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Para estudiar el mutualismo entre Xenorhabdus Bacterias y Steinernema, se han desarrollado métodos para monitorizar la presencia bacteriana y la ubicación dentro de los nematodos. El enfoque experimental, que se puede aplicar a otros sistemas, implica bacterias de ingeniería para expresar la proteína verde fluorescente y la visualización, utilizando bacterias de microscopía de fluorescencia dentro del nematodo transparente.
Simbiosis, la convivencia de dos o más organismos, se han generalizado en todos los reinos de la vida. Como dos de los organismos más ubicuos en la tierra, nematodos y bacterias formar una amplia variedad de asociaciones simbióticas que van desde beneficioso para patógena 1-3. Una de estas asociaciones es la relación de beneficio mutuo entre las bacterias y nematodos Steinernema Xenorhabdus, que ha surgido como un sistema modelo de simbiosis 4. Nematodos entomopatógenos Steinernema son, con su simbionte bacteriano para matar insectos 5. Para la transmisión entre huéspedes de insectos, las bacterias colonizan el intestino de la etapa del nemátodo infectivo juvenil 6-8. Recientemente, varias otras especies de nematodos se ha demostrado que las bacterias utilizan para matar insectos 9-13, y las investigaciones han comenzado a examinar las interacciones entre los nematodos y bacterias en estos sistemas <sup> 9.
Se describe un método para la visualización de un simbionte bacteriano dentro de o en un host nematodo, tomando ventaja de la transparencia óptica de los nematodos cuando se vieron por microscopía. Las bacterias se han diseñado para expresar una proteína fluorescente, lo que permite su visualización por microscopía de fluorescencia. Se dispone de muchos plásmidos que llevan los genes que codifican proteínas que presentan fluorescencia a longitudes de onda diferentes (es decir, verde o rojo), y la conjugación de los plásmidos procedentes de una cepa de Escherichia coli donante en un receptor simbionte bacteriano tiene éxito para una amplia gama de bacterias. Los métodos descritos se han desarrollado para investigar la asociación entre Steinernema carpocapsae y Xenorhabdus nematophila 14. Métodos similares se han utilizado para investigar otros bacteria nematodos asociaciones 9, 15-18 y por lo tanto, el enfoque es en general aplicable.
El METhod permite la caracterización de la presencia bacteriana y la localización dentro de los nematodos en diferentes etapas de desarrollo, y proporciona información sobre la naturaleza de la asociación y el proceso de colonización 14, 16, 19. El análisis microscópico revela tanto la frecuencia de colonización dentro de una población y la localización de las bacterias a los tejidos del huésped 14, 16, 19-21. Esto es una ventaja sobre otros métodos de seguimiento de las bacterias dentro de las poblaciones de nematodos, tales como sonicación 22 o molienda 23, que puede proporcionar los niveles medios de la colonización, pero no puede, por ejemplo, discriminar poblaciones con una alta frecuencia de bajas cargas simbiontes de poblaciones con una baja frecuencia de las cargas simbiontes altas. La discriminación de la frecuencia y de la carga de bacterias colonizadoras puede ser especialmente importante en el cribado o la caracterización de mutantes bacterianos para fenotipos colonización 21, 24. En efecto, la microscopía de fluorescencia se ha utilizado en el cribado de alto rendimiento de mutantes bacterianos de los defectos de colonización 17, 18, y es menos laborioso que otros métodos, incluyendo la sonicación 22, 25-27 y disección nematodos individuales 28, 29.
