Un procedimiento de 1,5 horas para la identificación de Enterococcus Especies directamente los cultivos de sangre

Un protocolo rápido para la identificación directa de Enterococcus faecalis y otras especies de Enterococcus en un hemocultivo positivo con un ácido péptido nucleico ensayo de hibridación fluorescente in situ (FISH ANP).

Los enterococos son una causa común de bacteriemia por E. faecalis es la especie predominante seguido por E. faecium. Dado que la resistencia a la ampicilina y la vancomicina en E. faecalis es todavía poco común en comparación con la resistencia de E. faecium, el desarrollo de las pruebas rápidas que permitan diferenciar entre las especies de enterococos es importante para la terapia apropiada y vigilancia de la resistencia. La E. faecalis OE ensayo PNA FISH (AdvanDx, Woburn, MA) utiliza especie de ácido nucleico peptídico (ANP), sondas de fluorescencia en el formato de hibridación in situ y ofrece un tiempo de resultados de 1,5 horas y el potencial de proporcionar información importante para la especie el tratamiento. Estudios multicéntricos, para evaluar el desempeño de las 1,5 horas E. faecalis / OE procedimiento PNA FISH en comparación con el procedimiento del ensayo original de 2,5 horas y de métodos bacteriológicos estándar para la identificación de enterococos directamente de una botella de hemocultivo positivo.

1. Recogida y preparación de

1. Recoger la sangre venosa de pacientes con sospecha de sepsis y poner en dos BACTEC (BD, Sparks, MD) botellas de hemocultivos, una aeróbica y anaeróbica uno, con un total un conjunto de hemocultivo.
2. Botellas lugar en el BACTEC 9240 instrumento a 35 ° C.
3. Incubar hasta que el instrumento se activa la alarma por el crecimiento de organismos en la botella de hemocultivo.
4. Retire la botella del instrumento hemocultivo.

2. Preparación de los reactivos antes de la tinción

1. Prepare la solución de lavado mediante la adición de 4 ml de solución de lavado 60x seguido por 240 ml de agua dulce desionizada o destilada directamente al plato de tinción.
2. Coloque el plato en la tinción de la 55 ° C baño de agua a calentar.
3. Almacenar el concentrado restante a 2-8 º C.
4. Quite el soporte de montaje del refrigerador y la temperatura ambiente.

3. La tinción de Gram

1. Agite suavemente el frasco de cultivo de sangre.
2. Usando una aguja y una jeringa o un aparato de subcultivo, remover la sangre (aproximadamente 5 ml) de la botella y colocar en un tubo estéril tornillo tope.
3. Con una pipeta estéril, coloque una gota grande de sangre sobre un portaobjetos de vidrio.
4. Aire seco de la diapositiva y fijar con metanol durante 10 segundos.
5. Permita que seque al aire libre de diapositivas.
6. Realizar una tinción de Gram del frotis de sangre para determinar la morfología del organismo en crecimiento en la botella de hemocultivo.
7. El uso de un lente de inmersión en aceite, la vista de diapositivas. Cocos gram positivos en pares y cadenas cortas observado en la tinción de Gram es más consistente con especies de Enterococcus.
8. Este resultado tinción de Gram se determina la selección del kit de la sonda adecuada PNA FISH para el uso de la identificación de bacterias. Esta cultura de la sangre se colorean con la E. faecalis / OE PNA FISH mancha.

4. PNA FISH manchas

1. Mezclar el tubo que contiene la sangre suavemente por agitación antes de la preparación de frotis.
2. Coloque una gota de solución de fijación en el bienestar de un portaobjetos de microscopio PNA PESCADO.
3. Transferencia de 10 l, o una pequeña gota del tubo con el hemocultivo positivo a la solución de fijación y mezclar suavemente para emulsionar.
4. Fijar los frotis por calentamiento durante 20 minutos. a 55 ° C en una placa calefactora.

5. La calidad del material de control

Uno positivo y otro negativo de diapositivas de control de calidad deben ser probados con cada lote de diapositivas para la tinción.

