Dieses Protokoll kann helfen, die Mechanismen der KCC2-Regulation zu verstehen, indem es die Phosphorylierung seiner Kinase-Molekülgröße direkt bewertet und so Aufschluss über seine physiologischen Funktionen und Aktivitäten gibt. Es kann verwendet werden, um Moleküle wie Proteine von Interesse aus komplexen Mischungen verwandter Moleküle zu identifizieren und zu charakterisieren, selbst wenn eine Proteinexpression sehr klein ist. Die Technik ist ein wesentliches Werkzeug für die Proteinanalyse komplexer Systeme und die Identifizierung potenzieller Mechanismen, die einer aberranten Gewebefunktion oder -erkrankung zugrunde liegen.
Die Verfahren wird Sunday Solomon Josiah, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie mit der Vorbewaffnung aller Reagenzien im 37 Grad Celsius heißen Perlenbad und dem Auftauen der stabil transezierten Ratte KCC2b humane embryonale Nierenzellen vollständig im Perlenbad. Dann werden die Zellen aus dem Kryo-Fläschchenröhrchen in ein Zentrifugenröhrchen mit fünf Milliliter frischem Medium überführt und die Zellen bei 1.200 G für drei bis fünf Minuten zentrifugiert.
Nach dem Absaugen des Überstands mit einer an einer Vakuumpumpe befestigten Aspiratorpipette resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter frischem Medium. Die Suspension auf eine 10 Zentimeter große Tellerplatte geben und 48 Stunden in einem Inkubator mit 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid wachsen lassen. Sobald die Zellen 90% Konfluenz erreicht haben, teilen Sie sie, indem Sie die alten Medien absaugen und mit zwei Milliliter PBS spülen.
Fügen Sie zwei Milliliter Trypsin hinzu und inkubieren Sie sie für etwa ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die trypsinisierten Zellen mit zwei Milliliter des kompletten Mediums. Fügen Sie neun Milliliter frische Medien zu den neuen Gerichten hinzu.
Dann einen Milliliter Lösung aus der alten Schale in die neue Schale geben. Übertragen Sie die gespaltenen Zellschalen für 48 Stunden in den Inkubator, um eine Konfluenz von mehr als 90% zu erreichen. Behandeln Sie die Zellen entweder mit Dimethylsulfoxid, acht Mikromolaren Staurosporin oder 0,5 Millimolar N-Ethylmaleimid für 15 Minuten vor der Ernte im Lysepuffer.
Saugen Sie die Medien aus der transezierten Kulturschale ab, stellen Sie das Kulturgeschirr auf Eis und waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS. Saugen Sie das PBS ab und geben Sie 1,0 Milliliter eiskalten Lysepuffer in die Schale. Nach dem Abkratzen der Zellen vom Boden der Schale mit einem kalten Kunststoffzellenschaber wird die Zellsuspension in ein auf Eis gelegtes Mikrozentrifugenröhrchen überführt, gefolgt von konstantem Rühren für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.
Nach dem Zentrifugieren der Zelllysate in einer kalten Zentrifuge auf Eis legen. Sammeln Sie den Überstand in ein vorgekühltes frisches Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet. Pipettieren Sie 300 Mikroliter Protein G Sepharose in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
Dann zentrifugieren Sie die Lösung bei 500 G für zwei Minuten. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie 500 Mikroliter PBS hinzu und wirbeln Sie gut. Verwerfen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und wiederholen Sie den Schritt.
Als nächstes mischen Sie ein Milligramm Anti-KCC2-Threonin-906- und Anti-KCC2-Threonin-1007-Antikörper mit 200 Mikrolitern Protein G Sepharose-Perlen, bevor Sie das Volumen mit PBS auf 500 Mikroliter auffüllen. Nachdem Sie zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einer vibrierenden Plattform oder einem rotierenden Rad geschüttelt haben, wiederholen Sie zwei Wäschen mit PBS. Führen Sie eine Proteinquantifizierung an den Zelllysaten durch und fügen Sie ein Milligramm des Zelllysats zu den gewaschenen Beads hinzu und inkubieren Sie in einem End-to-End-Rotator, bevor Sie sich abdrehen.
Geben Sie drei Wäschen mit PBS, das 150 Millimolar Natriumchlorid enthält, gefolgt von drei Wäschen mit 200 Mikrolitern PBS, bevor Sie das endgültige Pellet in 100 Mikroliter LDS-Probenpuffer resuspendieren. Schütteln Sie die Röhrchen in einem Rotorschüttler fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie sie in einem Heizblock und zentrifugieren Sie sie, bevor Sie den Überstand zum Beladen des Gels verwenden.
Montieren Sie den Western Blot-Gießapparat und gießen Sie frisch zubereitetes 8% Trenngel, um das Gel zu gießen, so dass etwa zwei Zentimeter Platz von der Oberseite des Gießglases bleiben. Fügen Sie dem Aufbau 200 Mikroliter absolutes Isopropanol hinzu und lassen Sie es 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Entfernen Sie das Isopropanol mit einer Pipette und spülen Sie das Gel vorsichtig mit etwa 200 Mikrolitern destilliertem Wasser ab.