1. Construcción de una cepa bacteriana fluorescente mediante conjugación
2. La producción de huevos de nematodos axénicos
3. Co-cultivo de ensayo con bacterias fluorescentes
4. Colección de los estados tempranos de detección
5. Los nematodos de cribado para Asociación bacteriana por Microscopía
6. Los resultados representativos
Ejemplo, imágenes de microscopio de nematodos Steinernema asociadas a bacterias Xenorhabdus se muestra en la Figura 3. Para crear la imagen compuesta se ve en la figura 3A, una imagen de contraste de fase se superpone con una imagen fluorescente. La flecha en la Figura 3A indica las bacterias presentes en el nematodo infectivo juvenil (barra = 100 mm). Figura 3B se construyó de una manera similar y muestra un menor nematodo wiTH Green bacterias proteínas fluorescentes etiquetados (barras verdes), situados a lo largo de los nematodos intestinales lumen (barra = 20 micras). Una población de los nematodos de los dos medios se contaron y se obtuvo para la colonización por el simbionte bacteriano (Tabla 1). Para la estadística robusta, lo mejor es contar al menos 100 nematodos por muestra con al menos 30 cae en cada categoría. Como se ve en la Tabla 1, estos nemátodos son colonizados a un nivel de aproximadamente 14,6% cuando se cultiva en agar de lípidos y 68,6% cuando se cultiva en agar hígado riñón. Nematodos y otras especies bacterianas han demostrado tener diferentes niveles de colonización. Por ejemplo X. nematophila coloniza el 99% de S. carpocapsae juveniles infectivos (Martens 2003), y P. luminescens coloniza el 26% de H. bacteriophora juveniles infectivos (Ciche 2003).
Figura 1. Plan esquemático del método. A. La bacteria está diseñado para expresar una proteína fluorescente. Huevos de nematodos B. están aislados de los nematodos adultos para producir nematodos estériles. C. Los nematodos estériles se co-cultivan con bacterias fluorescentes. D. Las etapas de la vida resultantes se observan bajo un microscopio para evaluar la presencia de bacterias en el nematodo.
Figura 2. Representación de las mujeres adultas que contienen huevos. A. El esquema muestra el aspecto general de las hembras Steinernema. DIC imagen de un S.: Inset feltiae hembras grávidas. La flecha de color negro indica la vulva. Las flechas blancas muestran huevos visibles. La imagen es de 20 aumentos, y la barra de escala representa 100 m. B. DIC imagen de un país desarrollado, pero sin eclosionar S.feltiae huevos de nematodos. La imagen es un aumento de 40X, y la barra de escala representa 50 micras. C. DIC imagen de huevos aislados de S. feltiae nematodos bajo ampliación de 10X. Barra de escala es de 100 m.
Figura 3. Ejemplo de imágenes de microscopio de nematodos-bacterial asociación. A. S. nematodos puntauvense se asociaron con su simbionte bacteriano, X. bovienii, GFP expresando. La imagen es una imagen compuesta producida mediante la superposición de una imagen de contraste de fase con una imagen fluorescente del mismo campo de vista. La flecha indica el simbionte bacteriano fluorescente dentro del huésped nematodos. La barra de escala representa 100 m. B. Esta imagen muestra una S. carpocapsae juvenil nematodos con GFP-expresando X. nematophila localizados en el intestino de nematodos.Esta imagen fue construida a través de la superposición de una imagen fluorescente sobre una imagen de contraste de interferencia diferencial. La barra de escala representa a 20 micras.
Tensión | Número de nematodos con acteria | Los nematodos totales Contado | El porcentaje de nematodos olonized |
S. puntauvense Agar lípidos | 30 | 205 | 14,60% |
S. Hígado Riñón puntauvense Agar | 72 | 105 | 68.60% |
Tabla 1. Ejemplo de puntuación de una población de nematodos para la presencia de bacterias. En este experimento, axénico S. nematodos puntauvense se cultivaron con su simbionte que expresan GFP en diferentes medios de cultivo (agar agar y lípidos del hígado riñón 32) para la prueba de defectos de colonización. Un total de al menos un hundred nematodos por muestra se contaron y se anotó la presencia de bacterias. Para poder estadístico, experimental tres repeticiones se deben contar por lo menos con 30 nematodos que caen en cada categoría.
