Unsere Forschung bietet einen nützlichen Leitfaden für die Untersuchung der biochemischen Wechselwirkung zwischen dem Mikrobakterium tuberculosis und mikrobiellen Sensoren, die menschliche Mikrophagen exprimieren, und wird für die steiferen Moleküle relevant sein, die eine Rolle beim Eintritt des Mikrobakteriums tuberculosis in die Fibrozyten spielen. Die Rezeptorinteraktion wurde im Laufe der Jahre mit Ansätzen untersucht, die in der Regel die Verwendung von Reportermaschinen, hermetischen Molekülen, nivellierten rekombinanten Proteinen, Knockout-, Knockdown- und niedrigeren Expressionsmodellen verwenden. Diese Techniken können herausfordernd, zeitaufwändig und manchmal teuer sein.
Mit dem veröffentlichten Protokoll zeigen wir zum ersten Mal, dass der SLMF1-Rezeptor in Makrophagen mit Mycobacterium tuberculosis interagiert, die bakterielle Aufnahme fördert und zur endolysosomalen Reifung führt. Wir haben die Schwierigkeiten im Zusammenhang mit Genexpressionsexperimenten überwunden und ein neues Ziel für neue therapeutische Strategien beschrieben. Unser Protokoll bietet zwei Alternativen zum Nachweis der biochemischen Wechselwirkung zwischen dem Mikrobakterium tuberculosis und dem mikrobiellen SLMF1-Sensor mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie, zwei üblicherweise verfügbaren und erfolgreich eingesetzten Techniken.
Diese Methodik hat viele Anwendungsmöglichkeiten und kann leicht in anderen Forschungskontexten adaptiert werden. Wir stellen ein einfaches Protokoll zur Verfügung, das die Interaktion mit Mycobacterium tuberculosis-Rezeptoren mit ganzzelligen inaktivierten und beschallten Bakterien bewertet, das unter BSL2-Bedingungen durchgeführt werden kann, aber leicht an andere Rezeptoren und lebende Stämme angepasst werden kann. Bei Bedarf könnten diese Assays auch unter BSL3-Bedingungen mit verschiedenen lebenden Erregern durchgeführt werden.
Füllen Sie zunächst das von gesunden Spendern gesammelte Blut vorsichtig in 50-Milliliter-Röhrchen um und verdünnen Sie es mit Kochsalzlösung auf die Hälfte seines Volumens. Bereiten Sie ein Dichtegradientenmedium vor und zentrifugieren Sie die Probe, um mononukleäre Zellen des peripheren Blutes, PBMCs, zu trennen. Sammeln Sie die PBMCs aus dem weißlichen Halo.
Nachdem Sie die Zellen in einer Zellzählkammer gezählt haben, führen Sie eine magnetische Selektion mit CD14-Kügelchen durch, um die CD14-positiven Monozyten zu sammeln. Resuspendieren Sie dann die isolierten Zellen im RPMI 1640-Medium. 500 Mikroliter CD14-positive Monozyten in einer Konzentration von eins mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter in jede Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte in Serumabwesenheit aussäen, um die Adhärenz zu fördern.
Waschen Sie die Vertiefungen nach zwei Stunden mit vorgewärmtem RPMI 1640 Medium, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Differenzieren Sie die Monozyten in Makrophagen mit einem Milliliter vollständigem RPMI 1640-Medium für 16 bis 18 Stunden. Waschen Sie die Vertiefungen am nächsten Tag mit einem Milliliter PBS und geben Sie jeweils einen Milliliter vollständiges RPMI 1640-Medium in jede Vertiefung.
Stimulieren Sie die Makrophagen mit 10 Mikrolitern beschallten Mycobacterium tuberculosis-Antigenen für 24 Stunden. Entsorgen Sie am nächsten Tag mit einer P-1000-Pipette das vollständige RPMI-Medium aus den Vertiefungen der Platte. Fügen Sie kaltes PBS hinzu und pipettieren Sie es auf und ab, um die Makrophagen zu ernten.
Übertragen Sie die Zellen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in einem supplementierten Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer resuspendiert.
Inkubieren Sie die Suspension eine Stunde lang auf Eis und wirbeln Sie sie alle 10 Minuten vortexen. Die Suspension wird 15 Minuten lang bei 14.000 g zentrifugiert und der Überstand aufgefangen. Inkubieren Sie einmal 10 hoch sechs ganze inaktivierte Mycobacterium tuberculosis-Zellen mit 50 Mikrolitern Proteinextrakt von eins mal 10 hoch sechs Makrophagen über Nacht bei vier Grad Celsius in einem rotierenden Mikroröhrchenhalter.
Um den Proteinbakterienkomplex zu färben, geben Sie am nächsten Tag den Anti-Human-Antikörper SLAMF1 in das Mikroröhrchen, wirbeln Sie die Mischung vor und inkubieren Sie über Nacht 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Nachdem Sie die Proteinbakterienkomplexe mit FACS gewaschen haben, resuspendieren Sie sie in FACS-Puffer und entnehmen Sie die Probe auf einem Durchflusszytometer. Setzen Sie mit einer chirurgischen Pinzette mit runder Nase 12 Millimeter breite Deckblätter in die Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte ein.
Inkubieren Sie das Deckglas eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit Mycobacterium tuberculosis-Rhodamin-Antigenen. Nach der Inkubation 100 Mikroliter Proteinextrakt, verdünnt in 300 Mikrolitern PBS, zugeben und zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren inkubieren. Wickeln Sie den Deckel der Kulturplatte mit Paraffinfolie ein.
Geben Sie einen 60-Mikroliter-Tropfen eines zuvor titrierten Anti-SLAMF1-Primärantikörpers auf den mit Paraffinfilm bedeckten Deckel. Entfernen Sie das Deckglas vorsichtig mit einer gebogenen chirurgischen Pinzette und Nadeln mit feiner Spitze von der Platte. Nach der Inkubation mit Primär- und Sekundärantikörperlösung überschüssige Flüssigkeit entfernen und den Deckglas auf einen Tropfen Eindeckflüssigkeit aufsetzen, der auf einen Objektträger gegeben wird.
Legen Sie den Objektträger unter ein Fluoreszenzmikroskop und beobachten Sie die Zellen mit geeigneten Filtern. Monozyten wurden erfolgreich aus PBMCs mit einer Reinheit von 95 % oder mehr isoliert, und von Monozyten abgeleitete Makrophagen wurden nach Adhärenz und Übernachtkultur erzeugt. Die Oberflächenexpression von SLAMF1 wurde in Makrophagen induziert, die mit Mycobacterium tuberculosis-Antigenen stimuliert wurden, und ihre Spiegel wurden mittels Durchflusszytometrie bestätigt.
Die Interaktion zwischen SLAMF1 und Mycobacterium tuberculosis ganzen Zellen wurde mit einem Cross-Linking-Assay und anschließender Durchflusszytometrie nachgewiesen. Die Interaktion zwischen dem SLAMF1 und den Mycobacterium tuberculosis-Antigenen wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, wobei die Co-Lokalisation durch zusammengeführte Bilder bestätigt wurde.
