This work was supported by NIH grant GM085232 and an Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (to A.A.).

1. Lipid Vorbereitung <ol><li> Aliquot die gewünschte Menge Lipide in eine klare Glasröhre. Du Siehst. coli polaren Lipidextrakt, aber die meisten Lipidzusammensetzungen verwendet werden. Wenn die Lipide in Form von Pulver, resuspendieren sie in Chloroform bis zu einer Konzentration von 20 mg / ml. Trocknen der Lipide bei RT unter N 2 -Gas, bis das gesamte Lösungsmittel verdampft ist. </li><li> Resuspendieren der Lipide in Pentan und trocknen Sie es wieder einen stetigen Strom von Gas N 2 zu übrig gebliebenen Spuren von Chloroform zu entfernen. Trocken, bis alle Lösungsmittel verdampft. Während des Trocknens, stark drehen das Rohr, so dass das Lipid in einer gleichförmigen Film, der die untere Drittel des Rohres anstelle einer Bildung einer dichten Masse am Boden verteilt. </li><li> Hinzufügen der Rekonstitutionspuffer enthält Detergens (300 mM KCl, 50 mM Zitronensäure, 25 mM K 2 HPO 4, pH 4,5, 35 mM CHAPS), um die Lipide zu lösen. Benutzen Sie anderen milden Reinigungsmitteln für diesen Schritt, wenn das Protein ist schlecht, tolerant zu CHAPS. </li><li> Resuspend die Lipide zur Klarheit mit einem Wasserbad Sonicator. Tauchen Sie den Schlauch in der Mitte des Wassers Ultraschallbad bei maximaler Leistung in kurzen (30 sec-1 min) mit kurzen Impulsen (30 sec-1 min) unterbricht. Die Lösung sollte klar sein. HINWEIS: Die endgültige Grad an Klarheit erreicht, hängt von der spezifischen verwendeten Lipid-Zusammensetzung. Einige von Charge zu Charge Variation in diesem Schritt auch bei nominell identischen Lipiden ist ebenfalls möglich. Resttrübung aufgrund der Lichtstreuung durch große Partikel in der Suspension, welche durch Zentrifugation entfernt werden kann. </li><li> Inkubieren der resuspendierten Lipide bei RT für 20-60 min. </li></ol> 2. Proteoliposom Bildung HINWEIS: Verschiedene Strategien können verwendet werden, um das Detergens-solubilisierten Protein in Liposomen einfügen. Für CLC-ec1 Dialyse funktioniert gut und ist daher das Mittel der Wahl 6,9,10. <ol><li> Füge das gereinigte Protein, das gewünschte Protein-zu-Lipid (P / L) Verhältnis (in ug o ausgedrückt<html> f Protein / mg Lipid). Die Wahl von P / L-Verhältnis hängt von dem Zweck des Experiments. <ol><li> Wenn es das Ziel ist es, die Aktivität des Proteins von Interesse zu bewerten, zu rekonstituieren bei hohen P / L&#39;s, um das Signal zu maximieren, da jedes Liposom mehrere Kopien des Proteins enthält. Um die Aktivität und / oder einheitlichen Transportrate des Proteins zu quantifizieren, zu rekonstituieren in einer Poisson Verdünnungsregelung bei niedrigen P / L&#39;s, so daß jedes Vesikel enthalten durchschnittlich 1 Protein. Siehe Schritt 7 und Diskussion für eine tiefergehende Analyse, wann die einzelnen Regime zu nutzen. </li></ol></li><li> Um die optimale P / L-Werte für die verschiedenen Schemata zu bestimmen, führen eine vollständige Titration der Aktivität als Funktion der Proteinkonzentration 8,11-13. Jedoch für jedes Protein, für das das Molekulargewicht (MW, in kDa exprimiert) der aktiven Einheit ist bekannt folgende P / L-Werte als Anfangs guesstimates verwendet werden: pg &quot;/&gt; <img alt="Gleichung 2" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq2.jpg" /></li><li> Geladen, die