Nach Zugabe von frisch zubereitetem 6%-Stapelgel in den Gießaufbau vorsichtig in den Brunnenkamm passen und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Dann fixieren Sie das gegossene Gel in den Elektrophoresetank. Nachdem Sie den laufenden Puffer in den Tank gegossen haben, laden Sie fünf Mikroliter Molekulargewichtsmarker in die erste Vertiefung und eine gleiche Menge Protein in jede Vertiefung des SDS-PAGE-Gels.
Füllen Sie die leeren Vertiefungen mit LDS und lassen Sie das Gel etwa 90 bis 120 Minuten bei 120 Volt laufen. Rehydrieren Sie die Nitrocellulosemembran mit einem Transferpuffer, der 20% Methanol enthält. Spülen Sie das Gel und die Membran mit dem Transferpuffer ab und verteilen Sie sie vorsichtig auf dem Vorbereitungsstapel.
Ordnen Sie das zu übertragende Sandwich in dieser Reihenfolge an:negative Elektrode, Sandwichschaum, Filterpapier gespültes SDS-PAGE Gel, gespülte Nitrozellulosemembran, Filterpapier, Sandwichschaum, positive Elektrode. Sobald Sie fertig sind, stapeln Sie das zusammengebaute Sandwich in den Transfertank und laufen Sie mit 90 Volt für 90 Minuten oder 30 Volt für 360 Minuten. Blockieren Sie die trockene Membran für eine Stunde bei Raumtemperatur mit einem Blockierpuffer.
Inkubieren Sie die Membranen mit geeigneten Verdünnungen von primärem Antikörper und Beta-Aktin im Blockpuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Dann geben Sie drei Wäschen TBST für jeweils fünf Minuten. Inkubieren Sie die gewaschene Membran mit einem sekundären Antikörper, der in einem blockierenden Puffer für 60 Minuten verdünnt ist, und wiederholen Sie drei TBST-Wäschen.
Wenn Sie fertig sind, legen Sie die gewaschene Membran auf die Bildtafel. Um die Signale zu entwickeln, verteilen Sie die vorbereitete Lösung, indem Sie gleiche Volumina jedes verbesserten Chemilumineszenzreagenz auf der Membran mischen, bevor Sie die Bildgebungskarte zur Bildgebung an das Bildgebungssystem übertragen. Die Behandlung von HEK293-Zellen mit Staurosporin und N-Ethylmaleimid oder NEM verursachte eine verminderte Phosphorylierung an SPAK-Zielstellen, Threonin 233 in der T-Loop-Kinase-Domäne und der S-Loop-Phosphorylierungsstelle Serin 373 von endogen exprimiertem SPAK.
Staurosporin reduzierte die Phosphorylierung von Serin 940 in HEK294-Zellen, die KCC2b stabil exprimierten, aber NEM erhöhte signifikant seine Phosphorylierung. Darüber hinaus verringert Staurosporin die Phosphorylierung an der Threonin-505-Stelle, während NEM einen leichten, aber unbedeutenden Anstieg der Phosphorylierung an derselben Stelle verursacht. Die unterschiedlichen Wirkungen beider Verbindungen auf die Phosphorylierung der Proteinkinase C an der Threonin-505-Stelle und KCC2b an der Serin-940-Stelle korrelieren gut.
Das repräsentative Ergebnis zeigte auch, dass NEM einen signifikanten Anstieg der Expression der Gesamtmenge KCC2 verursachte, während die Expression von Gesamt-NKCC1 und SPAK nicht signifikant verändert wurden, wenn sie mit beiden Verbindungen behandelt wurden. Darüber hinaus verursachten die beiden Verbindungen eine verminderte Phosphorylierung von SPAK an Threonin 233- und Serin-373-Stellen, und dies korrelierte mit der verkürzten Phosphorylierung von Threonin 906/1007 und Threonin 203/207/212 bzw. endogen exprimiertem NKCC1. Darüber hinaus reduzierten und erhöhten Staurosporin und NEM die Phosphorylierung der Proteinkinase C an der Serin-940-Stelle bzw. stabil exprimierten KCC2b, was mit der Reduktion und Erhöhung der Phosphorylierung der Proteinkinase C-Delta an der Threonin-505-Stelle nach Staurosporin bzw. NEM-Behandlung korrelierte.
Wenn ein falscher primärer oder sekundärer Antikörper verwendet wird, wird die Bande während der Bildgebung nicht gesehen. Außerdem ist das Signal möglicherweise nicht sichtbar, wenn eine zu niedrige Antikörperkonzentration verwendet wird. Die Technik ist ein relevantes Werkzeug in der quantitativen Analyse von Proteinen und hat ihre Verwendung für viele wissenschaftliche und Ressourcenzwecke ermöglicht, einschließlich als effektives Frühdiagnoseinstrument.
