la falta de efecto producido por la exposición a 1 mes de los ratones a finales tritiadar (OTA) en el nivel y la reparación del ADN OSD. Los esplenocitos (A) fueron aisladas de ratones tratados con 10 kBq / l de HTO en animales de agua potable y de control. El nivel de γH2AX se midió usando etiquetado de inmunofluorescencia y citometría de flujo como se describe en el protocolo. La media de los niveles de fluorescencia se muestran γH2AX relación con los de control de ± SD (N = 5). Estos datos fueron generados a partir de la t = 0 punto de tiempo que se utilizó en la Figura 3B para la evaluación de la reparación de DSB de ADN. (B) esplenocitos aislados fueron expuestos a una dosis de 2 Gy desafiante de γ-radiación y partes alícuotas de las células fueron fijadas en tiempos t = 0, 1 y 24 horas después de la irradiación desafiante. Fluorescencia de γH2AX en relación a su propia t = 0 el control se muestra media ± desviación estándar (N = 5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El protocolo presentado en este documento es útil para la realización del ratón a gran escala en los estudios in vivo que examinan los efectos genotóxicos de los bajos niveles de diversos agentes químicos y físicos, incluyendo la radiación ionizante. Nuestra instalación de animales libres de patógenos específicos único equipado con un irradiador GammaBeam 150 y un pasillo largo irradiación 30 metros permite la realización de estudios de toda la vida que implican radiaciones bajas o muy bajas tasas de dosis en cientos o incluso miles de ratones. Pequeñas instalaciones de irradiación para la irradiación crónica a dosis bajas se puede configurar en una universidad o entorno hospitalario en el que se llevaron a cabo estudios radiobiológicas rutinariamente y directrices de protección radiológica / reglamentos se aplican. Sin embargo, las regulaciones más estrictas que normalmente se aplican a las instalaciones diseñadas para la irradiación de animales interna donde la manipulación de radionucleidos, como el tritio, se lleva a cabo. Aunque es raro, existen laboratorios certificados para tales estudios de exposición a radiaciones internas en varios reinstituciones de búsqueda en todo el mundo y sus capacidades únicas se pueden utilizar para los estudios descritos en este protocolo.

Dentro del protocolo, se utiliza el etiquetado de inmunofluorescencia de γH2AX para evaluar con precisión las tasas de ADN OSD producidos por exposiciones experimentales. Nivel que es más importante, la introducción de una irradiación desafiante entregado ex vivo a los esplenocitos extraídos hace que sea posible evaluar la integridad de la respuesta de DNA DSB (nivel γH2AX en 1 hr después del desafío) y de la reparación de DNA DSB (γH2AX a las 24 h en comparación con 0 h). Cabe señalar que la cuantificación de γH2AX focos por célula por microscopía de fluorescencia puede proporcionar una mayor sensibilidad en comparación con la citometría de flujo. Por ejemplo, dosis tan bajas como 0.001 fueron reportados Gy para producir un aumento significativo en el número de focos γH2AX por célula. Sin embargo, el uso de la detección basada en citometría de flujo de γH2AX proporciona ventajas sobre el análisis de microscopía de fluorescencia becausarlo requiere menos tiempo para las mediciones, que no requiere de personal altamente especializado / capacitados y evita subjetiva de toma de decisiones relacionadas con γH2AX focos reconocimiento y recuento. Estas ventajas son fundamentales para los estudios en animales a gran escala. Un experimento animal típico con 10 grupos de tratamiento y 10 ratones por grupo se traducirá en 100 muestras x 3 = 300 bazo, si el método sugerido (Figura 1) es seguido. Para generar los datos de este número de muestras, aproximadamente 100 horas serán requeridos mediante citometría de flujo. Alternativamente, si se hace por los análisis microscópicos manuales, la misma tarea tomaría al menos 300 horas, utilizando una estimación conservadora de 40 minutos de tiempo microscopio muy exigente por muestra. Aunque los intentos para automatizar el análisis y calificación de focos γH2AX se han hecho ^{17 a 19,} todos ellos tienen una serie de limitaciones. En particular, la forma redonda y pequeño tamaño de esplenocitos de ratón y linfocitos hace que sea poco práctica para resolver todas individual γH2AX focos microscópicamente. Mientras que las células adherentes se han marcado con éxito por los sistemas automatizados para microscopía γH2AX focos, sin éxito se ha demostrado, ya sea para esplenocitos de ratón o linfocitos.