das Protein und Lipidgemisch in eine vorbefeuchtete Dialyserohr oder eine Kassette. Platzieren der Dialyseeinrichtung in einem Becherglas mit 500-1,000x das Volumen der Lipid Rekonstitutionspuffer (dh 1 l Puffer für 1 ml Lipid Resuspension) unter vorsichtigem Rühren. <ol><li> Ändern Puffer 3-4 mal im Abstand&gt; 3 Std. Bei jeder Lösung Wechsel, waschen Sie die Kassette / Schläuche und das Becherglas mit destilliertem Wasser und füllen Sie den Becher mit frischem Rekonstitutionspuffer. Fügen Sie 1-2 O / N Intervalle für die Lösung zu ändern. Die genaue Anzahl und die Dauer der Lösung ändert sich abhängig von der genauen Lipid und Detergentien verwendet. </li></ol></li><li> Nachdem der letzte Schritt ist, entfernen Sie die Liposomen aus dem Dialysegefäß, aliquotieren sie in Rohre und Flash frieren sie in flüssigem N 2 oder Einfrieren bei -80 ° C. </li></ol> 3. Aufnahme Set-up &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Hinweis: Die Aufnahme-Setup (Abbildung 2A) besteht aus zwei Kammern (Flachboden-Zylinder, ~ 3-4 ml Volumen), eine Cl - (siehe unten) Elektrode, einem pH-Meter mit einem Analog- oder digitale elektrische Ausgang, einen Digitalisierer und einen Computer mit einem entsprechenden Erfassungssoftware. <ol><li> Verbinden der Cl - Elektrode mit dem pH-Meter, das Ausgangssignal des pH-Meter auf dem Digitalisierer die an den Computer angeschlossen ist. Legen Sie die Referenzelektrode in einer Kammer und die Umkodierung Draht in die andere (2B). HINWEIS: Die Polarität der Leitungen ist korrekt, wenn AV Cal (siehe Schritt 6.4 und 7.2) ist positiv. </li><li> Legen Sie die Kammern auf einer Rührplatte mit einem Rührstäbchen in den Aufnahmeraum (Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, der Rührstab nicht die Elektrode berühren. </li><li> Schließen der Kammern mit einem Agarbrücke (2B) (100 mM KCl und 2% Agarose). Bewahren Sie die Agar-Brücken in 100 mM KCl. </li&gt; </ol> 4. Vorbereitung der Cl - Elektroden <ol><li> Nehmen Sie einen alten und -possibly- nicht funktionierende pH-Elektrode. Brechen Sie die Glas-Beschichtung, um die Silberdrähte vollständig offenbaren. </li><li> Die Beschichtung vorsichtig aus der Silberdrähte mit einem Skalpell. Reinigen Sie die Drähte mit reichlich H 2 O und EtOH. </li><li> Platz in einer gesättigten Lösung von FeCl 3 (oder Bleichmittel), bis Drähte mit einem einheitlichen dunklen Mantel AgCl bedeckt. </li></ol> 5. Herstellung von unilamellaren Vesikeln <ol><li> In der Nacht vor den Experimenten, schwellen 1 g Sephadex G-50-Perlen in 15 ml externen Puffer (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM Zitronensäure, pH 4,5) unter leichtem Schütteln (nicht rühren) für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur vor dem Gebrauch. Jedes Experiment erfordert ~ 3 ml geschwollene Perlen. Halten Sie die geschwollenen Perlen bei 4 ° C für ein paar Tage in den meisten. </li><li> Während die Liposomen bei RT aufgetaut, gießen Sie in jeder Spalte ~ 3 ml geschwollene G-50-Perlen. Lassen Sie sie trocknen durch Schwerkraft bei RT; Dies dauert in der Regel 1-2 min. </li><li> Bereiten unilamellare Vesikel durch Extrudieren des Proteo 11 Mal durch ein Mini-Extruder mit einer 0,4 m Teflon-Cutoff. </li><li> Die Säule in einem Kunststoffrundrohr. Drehen Sie die Spalten, um