1. Use E. faecalis / OE Control de diapositivas comprado AdvanDx para este fin o preparar los frotis de cultivos líquidos de cepas de referencia de E. faecalis y E. faecium como control positivo, ya sea en diapositivas independientes o mezclados en una diapositiva y Staphylococcus spp o Streptococcus spp como material de control negativo.

Los resultados de control de calidad debe ser capaz de controlar las condiciones de las pruebas adecuadas, en particular los que afectan a la hibridación rigor y la penetración de la pared celular, ya que la metodología PNA está diseñado para optimizar la penetración de la pared celular

6. Hibridación

1. Añadir una gota de E. faecalis / OE a la Autoridad Nacional Palestina y en el portaobjetos con la extensión.
2. Añadir cubreobjetos. Evite las burbujas de aire.
3. Incubar durante 30 ± 5 min. a 55 ± 1 ° C en la placa de calefacción
4. Después de la incubación a cabo las diapositivas en soporte de diapositivas

7. Lávese las estrictas

1. Soporte de diapositivas sumergirse en la solución de lavado precalentado a 55 ° C y retirar con cuidado el cubreobjetos. A menudo, los cubreobjetos se desliza suavemente agitando el portaobjetos en la solución de lavado. En ocasiones, los cubreobjetos se empujan suavemente con unas pinzas.
2. Incubar en la solución de lavado durante 30 ± 5 min. a 55 ± 1 ° C.
3. Eliminar las diapositivas de la solución de lavado
4. Permita que la diapositiva se seque al aire

8. Montaje

1. Añadir una gota de medio de montaje a cada diapositiva
2. Añadir cubreobjetos. Evite las burbujas de aire.
3. Examinar el portaobjetos en un microscopio de fluorescencia en 2 horas.
4. No exponga las transparencias a la luz solar directa u otras fuentes de luz intensa, ya que puede conducir a la extinción de fluorescencia.

9. Interpretación de los resultados

El microscopio de fluorescencia para el examen de diapositivas debe estar equipado con el filtro de banda AdvanDx doble y un objetivo de aceite de 60x o 100x. Las diapositivas de control de calidad deben examinarse en primer lugar para confirmar que la hibridación se produjo. E. faecalis debe aparecer como de color verde brillante fluorescente cocos en múltiples campos de la vista y el E. faecium aparecerá como cocos brillantes de color rojo. No enterococos portaobjetos de control debe aparecer no fluorescentes. Después de confirmar que el sistema en los controles, las diapositivas de los pacientes pueden ser examinados. En un primer momento la sangre film se adopta tonos rojizos, pero las de color rojo brillante y los cocos verdes será muy evidente.

Figura 1. Ejemplos representativos de verde-positivas E. faecalis (izquierda), rojo positivo E. faecium (centro) y negativa (derecha) resultados de la prueba.

10. Resultados representante

Tres instituciones se incluyeron en un ensayo clínico multicéntrico evaluando este PNA FISH mancha y la comparación de un protocolo de 2.5 horas para el protocolo de hora acortó 1.5 que acaba de ser revisado. Un total de 152 cocos Gram positivos rutina en pares y cadenas (GPC) frascos de hemocultivo positivo se incluyeron en los estudios. Hubo un 100% (152/152) concordancia entre los resultados de la modificación y el procedimiento de ensayo original de E. faecalis / OE PNA FISH: 41/41 E. faecalis, 33/33 otros enterococos y 78/78 GPC otros (Tabla 1). Este método de tinción había exquisita sensibilidad y especificidad en este estudio clínico (tabla 2).

Listado de la Tabla 1. Bacterias de prueba utilizando el estándar (2.5hr) y el protocolo rápido (1,5 horas).

Tabla 2. Sensibilidad y especificidad del protocolo PESCADO 1,5 horas PNA.

