私たちの研究は、結核菌とヒトのマイクロファージを発現する微生物センサーとの間の生化学的相互作用を研究するための有用なガイドを提供し、結核菌の線維細胞への侵入に関与するより硬い分子に関連しています。受容体相互作用は、レポーターマシン、気密分子、平準化組換えタンパク質、ノックアウト、ノックダウン、低発現モデルなど、通常使用するアプローチを用いて長年にわたって研究されてきました。これらの手法は、困難で、時間がかかり、場合によっては費用がかかる場合があります。
公開されたプロトコルを使用して、マクロファージでは、SLMF1受容体が結核菌と相互作用し、細菌の取り込みを促進し、エンドリソソームの成熟につながることを初めて示します。私たちは、遺伝子発現実験に伴う困難を克服し、新しい治療戦略のための新しいターゲットを記述しました。私たちのプロトコルは、フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡を使用して、結核菌とSLMF1微生物センサーとの間の生化学的相互作用を検出するための2つの選択肢を提供します。
この方法論には多くの潜在的な用途があり、他の研究状況にも簡単に適応できます。私たちは、全細胞の不活化および超音波処理細菌を使用して結核菌受容体の相互作用を評価する簡単なプロトコルを提供します。これはBSL2条件下で実行できますが、他の受容体や生株に容易に適応できます。必要に応じて、これらのアッセイは、異なる生きた病原体を用いたBSL3条件下でも実施できます。
まず、健康なドナーから採取した血液を慎重に50ミリリットルのチューブに移し、生理食塩水でその体積の半分に希釈します。密度勾配培地を調製し、サンプルを遠心分離して末梢血単核細胞(PBMC)を分離します。
細胞計数チャンバーで細胞をカウントした後、CD14ビーズで磁気選択を行い、CD14陽性単球を採取します。次に、単離した細胞をRPMI 1640培地に再懸濁します。CD14陽性単球500マイクロリットルを、血清非存在下で24ウェル細胞培養プレートの各ウェルに10倍10の濃度で播種し、接着を促進する。
2時間後、予熱したRPMI 1640培地でウェルを洗浄し、非接着性細胞を除去します。1ミリリットルの完全RPMI 1640培地を16〜18時間使用して、単球をマクロファージに分化します。翌日、ウェルを1ミリリットルのPBSで洗浄し、各ウェルに1ミリリットルの完全なRPMI 1640培地を追加します。
10マイクロリットルの超音波処理された結核菌抗原でマクロファージを24時間刺激します。翌日、P-1000ピペットを使用して、プレートのウェルから完全なRPMI培地を廃棄します。冷たいPBSを加え、ピペットで上下させてマクロファージを採取します。
細胞を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。チューブを500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを補充した放射性免疫沈降アッセイバッファーに再懸濁します。
懸濁液を氷上で1時間インキュベートし、10分ごとにボルテックスします。懸濁液を14, 000Gで15分間遠心分離し、上清を収集します。回転するマイクロチューブホルダーで、回転するマイクロチューブホルダー内で、50マイクロリットルのタンパク質抽出物から1×10の6マクロファージの累乗で、1×10を6つのマクロファージの累乗で1×10にインキュベートします。
翌日、タンパク質細菌複合体を染色するために、マイクロチューブに抗ヒトSLAMF1抗体を添加し、混合物をボルテックスし、暗所で摂氏4度で30分間インキュベートします。タンパク質細菌複合体をFACSで洗浄した後、それらをFACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメーターでサンプルを採取します。丸い鼻の外科用ピンセットを使用して、12ミリメートルの丸いカバーを24ウェル培養プレートのウェルに滑り込ませます。
カバースリップを結核菌ローダミン抗原と37°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、300マイクロリットルのPBSで希釈した100マイクロリットルのタンパク質抽出物を加え、撹拌しながら室温で2時間インキュベートします。培養プレートの蓋をパラフィンフィルムで包みます。
以前に滴定した抗SLAMF1一次抗体を60マイクロリットル滴下し、パラフィンフィルムで覆われた蓋に添加します。湾曲した細い先端の外科用ピンセットと針を使用して、カバースリップをプレートから慎重に取り外します。一次抗体溶液および二次抗体溶液とインキュベートした後、余分な液体を取り除き、スライドガラスの上に置いた一滴の封入液にカバースリップをマウントします。
スライドを蛍光顕微鏡に置き、適切なフィルターを使用して細胞を観察します。単球は95%以上の純度でPBMCから単離に成功し、単球由来マクロファージは接着および一晩培養後に生成されました。SLAMF1表面発現は、結核菌抗原で刺激されたマクロファージで誘導され、そのレベルはフローサイトメトリーを用いて確認されました。
SLAMF1と結核菌全細胞との相互作用は、架橋アッセイとそれに続くフローサイトメトリーを用いて実証されました。SLAMF1と結核菌抗原との相互作用を蛍光顕微鏡で可視化し、共局在をマージ画像で確認しました。