überschüssige Lösung zu entfernen. Zentrifugieren Sie für 20 bis 30 s bei 1400 x g in einer klinischen Zentrifuge. </li><li> Durchfluss verwerfen, statt Spalte in einer 13 x 100 mm Glasröhrchen und fügen Sie 100 ul der extrudierte Vesikel an der Säule. Spin Säule für 1 min bei 500 xg in einer klinischen Zentrifuge. </li><li> Sammeln ~ 200 ul Durchströmung zu dem Aufzeichnungskammer in Schritt 6.5 hinzugefügt wird. </li></ol> 6. Efflux Mess <ol><li> Je 2 ml 100 mM KCl in der Referenz (Masse) Kammer und 1,8 ml der externen Puffer (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM Citronensäure, pH 4.5) zur Aufnahme Kammer. Der leichte osmotischen Ungleichgewicht zwischen der internenund externe Lösungen wirkt sich nicht auf </li><li> Starten Sie die Aufnahme-Programm. Lassen Sie die Grundlinie ins Gleichgewicht kommen, dies kann einige Minuten dauern. </li><li> Sobald das Signal eine stabile Basislinie (die Liposomen bereit sind und die Spalten trocknen) erreicht, startet die Aufnahme (3A). </li><li> Werden 15 ul einer 10 mM KCl-Lösung, um das System (2A) zu kalibrieren. </li><li> In Liposomen. Von Proteoliposomen (3A) - ein kleiner Sprung vielleicht aufgrund einer unvollständigen Entfernung der externen Cl sichtbar. Warten Sie, bis die Grundlinie stabilisiert. </li><li> Hinzufügen Valinomycin (1 ul 1 mg / ml in EtOH) zum Ausströmen (3A) zu initiieren. </li><li> Lassen Sie die Auslauf laufen ihr zeitlicher Verlauf, bis es Plateaus (3A). </li><li> Hinzufügen von 40 ul von 1,5 M β-Octylglucosid (β-OG) in dem externen Puffer alle Liposomen (3A) zu lösen, hergestellt. Beenden Sie die Aufnahme. </li></ol> 7. Daten Analyse <ol><li> Exportieren Sie die Trace-Datei von der im ASCII- oder Text-Format und importieren Sie sie in die Analyse-Programm der Wahl. </li><li> Messen Sie die Spannung an den folgenden Punkten (3A): Zu Beginn der Aufnahme (V 0); Nach Zugabe des Eichpulses (V cal); Nach der Zugabe der Liposomen (V lipo); Am Ende des Auslauf (V fin); Nach Zugabe von Reinigungsmittel (V ges); Grundlinie die Spannungen so dass V 0 = 0 ist. </li><li> Verwenden Sie die Nernst-Planck-Gleichung, um den experimentellen Wert bestimmen <img alt="Gleichung 3" fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq3.jpg" /> durch Messung <img alt="Gleichung 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq4.jpg" /> Wo Vol Cal ist das Volumen der Kalibrierungspuls in ul, 1.800 wird das Kammervolumen zu Beginn des Experiments in exprimiert1, l, [Cl] cal / in sind die Cl - Konzentrationen der Kalibrierungsimpuls und der externen Puffer in mM und AV cal ist der Sprung in mV nach dem Kalibrierungsimpuls gemessen. ANMERKUNG: Diese empirische Bestimmung α dient drei Zwecken: sie gewährleistet, dass das System korrekt reagiert, bietet ein Maß für die Konsistenz der Reaktion des Instruments zwischen den Experimenten als auch zu prüfen, dass keine Fehler in der Lösung Herstellung hergestellt. </li><li> Berechnen Sie die Cl-Konzentrationen nach jedem Schritt wie folgt: <img alt="Gleichung 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq5.jpg" /> <img alt="Gleichung 6" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq6.jpg" /> <img alt="Gleichung 7" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq7.jpg" /> Der Faktor 3/400 kommt von der Verdünnung der 15 &amp; mgr; l