Tabla 2. Plásmidos que contienen proteína fluorescente. Una lista de los posibles plásmidos para la inserción de una proteína fluorescente en el simbionte bacteriano se da enumeran por nombre de plásmido. Otra información incluida son la proteína fluorescente casete codificado, antibiótico que se usa para el mantenimiento del plásmido, otras instrucciones para el uso, la fuente del plásmido. La concentración se indica en paréntesis es la concentración del antibiótico usado para X. nematophila. Cada uno de estos plásmidos se ha utilizado con éxito en cualquiera de Xenorhabdus o Photorhabdus. Información adicional se puede obtener a partir de las citas indicadas. Dependienteen la bacteria que se prueba, algunos plásmidos pueden no funcionar en base a la proteína fluorescente, selección de antibióticos, sitio de inserción, o el origen de la replicación. Los plásmidos mencionados anteriormente contienen diferentes características que pueden permitir su uso en la bacteria de interés. Por ejemplo, mini-Tn7-KSGFP se inserta en el sitio attTn7 del cromosoma, mientras que pECM20 inserta en la X. nematophila cromosoma por recombinación homóloga. Alternativamente, los plásmidos se mantienen extracromosómicamente pPROBE, y cada pPROBE plásmido tiene el mismo esqueleto y el fluoróforo, pero tienen diferentes marcadores seleccionables o los orígenes de replicación para permitir su uso en una variedad de taxonómica o mutantes antecedentes.
El protocolo aquí descrito proporciona un método para la detección óptica de las bacterias dentro de un huésped nematodo (Figura 1). Este método tiene la ventaja de la transparencia óptica de los nematodos y la capacidad de las bacterias de etiquetas fluorescentemente, lo que permite el análisis in vivo de las bacterias dentro del huésped nemátodo (Figura 3). En concreto, este enfoque identifica la localización de bacterias dentro de su huésped. Al contar una población de nematodos y de puntuación para la presencia de bacterias, la frecuencia de colonización bacteriana a través de la población de nematodos se puede determinar (Tabla 1). Este método es uno de las muchas técnicas posibles que se pueden utilizar para el estudio de las interacciones entre los hosts de nematodos y simbiontes bacterianos. Métodos relacionados se han descrito anteriormente para aislar el simbionte bacteriano, nematodos crecer axénicamente, y manipular ambos socios 25-27.
El protocolo descrito here se desarrolló en el sistema de Xenorhabdus nematophila-Steinernema carpocapsae modelo 14, y enfoques similares se han utilizado en otros entomopatógenos bacterianas nematodos asociaciones 9,15,17,18. Varias condiciones deben cumplirse para poder aplicar este método a otras bacterias nematodos sistemas. En primer lugar, el simbionte bacteriano debe ser capaz de ser aislado del huésped y cultivarse en cultivo de forma independiente. En segundo lugar, el simbionte debe ser capaz de captar ADN a través de la transformación o conjugación con el fin de introducir la proteína fluorescente. En tercer lugar, para los mejores resultados, el nematodo debe tener una etapa que se puede hacer axénico y reintroducido en bacterias. Sin embargo, incluso si el nematodo no puede ser aislado de la bacteria que aún podría ser posible visualizar la asociación: en lugar de añadir los huevos axénicas para el césped de bacterias fluorescentes, añadir una etapa de la vida convencionalmente elevado y proceder con el protocolo tal como se describe. Los resultados se verán afectados a partir del día advertenciaen las bacterias que no expresan GFP competirán con las bacterias que expresan GFP-para la localización de los tejidos específicos de nematodos, y debido a esto, la colonización no se debe medir por recuento microscópico. Sin embargo, a menos que las bacterias que no expresan GFP drásticamente outcompete bacterias que expresan GFP, GFP-expresando bacterias debe localizar a los tejidos de nematodos en al menos algunos animales en la población y sugerir sitios importantes para la colonización bacteriana del tejido. Una advertencia de larga data del uso de proteínas fluorescentes cepas que expresan es que pueden colonizar un huésped con una eficacia diferente de una cepa que no expresa las proteínas fluorescentes (por ejemplo, 12).
