Técnicas analíticas para el ensayo de bioactividad del óxido nítrico

La producción endógena de óxido nítrico (NO) regula una amplia variedad de funciones biológicas. Cada vez es más claro que la interrupción o la desregulación de la señalización de NO basado en está involucrado en muchas enfermedades humanas. Los métodos para cuantificar los metabolitos relevantes no pueden proporcionar nuevos biomarcadores de diagnóstico o pronóstico de la enfermedad humana.

El óxido nítrico (NO) es un radical libre diatómico que es muy corta duración en los sistemas biológicos (menos de 1 segundo en la sangre circulante) ^1. NO puede ser considerada como una de las moléculas de señalización más importantes se producen en nuestro cuerpo, regulación de las funciones esenciales, incluyendo pero no limitado a la regulación de la presión arterial, la respuesta inmune y de la comunicación neuronal. Por lo tanto su detección y cuantificación precisa en matrices biológicas es fundamental para comprender el papel del NO en la salud y la enfermedad. Con una vida media corta fisiológica de NO, estrategias alternativas para la detección de productos de reacción de NO bioquímica se han desarrollado. La cuantificación de los metabolitos de NO relevantes en múltiples compartimentos biológicos proporciona una valiosa información con respecto a la producción de NO in vivo, la biodisponibilidad y el metabolismo. Basta con un solo compartimiento de muestreo, tales como sangre o plasma no siempre puede proporcionar una evaluación precisa de toda body No hay ningún estado, particularmente en los tejidos. La capacidad de comparar la sangre con los tejidos seleccionados en animales de experimentación ayudará a cerrar la brecha entre la ciencia básica y la medicina clínica en cuanto a la utilidad diagnóstica y pronóstica de NO biomarcadores en la salud y la enfermedad. Por lo tanto, la extrapolación de NO estado de plasma o sangre a los tejidos específicos de interés ya no es un enfoque válido. Como resultado, los métodos siguen siendo desarrollado y validado, que permiten la detección y cuantificación de los productos NO y NO relacionadas o metabolitos en los compartimentos múltiples de animales de experimentación in vivo. El paradigma establecido de la bioquímica de la producción de NO por el NO sintasa a la activación de la guanilato ciclasa soluble (GCs) a la oxidación final a nitrito (NO ₂ ^-) y nitrato (NO ₃ ^-) sólo puede representar parte de ninguna de los efectos in vivo. La interacción de los metabolitos de NO y NO-derivado con tioles de proteínas, aminas secundarias, y los metales para formar S-nitrosothioles (RSNOs), N-nitrosaminas (RNNOs), y nitrosilo hemo-representan respectivamente cGMP independientes efectos de NO y son probablemente tan importante como fisiológicamente activación de GCs por NO. Una verdadera comprensión de NO en la fisiología se deriva de los experimentos in vivo de muestreo compartimentos múltiples simultáneamente. El óxido nítrico (NO), la metodología es una ciencia compleja ya menudo confusa y el foco de muchos debates y discusión sobre la bioquímica NO. La elucidación de nuevos mecanismos y vías de señalización que involucran NO depende de nuestra capacidad de concreto, de forma selectiva y sensible detección y cuantificación de NO y NO todos los productos relevantes y sus metabolitos en matrices biológicas complejas. A continuación, presentamos un método para el análisis rápido y sensible de nitritos y nitratos por HPLC, así como la detección de NO libre en muestras biológicas de quimioluminiscencia basado en la capa de ozono in vitro con derivitazation química para determinar el origen molecular de NO, así como ex vivo conórgano miografía baño.

1. Extracción de sangre total

1. Recoger la sangre venosa de los seres humanos o de animales de experimentación con NEM / EDTA tubos que contienen.
2. Inmediatamente girar hacia abajo la sangre en una centrífuga de sobremesa a 14.300 RCF (fuerza centrífuga relativa) durante 7 minutos para preparar el plasma y los glóbulos rojos de pellets.
3. Preparar las muestras de plasma para la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y detección de quimioluminiscencia (CLD) el análisis.
   HPLC: Añadir 01:01 volumen de metanol frío a plasma, vórtice y se centrifuga a 13.200 rpm durante 10 minutos a precipitar las proteínas plasmáticas. Recoger sobrenadante para el análisis por HPLC.
   EPC: alícuota de una muestra y preincubar con sulfanilamida y cloruro de mercurio de nitrosotioles de ensayo en particular.
4. Preparar rojo sedimento celular para HPLC y el análisis de la EPC.
   HPLC: Añadir 1:04 rojo sedimento celular a una solución de lisis hipotónica que contiene 10 mM de NEM, 2,5 mM EDTA y 10 mM de ferricianuro. Mezclar bien y agregar 1:1 de metanol, vórtice y CentrifUGE a 13.200 rpm durante 10 minutos a la proteína de precipitado. Recoger sobrenadante para el análisis por HPLC.
   EPC. Añadir 1:04 rojo sedimento celular a una solución de lisis hipotónica que contiene 10 mM EDTA, 2,5 mM EDTA y 10 mM de ferricianuro. Las muestras alícuotas a tubos que contienen cloruro de sulfanilamida y mercúrico para la detección específica de nitrosotioles.