Kalibrierungspuls in die 2.000 &amp; mgr; l Endvolumen. </li><li> Calculaßen die Veränderungen in [Cl] bei jedem Schritt, ΔCl Lipo / end / ges. </li><li> Konvertieren V (t) in Cl (t) mit <img alt="Gleichung 8" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq8.jpg" /> Die [Cl] Werte direkt zu bestimmen, an den kritischen Punkten und vergleicht sie mit den berechneten Werten als eine interne Kontrolle. </li><li> Normalisieren der Spur, so dass das Cl rel Lipo = 0 und Cl rel tot = 1 <img alt="Gleichung 9" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq9.jpg" /></li><li> Den Auslaufzeit natürlich der folgenden Gleichung: <img alt="Gleichung 10" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq10.jpg" /> Wobei L die Rate der Cl - Leck, die experimentell durch Messung bestimmt wird Cl - Efflux aus proteinfreien Liposomen unter den gleichen Bedingungen und τ hergestellt wird die Zeitkonstante des Prozesses. </li><li> Berechnen v, die Anfangsgeschwindigkeit: Wo ΔCl Rippe in millimolaren ausgedrückt und V das Volumen der Kammer in ul. </li><li> Berechnen Sie die Transportgeschwindigkeit / Leitwert <img alt="Gleichung 12" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq12.jpg" /> Wobei p der P / L, MW das Molekulargewicht des aktiven Komplexes, ausgedrückt in kDa </li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

Transport von gereinigtem anionenselektive Kanäle oder Transporter in Liposomen rekonstituiert vermittelt - haben wir ein ausführliches Protokoll zu messen Cl beschrieben. Das verwendete Beispiel war der prokaryotischen H + / Cl - Tauscher CLC-ec1. Jedoch kann die Methodik leicht angepasst, um Kanäle durch Liganden 12,13,15, 11,12 Spannung oder sportlich verschiedenen anionischen Selektivität 15,16 durch Ersetzen des Ag gated untersuchen: AgCl-Elektrode mit einem für den Ionen erwogen. Elektroden selektiv für andere als Cl - Ionen, wie H +, I - und F -, sind im Handel erhältlich. Eine Diskussion über einige der wichtigsten Schritte und Annahmen zu folgen. Grenzen der Poisson-Verdünnung davon Die Ableitung des unitären Rate (Gleichung 7-9) ist nur in einer Poisson Verdünnungsregelung, wenn die meisten Liposomen contain nur ein aktives Protein, so dass die Wahrscheinlichkeit, dass mehrere Kopien in einer gegebenen Vesikel niedrig ist und die makroskopische Efflux Zeitkonstante des Vesikels Bevölkerung ist gut mit der von Liposomen ein einzelnes Protein, enthaltend angenähert. Tatsächlich zeigt ein Vergleich der Cl - Auslaufzeit natürlich von Liposomen mit CLC-ec1 rekonstituiert bei niedrigen (schwarz, 0,2 ug / mg) und hohe P / L (grau, 5 &amp; mgr; g / mg) vermittelt (3C) zeigt, dass in der letzteren Fall die Ausfluss Kinetik schneller und f 0 abnimmt, was anzeigt, dass eine kleinere Fraktion der gesamten Liposomen enthält 0 Proteinen. Die Gesamtmenge an Cl - in beiden Proben enthielten Vesikel vergleichbar war, ~ 0,7 und ~ 0,55 umol was anzeigt, dass die gesamten Innenvolumen der Vesikel in den beiden Proben ähnlich war, und dass die Menge des Proteins hergestellt wurden, nicht auf die Größe die Vesikel. Montage des hohen P / L-Auslaufzeit natürlich auf Gleichung 7 erzeugt Werte τ<html> ; (5 &amp; mgr; g / mg) = 8,8 s und f 0 (5 ug / mg) = 0,06, was anzeigt, dass nur ~ 6% der Vesikel enthalten keine aktiven CLC-ec1 Dimere im Gegensatz