Los pasos descritos en este protocolo puede requerir optimización en función del nematodo y especies de bacterias que se están utilizando. Para la conjugación de la bacteria algunas condiciones que pueden ser alterados son la longitud y la temperatura de crecimiento, la relación de donante al receptor, y plasmaIdentificación del usado. Ejemplos de plásmidos pertinentes se enumeran en la Tabla 2. Todos estos plásmidos se han utilizado con éxito en tanto de bacterias Xenorhabdus o Photorhabdus en asociación con su anfitrión nematodo 14,17,20,24,33-35. Para garantizar el mantenimiento estable de la proteína fluorescente durante la colonización nematodo lo mejor es utilizar un plásmido que se inserta en el cromosoma de la bacteria diana. Además, algunas bacterias no pueden tomar estos plásmidos. Por ejemplo, pECM20 sólo se ha utilizado en X. nemtaophila y muy estrechamente relacionado con cepas bacterianas 14 porque esto inserta plásmido en el cromosoma utilizando una región homóloga entre el plásmido y el cromosoma, el plásmido no se insertará si la bacteria diana carece de esta región. Para utilizar este plásmido para otras bacterias, la X. nematophila específico de región debe ser sustituido con una región genómica de la bacteria diana. Algunos esquemas de plásmidos de transformación también se rEquire ciertas alteraciones del Protocolo 1. Por ejemplo, mini-Tn 7-KSGFP y pBK miniTn-7-ΩGm-DsRed requieren un plásmido auxiliar que contienen genes de transposición (tsnABCDE) 33,35,36 para insertar en el cromosoma bacteriano. La conjugación es más eficiente con estos plásmidos Tn 7 basada, cuando 2-hora cultivos (OD 600 ~ 0,3 a 0,4) se mezclan en proporciones iguales.
Después de conjugación con éxito, es importante que se utilice correctas placas selectivas correspondientes al plásmido utilizado. Las placas selectivas debe contener el antibiótico codificada en el plásmido para seleccionar para la presencia del plásmido en el receptor y una selección contra-contra las cepas donantes y ayudante. Por ejemplo, al conjugar pECM20 en X. nematophila la contra-selección utilizado es la ampicilina debido X. nematophila es resistente a la ampicilina y la cepa donante es sensibles a la ampicilina. Si antibiótico contra-selección no está disponible en ynuestro sistema, un ácido diaminopimélico (DAP) que requiere donante se pueden utilizar. Para crecer DAP-que requieren cepas, DAP se añade al medio de cultivo sólidos y líquidos durante las etapas de pre-conjugación y conjugación, y se omite durante las etapas de selección de venta libre. Cuando DAP está ausente la cepa donante no va a crecer y es eficaz contra el seleccionado.
Para garantizar el aislamiento huevo éxito es esencial para comprobar con precisión la producción de huevos (Figura 2). En el momento de aislamiento, los nematodos hembra debe estar lleno de huevos y unos huevos deben ser visibles en los medios (Figura 2A). Si los nematodos hembra están produciendo huevos fertilizados por lo menos algunos huevos sobrenadante se han desarrollado visiblemente como nematodos no eclosionados (Figura 2B). Para S. carpocapsae, los huevos cambiará de esférica a oblonga ligeramente antes del desarrollo de los nematodos y de eclosión. El momento o condiciones de crecimiento de nematodos también pueden necesitar ser modificados para maximizar huevo fertilizadorendimiento, incluyendo acortando o alargando el período de tiempo antes de la recolección de huevos, o utilizando medios alternativos apropiados para las especies de nematodos específicos. Al final del aislamiento, los huevos deben ser fácilmente visible dentro de la memoria intermedia (Figura 2C). Los parámetros en el protocolo de aislamiento de huevo que puede requerir optimización incluyen cloro y KOH concentraciones en la solución de huevo, tiempo de incubación en solución de huevo, o la velocidad de centrifugación. Si el aislamiento huevo produce huevos pero no nematodos se desarrollan durante el co-cultivo, es posible que los huevos aislados no son viables. Para comprobar la viabilidad, dejar los huevos aislados en el buffer y esperar a que los nematodos para salir del cascarón. Los huevos deben eclosionan en uno o dos días de aislamiento y luego los nematodos juveniles se puede utilizar en el ensayo de co-cultivo. Si los huevos se rompen, pero no desarrollan durante el ensayo de co-cultivo, puede ser necesario modificar las condiciones de crecimiento o medio utilizado para el co-cultivo. Tomamos nota de que studie anteriors han aislado bacterias libres de nematodos por remojo de los nematodos en un cóctel de antibióticos (por ejemplo, 3,37). El enfoque se describe aquí está libre de algunas de las advertencias de remojo antibiótico, incluyendo complicaciones con el uso de antibióticos bacteriostáticos, resistentes a los antibióticos de bacterias contaminantes, y los efectos antibióticos en los nematodos. Ciertas etapas de nematodos también pueden ser resistentes a los antibióticos y retener sus simbiontes bacterianos 3. Por último, se observa que para la microscopía, la concentración de levamisol necesario para la inmovilización de nematodos puede variar con diferentes clados de nematodos.