La mejor manera de eliminar la variabilidad en el día a día en los valores medidos de señal γH2AX por citometría de flujo es para incluir muestras experimentales del grupo de control y en el mismo plazo y para calcular los cambios γH2AX relativas dentro de cada carrera. Otras recomendaciones incluyen: a) un control histórico que consiste en tratar y 2 Gy irradiado muestra se utiliza en cada carrera; b) una persona lleva a cabo todos los procedimientos de etiquetado anticuerpo; c) una sola población de tampones y un único lote de anticuerpos, tanto primarias como secundarias, se utiliza para todo el conjunto de muestras dentro de un experimento. También es vital para llevar a cabo un citómetro de flujo de ensayo de control de calidad recomendada por el fabricante del instrumento de manera rutinaria y antes de cada serie de muestras. Esto es reqpedirá otra para verificar el sistema de alineación y fluidos óptica del instrumento y también ayuda a minimizar la variación en el día a día en la medida de fluorescencia γH2AX entre muestras de ser comparados o agrupados en un solo grupo.

Cabe señalar que el uso de un mayor número de puntos de tiempo (por ejemplo, 1, 2, 4, 6 horas) después de la irradiación desafiante puede ayudar a analizar y medir a corto plazo la cinética de reparación del ADN OSD con mayor detalle ^16. Sin embargo, el potencial de la reparación general y la probabilidad de efectos en la salud retardados estarían representados por el daño residual medido solamente a las 24 horas y en comparación con la observada en el punto de tiempo inicial (t = 0) ^13-15 (Figura 4).

Dado que los niveles basales γH2AX son conocidos por aumentar en los animales viejos o células senescentes ^20, para la interpretación más precisa de los resultados obtenidos en los estudios de exposición de ratón a largo plazo (> 6 meses) usando el método descrito, THe uso de un grupo de jóvenes no se trata, además de un control de la misma edad, sería aconsejable. Aunque algunos informes indican que γH2AX puede aumentar en las células proliferantes, que no estaría relacionado con DSB de ADN, este puede ser fácilmente controlada mediante la medición de la fase S y G2 / M-fase fracciones celulares utilizando histogramas de ADN (Figura 2A, D). Si ciertas condiciones experimentales siguen impidiendo un investigador de usar γH2AX como marcador de daño en el ADN (debido a las razones expuestas anteriormente, o sus combinaciones), otro focos daño en el ADN de proteínas formando, como 53BP1, se puede utilizar ^21.

Aunque no hemos intentado usar este método para los tejidos no linfoides, como el músculo, el corazón, el cerebro y otros, parecería difícil procesarlos por citometría de flujo. Las secciones de tejido y microscopía para γH2AX conteo de focos sería el método de elección, si se requiere el análisis de tales tejidos. Sin embargo, otras células linfoides, tales como sangre periférica lymphocytes, linfocitos de la médula ósea o timocitos, se pueden utilizar para medir los niveles γH2AX por el método descrito. La ventaja de utilizar linfocitos de bazo es la relativa simplicidad de la preparación de suspensión de células y el gran número de células que se pueden aislar a partir de un bazo. Esto se vuelve aún más ventajoso si los puntos finales adicionales se incluyen en el estudio. En nuestra experiencia, un rendimiento típico de esplenocitos por ratón permite la colección de al menos 10 partes alícuotas, cada uno adecuado para cualquiera de los siguientes ensayos: citometría de flujo, RT-qPCR para el gen o los genes miARN expresión, western blot, el ADN genómico para la metilación CpG ensayo. Por lo tanto, las alícuotas de esplenocitos adicionales recogidos en paralelo a los del punto final de γH2AX se pueden utilizar para medir la expresión de genes implicados en las respuestas de señalización y de reparación de daño del ADN. Dichos genes como GADD45A y CDKN1A, que son normalmente transcripcionalmente hasta reguladas en respuesta a los tratamientos citotóxicos ^22, pueden proporcionar una pista para ir abriendosus células están respondiendo adecuadamente al reto influencia del estrés. Del mismo modo, los niveles de proteína y modificaciones post-traduccionales involucrados en las respuestas al estrés pueden ser evaluados. Por último, no se espera que cualquiera de los pasos del procedimiento de extracción, si se realiza tal como se describe aquí, puede inducir γH2AX en esplenocitos.

Sería beneficioso y muy recomendable para tomar muestras de órganos y tejidos adicionales durante sacrificios para complementar los datos de daños y reparación de ADN obtenidos por esplenocitos como por protocolo presentado con otros puntos finales. Por ejemplo, recogemos rutinariamente células de médula ósea para el ensayo de micronúcleos en médula ósea in vivo, diversos tejidos para la senescencia asociada a β-galactosidasa y mediciones de la expresión de genes de reparación del ADN. La capacidad de recoger otros tejidos dependerían del apoyo técnico disponible durante los sacrificios; Sin embargo, puede ayudar significativamente en la correcta interpretación de los resultados y la construcción de una much más biológicamente foto sistémica correspondiente de la respuesta al tratamiento bajo nivel siendo investigado.

The authors declare that there are no known competing financial interests.

The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).