Analytische Verfahren zur Bestimmung von Stickoxid Bioaktivität

Die endogene Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) reguliert eine Vielzahl von biologischen Funktionen. Es wird zunehmend klar, dass Störungen oder Fehlregulation der NO-basierter Signalisierung in vielen menschlichen Krankheiten beteiligt ist. Methoden zur Quantifizierung relevanter keine Metaboliten können neue diagnostische oder prognostische Biomarker für Erkrankungen des Menschen bieten.

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein zweiatomigen freien Radikalen, die extrem kurz in biologischen Systemen (weniger als 1 Sekunde im zirkulierenden Blut) ¹ gelebt wird. NO kann als eines der wichtigsten Signalmoleküle in unserem Körper produziert werden, regulieren essentielle Funktionen einschließlich, aber nicht um Regulierung des Blutdrucks, Immunantwort und neuronalen Kommunikation begrenzt. Daher seine genaue Detektion und Quantifizierung in biologischen Matrices ist entscheidend für das Verständnis der Rolle von NO in Gesundheit und Krankheit. Mit einer solch kurzen physiologischen Halbwertszeit von NO, alternative Strategien für die Detektion von Umsetzungsprodukten von NO Biochemie entwickelt. Die Quantifizierung der relevanten Metaboliten NO in mehreren biologischen Fächer liefert wertvolle Informationen im Hinblick auf in-vivo-NO-Produktion, Bioverfügbarkeit und Metabolismus. Einfach Probenahme aus einer einzigen Fach wie Blut oder Plasma kann nicht immer eine genaue Beurteilung der gesamten boDy keinen Status, vor allem in Geweben. Die Möglichkeit, Blut mit ausgewählten Geweben bei Versuchstieren zu vergleichen, wird dazu beitragen, die Lücke zwischen Grundlagenforschung und klinischer Medizin so weit wie diagnostischer und prognostischer Nutzen von NO-Biomarkern in Gesundheit und Krankheit. Daher ist die Extrapolation von Plasma oder Blut ohne Status zu spezifischen Geweben von Interesse nicht mehr ein gültiger Ansatz. Als Ergebnis weiterhin Methoden entwickelt und validiert werden, die es erlauben den Nachweis und die Quantifizierung von NO und NO-und Genussmittel / Metaboliten in mehreren Fächern von Versuchstieren in vivo. Die etablierten Paradigma der NO-Produktion durch die Biochemie von NO-Synthasen, um die Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC), um eventuelle Oxidation zu Nitrit (NO ₂ ^-) und Nitrat (NO ₃ ^-) kann nur einen Teil der NO-Effekten in vivo. Die Wechselwirkung von NO und NO-abgeleiteten Metaboliten mit Thiolen, sekundären Aminen, und Metalle S-nitrosothi bildenole (RSNOs), N-Nitrosamine (RNNOs) und Nitrosyl-Häm jeweils für cGMP-unabhängige Effekte von NO und sind wahrscheinlich genauso wichtig wie physiologisch Aktivierung der sGC durch NO. Ein wahres Verständnis von NO in der Physiologie von in vivo Experimenten Probenahme mehrere Fächer gleichzeitig abgeleitet. Stickstoffmonoxid (NO)-Methodik ist eine komplexe und oft verwirrenden und Wissenschaft im Mittelpunkt vieler Debatten und Diskussionen über NO Biochemie. Die Aufklärung neuer Mechanismen und Signalwege unter Beteiligung keine Scharniere auf unserer Fähigkeit, spezifisch, selektiv und sensitiv detektieren und zu quantifizieren NO und NO alle relevanten Produkte und Metaboliten in komplexen biologischen Matrices. Hier präsentieren wir eine Methode für die schnelle und hochempfindliche Analyse von Nitrit und Nitrat mittels HPLC sowie Nachweis von freiem NO in biologischen Proben mittels in vitro Ozon basierende Chemilumineszenz mit chemischen derivitazation auf molekularer Quelle von NO als auch ex vivo mit bestimmenOrganbad Myographie.