2. Extracción y Preparación de tejidos

1. Para determinar los niveles tisulares de NO metabolitos, es primero necesario para cosechar tejido sangre libre para la preparación de muestras como se ha descrito anteriormente. Un intercambio de la sangre completa se llevará a cabo mediante la infusión de tampón fisiológico a través de la punta del ventrículo izquierdo. Una vez que todos se extrae la sangre, los tejidos de interés puede ser cosechado.
2. Homogeneizar las muestras de tejido y preparar muestras como se ha descrito anteriormente para HPLC y análisis EPC.

3. Anillos de aislamiento de la aorta para la función endotelial

Tejido baño de órganos

1. Los ratones se Anesthetized con éter dietílico hasta que ya no responden a los pies de apuro, y se someten a la dislocación cervical antes de la cirugía. La toracotomía se realiza para exponer la aorta torácica y abdominal. Una jeringa de calibre 25 se inserta en el vértice del ventrículo izquierdo y perfundidos libre de sangre oxigenada con tampón de Krebs Henseleit.
2. La aurícula derecha se corta para proporcionar una salida de sangre. Aorta abdominal se quitan y se limpian de la adventicia.
3. Anillos se corta en segmentos de 2 mm de largo y montado en un baño de tejido de cuatro canales de órganos (DMT 720MO, AD Instruments) bañado en una solución tampón fisiológico.
4. Los anillos de los buques se mantienen en baños de órganos de 10 ml con el tampón de Krebs oxigenada (95% O ₂ y el 5% de CO ₂₎ a 37 ° C. Una pretensión de gramos se coloca en cada anillo aórtico (la tensión de partida adecuado para la función vasomotora óptima según lo determinado en experimentos anteriores). Un niño de ocho canales octal puente (Powerlab) y de adquisición de datos de software (versión Gráfico 5.2.2) unavolver a utilizar para registrar todas las medidas de fuerza.
5. Los anillos se dejaron equilibrar durante 80 minutos con el tampón en cada baño de órganos cambiado cada 20 min. Después de equilibrar durante 80 min, 1 mM fenilefrina se añade a cada anillo de contracción submáxima.
6. Después de la estabilización, agonista endotelial tales como la acetilcolina se añadió para determinar la producción de NO y el grado de relajación del vaso. Después de la respuesta a la dosis de acetilcolina, baños se enjuagó y recontracted y se trató luego con una fuente exógena de óxido nítrico, nitroprusiato de sodio para determinar la capacidad de respuesta del músculo liso y para obtener un valor de 100% de relajación.
7. NO eliminadores se pueden añadir al baño para ilustrar claramente la liberación de NO y la inhibición de la relajación del vaso.

4. Los resultados representativos

El uso de la ENO-20 HPLC dedicada proporciona un fácil utilizar el método de alto rendimiento para la detección específica y sensible de nitritos y nitratos enmatrices biológicas. El principio de detección y un cromatograma original se muestra en la Figura 1. Este método puede ser utilizado para cualquier muestra biológica para la determinación de nitrito y nitrato. Detección basada en la EPC de metabolitos NO requiere un paso derivatización química para determinar el origen molecular del NO. El montaje experimental para denitrosation simultánea oxidativo y denitrosation reductora para el detector de quimioluminiscencia se muestra en la Figura 2. El recipiente de reacción de la derecha se llena con ferricianuro 800mm en PBS pH 7,4 y el recipiente de reacción de la izquierda se llena con yoduro de potasio / yodo mezcla en ácido acético para denitrosation reducción (Figura 2A). La configuración completa se muestra en la Figura 2B. La Figura 3 muestra los ensayos de grupos específicos denitrosation que pueden detectar y cuantificar los nitritos, nitrosotioles, nitrosaminas, así como productos nitrosilo hemo. Este método ha sido previamente descricama y validado ^4,5. Estos análisis bioquímicos importantes pueden estar correlacionados con los estudios funcionales sobre los anillos aórticos aislados para determinar la producción de NO endotelial en animales de experimentación. Este experimento farmacológico clásico puede con facilidad y evaluar con precisión la función endotelial y la producción. Medición de la reactividad buque a los agonistas endoteliales tales como la acetilcolina puede determinar directamente la producción de NO endotelial que puede ser correlacionado con biomarcadores bioquímicos detectados en la sangre y los tejidos de los animales experimentales. Una representación típica de una respuesta a la dosis de acetilcolina se muestra en la Figura 4. Ratones sanos de control con función endotelial normal responden a la acetilcolina mediante la relajación. Los ratones con disfunción endotelial (ratones hipercolesterolémicos) muestran la relajación reducida debido a la reducción de la producción de NO a los mismos estímulos.