zu der ~ 31% gefunden, wenn P / L = 0,2 ug / mg. Somit ist die Schätzung der einheitlichen Fluktuationsrate bei hohen P / L ist γ ~ 450 Cl - sec -1, fast 6-fach niedriger als die, die bei niedrigen P / L erhalten und der veröffentlichten Daten 8,14. Daher Analyse der Auslaufzeit Kurse von Liposomen bei hohen P rekonstituierte / L&#39;s die einheitliche Transportrate des rekonstituierten Protein unterschätzen. So, genau zu bestimmen, die einheitliche Transportgeschwindigkeit einer neuen Protein es von entscheidender Bedeutung ist, um genau die Menge an Protein rekonstituiert zu bestimmen und bei niedrigen P / L&#39;s arbeiten, in einer Poisson Verdünnungs Regimes. Dies ist ideal, indem eine vollständige Protein Titrationsanalyse die optimale Regime zu arbeiten, zu identifizieren erreicht. Bestimmung der Masse des aktiven Komplexes Zelt &quot;&gt; Das oben beschriebene Analyse geht davon aus, dass die Stöchiometrie der aktiven Komplex bekannt ist und die rekonstituierte Protein voll aktiv ist. Doch für neue Präparate hätten diese Mengen nicht a priori bekannt sein. In diesem Fall ist es möglich, diese Parameter direkt zu bestimmen, Durch die Messung der f 0 ist an verschiedenen Protein Lipid-Verhältnissen <img alt="Gleichung 13" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq13.jpg" /> wobei p die Proteindichte, <img alt="Gleichung 14" fo:content-width=".65in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq14.jpg" /> Ist ρ die Anzahl von Liposomen pro Masse an Lipid, N A die Avogadro-Konstante, M P ist die Masse des Funktionskanals komplex und φ ist der Anteil an aktiven Proteinen. Durch den Einbau der experimentell bestimmte f 0 ist an verschiedenen Protein: Lipid-Verhältnissen ist es poslich, p 0 zu bestimmen, und damit M P und φ. Eine endliche Fraktion von Liposomen ist refraktär Einbindung Die Ableitung des einheitlichen Transportrate unterstellt, dass bei hohen P / L&#39;s alle Liposomen mindestens einen aktiven Transportprotein enthalten. Jedoch kann in einigen Fällen wurde festgestellt, nicht der Fall zu sein: bei hohen P / L&#39;s ist ein großer Anteil der Liposomen bleibt refraktär Rekonstitution einiger Proteine ​​11-13,17. Während die Ursache dieses Phänomens sind nicht klar ist es denkbar, dass größere Proteine ​​könnten von Vesikeln mit kleineren Radien so die Anzahl der verfügbaren Liposomen Reduktions ausgeschlossen. In diesem Fall wird Gleichung 10 muss modifiziert werden: <img alt="Gleichung 15" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq15.jpg" /> wobei θ der Anteil der Liposomen refraktär Protein Einarbeitung. Wichtig ist, ρ und φ werden auch durch die Rekonstitution Verfahren betroffen, da verschiedene Verfahren werden unterschiedliche Wiederfindungsraten für Lipide und Proteine ​​während der Liposomen Rekonstitution und Bildung haben. Unter der Annahme, 100% Ausbeute für beide würde zu einer Fehlschätzung der γ führen. Deshalb, um eine genaue Quantifizierung der unitären Umsatz / Leitfähigkeit erreichen, ist es wichtig, den Anteil von Lipid und Protein verloren experimentell während der Rekonstitution 8,11. Orientierung der rekonstituierten Proteine Eine der Annahmen bei der Analyse vorgenommen wird, dass alle rekonstituierten Proteine ​​funktionell äquivalent. Allerdings haben viele Kanäle und Transporter Richtungen