1. Entnahme von Vollblut

1. Sammle venöse Blut vom Menschen oder von Versuchstieren in NEM / EDTA-Röhrchen enthält.
2. Unmittelbar Spin-Down Blut in einer Tischzentrifuge bei 14.300 RCF (relative Zentrifugalkraft) für 7 Minuten zu Plasma-und Erythrozyten-Pellet herzustellen.
3. Planen Plasmaproben für Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) und Chemilumineszenzdetektion (CLD)-Analyse.
   HPLC: Hinzufügen 01.01 Volumen an kaltem Methanol Plasma, Wirbel und Zentrifuge bei 13.200 rpm für 10 Minuten ausgefällt Plasmaproteine. Sammle Überstand zur HPLC-Analyse.
   CLD: Aliquot einer Probe und vorinkubiert mit Sulfanilamid und Quecksilberchlorid gezielt Assay Nitrosothiole.
4. Bereiten rot Zellpellet für die HPLC-und CLD-Analyse.
   HPLC: Hinzufügen 01.04 roten Zellpellet einer hypotonischen Lyse-Lösung, enthaltend 10 mM NEM, 2,5 mM EDTA und 10 mM Ferricyanid. Vortex gründlich und fügen Sie dann 1:1 Methanol, Wirbel und CENTRIFuge bei 13.200 rpm für 10 Minuten bis ausgefällte Protein. Sammle Überstand zur HPLC-Analyse.
   CLD. In 1.04 roten Zellpellet einer hypotonischen Lyse-Lösung, enthaltend 10 mM EDTA, 2,5 mM EDTA und 10 mM Ferricyanid. Aliquotproben in Röhrchen mit Sulfanilamid und Quecksilberchlorid zum spezifischen Nachweis von Nitrosothiole.

2. Tissue Gewinnung und Aufbereitung

1. Um Gewebe Ebenen keine Metaboliten zu bestimmen, ist es zunächst notwendig, Blut frei Gewebe für die Probenvorbereitung ernten wie oben beschrieben. Ein Vollblut Austausch wird durch Infusion physiologischen Puffer durch die Spitze des linken Ventrikels zu nehmen. Sobald alle Blut entfernt wird, kann Geweben von Interesse dann geerntet werden.
2. Homogenisieren von Gewebeproben und Proben vorbereiten, wie oben für HPLC-und CLD-Analyse beschrieben.

3. Aortenringen Isolierung für die endotheliale Funktion

Tissue Organbad

1. Mäuse werden Anesthetized mit Diethylether, bis nicht mehr ansprechbar Quetschung Fuß, um, und unterliegen Genickbruch vor der Operation. Eine Thorakotomie durchgeführt wird, um Brust-und Bauchaorta aussetzen. Eine 25-Gauge-Spritze in der Spitze des linken Ventrikels eingesetzt und frei von Blut perfundiert mit Sauerstoff angereicherten Krebs-Henseleit-Puffer.
2. Der rechte Vorhof wird geschnitten, um einen Ausgang für Blut bereitzustellen. Bauchaorta wird ausgebaut und gereinigt werden der Adventitia.
3. Ringe werden in 2 mm lange Segmente geschnitten werden und auf einem Vier-Kanal-Gewebe Organbad (DMT 720MO, AD Instruments) in einem physiologischen Puffer-Lösung getaucht.
4. Schiff Ringe werden in 10-ml-Organbäder mit Sauerstoff angereicherten Krebs-Puffer (95% O ₂ und 5% CO ₂₎ bei 37 ° C gehalten Ein Gramm Vorspannung wird auf jedem Aorten-Ring (geeigneter Ausgangspunkt für eine optimale Spannung vasomotorischen Funktion wie in den vorangegangenen Experimenten bestimmt) platziert. Ein Acht-Kanal-Brücke oktal (Powerlab) und Datenerfassungs-Software (Chart Version 5.2.2) einwieder verwendet, um alle Kraftmessungen aufzuzeichnen.
5. Ringe dürfen für 80 Minuten mit dem Puffer in jedem Organbad verändert alle 20 min ins Gleichgewicht. Nach Äquilibrierung für 80 min, 1 uM wird Phenylephrin auf jedem Ring für submaximalen Kontraktion aufgenommen.
6. Nach der Stabilisierung wird endotheliale Agonisten, wie Acetylcholin hinzugefügt, um die NO-Produktion und der Grad der Entspannung Schiffes zu bestimmen. Nach der Dosis auf Acetylcholin wird Bäder gespült und recontracted werden und dann mit einer exogenen Quelle von Stickstoffmonoxid, Natriumnitroprussid, um die Reaktionsfähigkeit der glatten Muskulatur zu bestimmen und einen Wert für 100% Entspannung zu erhalten.
7. NO-Fänger können zugesetzt werden, um deutlich veranschaulichen Freisetzung von NO und Hemmung des Schiffes Entspannung.