Una vez que este método se ha establecido en el sistema de interés, es posible alterar la técnica para obtener más información. Al mirar a puntos de tiempo anteriores en el ciclo de vida del nematodo (Protocolo 4), uno puede ser capaz de identificar la forma en la bacteria y el nematodo iniciar su asociación 14,16. Además, este enfoque puede ser utilizado to Realizar un alto rendimiento pantallas mutantes para identificar los factores bacterianos implicados en la simbiosis, utilizando fluorescencia para detectar colonización 17,18. Otros métodos tales como la mutagénesis firma etiquetados requieren el uso de sondas marcadas radiactivamente y consumen más tiempo 22,28. Por lo tanto, el uso de microscopía de fluorescencia para la visualización simbionte bacteriano en los nematodos es una herramienta efectiva y eficiente para la investigación de interacciones bacterianas con un anfitrión de nematodos.
No hay conflictos de interés declarado.
Los autores desean agradecer a Eugenio Vivas, Heungens Kurt, Eric Martens, Charles Cowles, Sugar Darby, Stabb Eric, y Ciche Todd por sus contribuciones al desarrollo de este protocolo y las herramientas utilizadas. KEM y JMC fueron apoyados por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Premio Nacional de Servicio de Investigación T32 (AI55397 "Los microbios en Salud y Enfermedad"). JMC fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia (NSF) de Becas de Postgrado de Investigación. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencia (IOS-0920631-0950873 y IOS).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
Lípidos Agar (Estéril) | 8 gramos de caldo nutriente, 15 gramos de agar de extracto de levadura, 5 gramos, 890 ml de agua, 10 ml de 0,2 g / ml de MgCl 2. 6 H 2 0, 96 ml de jarabe de maíz solución *, 4 ml de aceite de maíz * Revuelva los medios de comunicación mientras se vierte placas * Añadir ingrediente estéril después del autoclavado | ||
Solución de jarabe de maíz (Estéril) | 7 ml de jarabe de maíz, 89 ml de agua mezcla y autoclave | ||
Huevo Solution | 16,6 ml de sodio 12% de hipoclorito, 5 ml de KOH 5 M, 80 ml de agua | ||
Lisogenia Caldo (Estéril) | 5 gramos de extracto de levadura, 10 g de triptona, 5 gramos de sal, 1 l de agua mezcla y autoclave | ||
Microcentrifugue | Pescador | 13-100-675 | Cualquier microcentrífuga que contiene tubos de microcentrífuga funcionará |
Centrífugo | Beckman | 366802 | Gran mesa centrífuga superior que posee el 15 ml y 50 ml tubos cónicos |
Estéril 60 mm X 15 mm Petri Dish | Pescador | 0875713 | |
50 ml tubos de centrífuga | Pescador | 05-539-6 | |
15 ml tubos de centrífuga | Pescador | 05-531-6 | |
Estéril 100 mm X 20 mm Petri Dish | Pescador | 0875711Z | Más profundo que el estándar de placas de Petri |
24-así placa | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
Microscopio | El microscopio tiene capacidad fluorescentes compatibles con el fluoróforo | ||
Paraformaldehído | Microscopía Electrónica de Ciencias | 15710 | |
PBS (Estéril) | 8 g de NaCl 0,2 g de KCl 1,44 g de Na 2 HPO 4 0,24 g de KH 2 PO 4 1 L de agua Ajuste a un pH de 7,4 y agua a 1 L y autoclave | ||
Tubos de microcentrífuga | Pescador | 05-408-138 | 2 ml o 1,5 ml tubos |
Shaker | Cualquier agitador que hace que el líquido se mueva suavemente funcionará | ||
Ácido diaminopimélico | Sigma | D-1377 | Si es necesario, suplementar medios a una concentración de 1 mM o |
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