HigoUre 1. Principio de la detección de nitrito y nitrato de Eno-20 y el cromatograma de la muestra. (Arriba) Esquema de ENO-20 método de detección de nitrito y nitrato. (Inferior) chromotogram estándar de 10 pmol nitrito y nitrato inyecta en ENO-20 (100 l de solución de 100 nM de nitrito y nitrato). Sensibilidad de 1 nM para cada anión con 100 l de volumen de inyección. No interfiere con la proteína o de una especie de color.

Figura 2. EPC experimental de configuración mediante el uso tanto denitrosation oxidativo por denitrosation ferricianuro y reductora usando yoduro / yodo ensayo con detección de fase gaseosa de gas purgado de óxido nítrico.

Figura 3. (Grupo A) de detección de quimioluminiscencia de nitrito, RSNO, RNNO ensayo denitrosation reductiva de la preincubación de la muestra con el grupo específico isquémicaAl reactivos. La sustracción de áreas de los picos permitir la detección de nitrito y RSNOs. (Grupo B) de detección quimioluminiscente de especies hemo nitrosilo que utilizan la solución de ferricianuro denitrosation oxidativo. Este método es específico para los productos NO-hemo sin reactividad cruzada con RSNOs (GSNO o albúmina SNO-), o RNNO (NO-pirrolidina y N-nitroso albúmina-).

Figura 4. Ex vivo baño de órganos en los anillos aórticos aislados proporciona una medida directa de la producción de NO endotelial que luego puede ser correlacionada con biomarcadores bioquímicos detectados por HPLC y la EPC. Esta figura ilustra la relajación reduce en ratones con disfunción endotelial, debido a la disminución de la producción de NO.

Los métodos descritos aquí para la cuantificación de los metabolitos de NO relevantes en múltiples compartimentos biológicos permitirá a las huellas dactilares del NO de la biología en la salud y la enfermedad que se puede correlacionar con las medidas funcionales de NO por el endotelio. Estos métodos requieren la preparación de muestras sencilla con un potencial de adaptación para un alto rendimiento. La cantidad relativa de estas moléculas pueden ayudar a comprender la producción de NO y su destino metabólico en un número de modelos experimentales de enfermedad e incluso muestras seriadas de pacientes humanos. Hay muchas trampas en la detección de biomarcadores basados ​​en NO y muchos métodos de análisis artificialmente producir algunos de estos productos durante la preparación de la muestra. Contabilidad cuidadosa de nitrito en muestras biológicas es crítica debido a su reactividad con ⁶ tioles cisteína y la formación de los artefactos de nitrosotioles ^7. Metodologías basadas en la CLD para la detección específica de nitrito en condiciones anaeróbicas en llevar aresultados consistentes debido a la actividad de enzimas específicas de nitrito reductasa en los diferentes compartimentos biológicos ^8. Todos los métodos descritos aquí están bien documentados y validados y tomar en consideración las medidas para eliminar o reducir los artefactos ^9. Vamos a describir los pasos críticos necesarios para evitar los artefactos. Esta detección compartimiento múltiple de NO metabolitos ayudará en la identificación de biomarcadores relevantes que pueden tener utilidad de diagnóstico o pronóstico en los seres humanos y luego se permiten el desarrollo de métodos normalizados que pueden ser utilizados en la clínica o para análisis de laboratorio estándar. El reciente reconocimiento de un ciclo del nitrógeno humano por el cual se reducen los nitratos y nitritos a NO por una circulación enterosalivary de nitrato de ^10,11 ahora se abre la posibilidad de utilizar la saliva como un posible biomarcador para el NO en el estado de ciertas enfermedades. Hasta la fecha no condición no es parte de la química de la sangre estándar utilizado habitualmente para fines de diagnóstico en los pacientes. Thse está chocante, dada la naturaleza crítica de NO muchos procesos patológicos. En última instancia, determinar los niveles de estos biomarcadores relacionados con el NO de fácil de usar y rápida lado de la cama tal vez el punto de atención de ensayos después de la validación adecuada será un verdadero testimonio de su papel en la medicina molecular. Es prudente en este momento los esfuerzos concentrados y combinada en el campo para validar y desarrollar un estándar de ensayo y preciso para determinar el estado NO en modelos animales para la validación en los seres humanos. Los métodos descritos en este protocolo permitirá a otros a adoptar rápidamente un método de consenso para tales mediciones.

No hay conflictos de interés declarado.

Los autores desean agradecer a Hong Jiang, Ph.D. y Deepa Parathasarthy, MPH, BDS para la asistencia técnica.