4. Repräsentative Ergebnisse

Die Nutzung der ENO-20 engagierten HPLC bietet eine einfach zu hohen Durchsatz Methode zur spezifischen und sensitiven Nachweis von Nitrit und Nitrat im Einsatzbiologischen Matrices. Das Prinzip der Detektion und einem ursprünglichen Chromatogramm ist in 1 gezeigt. Dieses Verfahren kann für jeden biologischen Probe zur Bestimmung von Nitrit und Nitrat verwendet werden. CLD basierte Erkennung von NO-Metaboliten erfordert eine chemische Derivatisierung Schritt, um die molekulare Ursache des NO zu bestimmen. Der experimentelle Aufbau zur gleichzeitigen denitrosation oxidativen und reduktiven denitrosation für die Chemilumineszenz-Detektor ist in Abbildung 2 dargestellt. Das Reaktionsgefäß wird auf der rechten Seite mit 800 mM Ferricyanid in PBS pH 7,4 gefüllt und das Reaktionsgefäß auf der linken Seite mit Kaliumiodid / Iod Mischung in Essigsäure zur Reduktion denitrosation (2A) gefüllt ist. Der gesamte Aufbau ist in 2B gezeigt. Abbildung 3 zeigt, gruppenspezifische denitrosation Assays, die Detektion und Quantifizierung von Nitrit kann, Nitrosothiole, Nitrosamine sowie Nitrosyl-Häm-Produkte. Diese Methode wurde zuvor beschrie warenBett und validiert ^4,5. Diese wichtige biochemische Analysen können leicht mit funktionellen Untersuchungen an isolierten Aortenringen korreliert werden, um festzustellen, endotheliale NO-Produktion bei Versuchstieren. Diese klassischen pharmakologischen Experiment lässt sich einfach und exakt zu bewerten endotheliale NO-Funktion und Produktion. Messgefäss Reaktivität auf endotheliale Agonisten wie Acetylcholin direkt bestimmen endothelialen NO-Produktion, die dann mit biochemischen Biomarkern in Blut und Gewebe der Versuchstiere festgestellt korreliert werden können. Eine typische Darstellung einer Dosis-Wirkungs-zu Acetylcholin wird in Abbildung 4 dargestellt. Gesunde Kontroll-Mäusen mit normaler Endothelfunktion auf Acetylcholin reagieren, indem sie entspannend. Mäuse, die mit einer endothelialen Dysfunktion (Hypercholesterinämie Mäuse) zeigen reduzierte Entspannung aufgrund der reduzierten NO-Produktion auf den gleichen Reiz.

FeigeAbbildung 1. Prinzip der Erfassung von Nitrit und Nitrat durch ENO-20 und Probenchromatogramm. (Nach oben) Schematische Darstellung des ENO-20 zum Nachweis von Nitrit und Nitrat. (Unten) Standard chromotogram von 10 pmol Nitrit und Nitrat in ENO-20 (100 ul von 100 nM Lösung von Nitrit und Nitrat) injiziert. Empfindlichkeit von 1 nm für jedes Anion mit 100 pl Injektionsvolumen. Keine Interferenz mit Protein oder farbige Spezies.

Abbildung 2. CLD Versuchsaufbau sowohl mit oxidativem denitrosation von Ferricyanid und reduktive denitrosation mit Jodid / Jod-Assay mit Gasphase Nachweis von Stickstoffmonoxid Gas gespült.