La E. faecalis / OE ensayo PNA FISH de enterococo puede proporcionar la identificación de 2-3 días antes que los métodos estándar de cultivo. El procedimiento abreviado para el ensayo (1,5 hourr) proporciona una rápida identificación que pueden ser utilizados para un mejor enfoque a la terapia antimicrobiana y la evolución del paciente. Un estudio para apoyar este fue realizado por Forrest, et al. (6). Durante dos años consecutivos a partir de 2005 el laboratorio de microbiología identificado cocos Gram positivos en pares y cadenas que crecen en frascos de hemocultivo por métodos microbiológicos convencionales y en 2006 agregando el E. faecalis / OE PNA PESCADO. Además, un algoritmo de tratamiento desarrollado por el equipo de las instituciones a los antimicrobianos (AMT) para utilizar con eficacia los datos PNA FISH generados por el laboratorio en forma oportuna. Resultado primario evaluado fue el tiempo de la cultura de extracción de sangre a la aplicación de la terapia antimicrobiana efectiva antes y después de PNA FISH fue instituido en el flujo de trabajo de los laboratorios. Gravedad de la enfermedad, la ubicación del paciente y el tratamiento antimicrobiano empírico se midieron. Un total de 224 pacientes con bacteriemia por enterococo adquiridas en el hospital fueron evaluados con 129 en el período pre-intervención y 95 en el período PNA FISH. PNA FISH identificó E. faecalis 3 días antes de que los cultivos convencionales (1,1 frente a 4,1 días, p <0,001). PNA FISH identificó E. faecium una mediana de 2,3 días anteriores (1,1 frente a 3,4 días, p <0,001) y se asoció con una reducción estadísticamente significativa en el tiempo de iniciar el tratamiento eficaz (1,3 vs 3,1 días, p <0,001) y la disminución de 30 días la mortalidad (26% versus 45%, p = 0,04). Este grupo llegó a la conclusión de que la E. faecalis / OE ensayo PNA FISH junto con un algoritmo de tratamiento AMT resultó en un inicio más temprano de la terapia adecuada antimicrobiano empírico para pacientes con E. faecium adquiridas en el hospital bacteriemia.

1. Los reactivos no deben utilizarse después de la fecha de vencimiento impresa en las etiquetas y los reactivos no se deben modificar de ninguna manera. La persona debe permanecer en el refrigerador cuando no esté en uso o podrían perder su potencia.
2. Botellas para hemocultivo deben ser mezclados antes del muestreo.
3. Es importante no permitir que la punta del frasco gotero toque el frotis de sangre, ya que puede causar la contaminación cruzada de material entre las diapositivas, o causar la contaminación del reactivo.
4. Asegúrese de que el baño de agua y el bloque de calefacción se mantienen a una temperatura constante a 55 ° C.
5. No utilice filtros que no sea el filtro de doble banda o los colores no discernir con claridad.
6. No utilice portaobjetos de microscopio que no sea el portaobjetos, la hibridación no se producirá.
7. Es importante que el microscopio está funcionando correctamente. Asegúrese de que la bombilla microscopio en el número de horas aprobadas para su uso.

• Algunas especies de Enterococcus raras que ocurren no son detectados por la sonda de PNA que hibrida con otras especies de Enterococcus, tales como E. asinii, E.dispar, haemoperoxidus E., cecorum E., E. columbae, saccharolyticus E., E. solitarius y E . sulfuroso.
• Moraviensis E. es identificado como E. faecalis debido a las similitudes de secuencia.
• Algunas cepas de Streptococcus anginosus producir una falsa fluorescencia verde positiva debido a las similitudes de secuencia.
• VersaTREK frascos de hemocultivo no se han evaluado en los estudios clínicos. El rendimiento para detectar E. faecalis y otras Enterococcus spp. con botellas VersaTREK hemocultivo es desconocida.
• Falsos positivos autofluorescencia verde puede ocurrir si un filtro estándar FITC se usa en lugar del filtro de doble banda.
• Los resultados falsos negativos pueden ocurrir con poca frecuencia debido al crecimiento mixto o debido a un error en la técnica de ensayo.
• El tipo y el estado de la instrumentación utilizada influirá en el aspecto visual de la imagen obtenida. La fluorescencia puede varydue con el tipo de microscopio empleado, la fuente de luz y el nivel de rRNA en las células
• El aislamiento en medio sólido es necesario para diferenciar el crecimiento se mezcla con otros organismos e identificar cultivos positivos de sangre da un resultado negativo.
• El producto no ha sido validado con muestras diferentes a los cultivos de sangre.

Los estudios fueron patrocinados por AdvanDx.