Abbildung 3. (Feld A) Chemilumineszenz Detektion von Nitrit, RSNO, RNNO in reduktiven denitrosation Probe Assay durch Vorinkubation mit spezifischen Gruppe ChemicReagenzien al. Subtraktion von Peakflächen erlauben Nachweis von Nitrit und RSNOs. (Feld B) Chemilumineszenzdetektion von Nitrosylchlorid Häm-Spezies mit oxidativen denitrosation Lösung von Ferricyanid. Diese Methode ist spezifisch für die NO-Häm-Produkte mit keine Kreuzreaktion mit RSNOs (GSNO oder SNO-Albumin), oder RNNO (NO-Pyrrolidin und N-Nitroso-Albumin).

Abbildung 4. Ex vivo Organbad an isolierten Aorten-Ringen liefert ein direktes Maß der endothelialen NO-Produktion, die dann mit biochemischen Biomarkern mittels HPLC und CLD detektiert korreliert werden können. Diese Abbildung zeigt reduziert Entspannung bei Mäusen mit einer endothelialen Dysfunktion aufgrund einer verminderten NO-Produktion.

Die hier beschriebenen Methoden zur Quantifizierung der relevanten Metaboliten NO in mehreren biologischen Fächern wird für Fingerabdruck des NO Biologie in Gesundheit und Krankheit, die mit funktionellen Messungen von NO durch das Endothel korreliert werden können. Diese Methoden erfordern einfache Probenvorbereitung mit Potenzial für die Anpassung für hohen Durchsatz. Die relative Menge dieser Moleküle kann helfen, die Produktion von NO und seinen Stoffwechsel in einer Reihe von experimentellen Modellen von Krankheit und sogar serielle Proben von menschlichen Patienten. Es gibt viele Fallstricke bei der Aufdeckung von NO-basierter Biomarker und vielen analytischen Methoden künstlich erzeugen einige dieser Produkte bei der Probenvorbereitung. Eine sorgfältige Rechnungslegung an Nitrit in biologischen Proben ist entscheidend wegen seiner Reaktivität mit Cystein-Thiole ⁶ und Artefakt Bildung Nitrosothiole ^7. CLD basierte Methoden zum spezifischen Nachweis von Nitrit unter anaeroben Bedingungen führen inkonsistente Ergebnisse aufgrund der Aktivität der spezifischen Nitritreduktase Enzyme in verschiedenen biologischen Kompartimente ^8. Alle der hier beschriebenen Methoden sind gut dokumentiert und validiert und berücksichtigen Schritte zur Beseitigung oder Verringerung Artefakte ^9. Wir beschreiben kritische Schritte notwendig, um Artefakte zu vermeiden. Diese Multi-Kompartiment-Screening von NO-Metaboliten wird bei der Identifizierung von relevanten Biomarkern, die diagnostische oder prognostische Nutzen beim Menschen haben können und werden dann für die Entwicklung von standardisierten Methoden, die in der Klinik oder für Standard-Labor-Analyse verwendet werden können, ermöglichen helfen. Die jüngste Anerkennung eines menschlichen Stickstoffkreislauf wobei Nitrat und Nitrit zu NO durch einen enterosalivary Auflage von Nitrat ^10,11 reduziert eröffnet nun das Potenzial für den Einsatz von Speichel als potenzielle Biomarker für die NO-Status bei bestimmten Krankheiten. Um keinen Status Datum ist nicht Teil des Standard-Blutwerte regelmäßig zu diagnostischen Zwecken bei Patienten eingesetzt. Thwird, ist schockierend angesichts der kritischen Natur der NO vielen Krankheitsprozessen. Letztlich auf die Bestimmung Niveaus dieser NO Biomarkern durch einfach zu bedienen und vielleicht schneller Bettseite Point-of-Care-Tests nach entsprechender Validierung wird ein echter Beweis für ihre Rolle in der molekularen Medizin zu sein. Es ist an dieser Stelle für die konzentrierte und gemeinsame Anstrengungen auf dem Gebiet zu validieren und zu entwickeln, einen Standard und genaue Assay zur Bestimmung keinen Status in Tiermodellen für die Validierung beim Menschen klug. Die Methoden in diesem Protokoll beschriebenen erlauben anderen, rasch zu verabschieden, einen Konsens-Methode für solche Messungen.

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Autoren bedanken sich bei Hong Jiang, Ph.D. danke und Deepa Parathasarthy, MPH, BDS für die technische Unterstützung.