Transporte, ein Phänomen, das als Gleichrichtung bekannt bevorzugt. Diese funktionelle Asymmetrie könnte zu einem Schätzfehler in der Fluktuationsrate führen. Weiterhin ist die Orientierung der rekonstituierten Proteine ​​a priori </em&gt; zufällig, so dass die gemessene einheitlichen Fluktuationsrate ist der gewichtete Durchschnitt der Steuersätze des Proteins beim Betrieb vorne oder nach hinten. Mehrere Verfahren können verwendet werden, um die Ausrichtung der rekonstituierten Proteine ​​zu bestimmen, beispielsweise durch Messung der Bruchteil eines Etiketts, das von dem spaltbaren extraliposomalen Lösung oder durch Messung der Einseitigkeit der Reaktivität eines einzigen Cysteinrest in löslicher zugänglichen Bereich eingebracht . Schließlich ist es möglich, dieses Problem durch funktions Silencing eines der zwei Populationen mit seitigen Inhibitoren oder durch selektives Aktivieren nur Proteine ​​in einer Orientierung über die Zugabe von aktivierenden Verbindung, nur die Seite oder durch Einstellung der Transmembranspannung an günstigen Werte mit K + Umgehung Farbverläufe, für Kanäle oder Transporter, der Ligand oder spannungsabhängig sind. Überlegungen zur Bildung von dichten Liposomen Einer der wichtigsten Faktoren, die den Einsatz of den hier beschriebenen Efflux Assay ist die Bildung von eng Liposomen. Drei wichtigen Variablen, die zu diesem Zweck in Betracht gezogen werden, sind die Wahl des Detergens verwendet werden, um das Protein, das Detergens-Entfernungsstrategie und die Auswahl der Lipidzusammensetzung der Liposome solubilisieren. In der hier vorgestellten Protokoll wird CLC-ec1 in Decyl-maltopyranosid (DM), einem Reinigungsmittel mit einem hohen kritischen Micellenkonzentration (CMC) Wert, der leicht entfernt wird gelöst. Jedoch kann eine Vielzahl von synthetischen und natürlich vorkommenden Waschmitteln verwendet worden, um Proteine, die nachfolgend in engen Liposomen ohne Auswirkungen auf die Dichtheit der Vesikel rekonstituiert wurden reinigen. Diese Reinigungsmittel haben eine breite Palette von CMCs, so hoch wie millimolaren (wie DM oder Digitonin) und so günstig wie mikromolaren (wie Dodecyl- maltopyranosid (DDM) oder dioctylpropane-bis-maltopyranosid (DMNG)). Es ist wichtig, jedoch beachten, dass die Lipide, die zur Bildung der Liposomen werden mit CHAPS solubilisiert, oder anderen milden ReinigungsUnd damit die Hybrid Mizellen aus dem Gemisch aus Protein und Lipiden erhaltene haben könnten chemisch-physikalischen Eigenschaften verschieden von denen der Stamm Waschmitteln. Es ist daher möglich, dass in einigen Fällen die Rest Detergensentfemung dass die Liposomen führt zu ausgeprägter Lecks destabilisieren. Um dieses Problem zu umgehen, ist es ratsam, alternative Detergensentfemung Strategien wie Biobeads 12,13, Spin-Säulen 15 oder Gelfiltration untersuchen 18. Schließlich wird die Lipidzusammensetzung der Vesikel ist ein wichtiger Parameter, wie bestimmte Mischungen könnten undicht verschiedenen Ionen in bestimmten Bedingungen. Beispielsweise Liposomen aus E. gebildet coli polaren Lipidextrakt sind dicht an Cl - bei sauren pH-Werten, werden aber zunehmend leaky steigendem pH-Wert 19 oder Liposomen, die aus einer 3: 1-Gemisch von 1-Palmitoyl-2-oleoyl Phosphatidylethanolamin (POPE) und 1-Palmitoyl- 2-Oleoyl Phosphatidylglycerin (POPG) Zeigen eine viel geringere Permeabilität für H +, als jene aus E. gebildet coli polares Lipid extrahieren 20. Es ist wichtig zu beachten, dass jedoch die Lipidzusammensetzung der Vesikel kann auch die Aktivität des rekonstituierten Protein 13,21,22 beeinflussen. Somit ist es wichtig, genau die Eigenschaften der proteinfreien Vesikel in jeder Bedingung hergestellt bestimmen und dann zu prüfen, wie sich dies auf die Eigenschaften des rekonstituierten Protein. Verallgemeinerung auf nicht CLC-Typ-Kanäle und Transporter Die Auslaufassay, wie hier beschrieben, können direkt verwendet werden, um die molekularen Eigenschaften jeder Cl bestimmen - -selektiven Kanal oder Transporter, und beispielsweise verwendet worden, um die Eigenschaften des Ca 2+ -aktivierten Cl charakterisieren - Kanal TMEM16A 12 . Wir besprechen nun, wie man die Auslauf Test anzupassen, um die Eigenschaften von Transportern oder chann untersuchenels, die keine Cl - selektive und / oder einheitliche Transportraten, die deutlich von der ~ 10 3 sec -1 Ionen von CLC-ec1 sind. Der einfachste Fall ist, dass die untersuchte Protein ist anionenselektiven. In diesem Fall ist die einzige notwendige Einstellung ist, die Ag ersetzt werden: AgCl-Elektrode mit einem im Handel erhältlichen ein geeigneter Selektivität, wie sie für die F getan - -selektiven Flucs und CLCs 16,23,24 oder I - permeable Kanäle wie CFTR 15 . Wenn auf der anderen Seite ist die rekonstituierte Protein selektiv für Kationen, hat ein von Valinomycin Ionophor zu verwenden, um Ausfluß initiieren. Angesichts der Knappheit der validierten Cl - Ionophore ein nützlicher Ersatz ist ein H + Ionophors wie Carbonylcyanid 4- (Trifluormethoxy) Phenylhydrazon (FCCP). In diesem Fall ist es wichtig, durch Erhöhung der Puffer dass intravesikulären pH konstant gehalten wird, beispielsweiseing Kapazität des internen Lösung. Eine alternative Strategie ist die Kationen Efflux durch eine rekonstituierte Kanal oder Transporter indem Protonen als Gegenion und Überwachungs H + -Transport mit einem pH-Messgerät 25 oder ein ratiometrisches pH-empfindliche Sonde 26 zu folgen. Der indirekte Art dieser Messungen macht jedoch die Quantifizierung der Transporteigenschaften der rekonstituierten Protein schwierig. Schließlich selektiven Elektroden für eine Reihe von Kationen vorhanden sind und sind kommerziell erhältlich. Ein drittes Szenario ist, dass das untersuchte Protein durchlässig ist sowohl Anionen als auch Kationen, beispielsweise ein wenig selektiven Kanal 13 oder ein Kation / Cl - Cotransporter. In diesem Fall müssen die rekonstituierten Liposomen kein KCl Gradienten während der Lösungsaustauschprozesses beibehalten (Schritte 5,4-5,5), so dass sie deren Salzgehalt zu verlieren. Also in diesem Fall alle kinetische Information verloren. Jedoch beträgt der Anteil von Liposomen, die mindestens ein aktives protInhalt (Schritt 6.8) - ein, f 0, kann immer noch durch Zugabe von Reinigungsmittel und die Messung der Rest gefangen Cl bestimmt werden. Dies ermöglicht die Bestimmung der Molekularmasse des Proteins, das durch die Durchführung einer Protein-Titration unter Verwendung von Gleichung 10. Ein weiterer Aspekt ist die Möglichkeit, dass einheitliche Transportrate des rekonstituierten Protein ist um Größenordnungen verschieden von der CLC-ec1. Zum Beispiel, die meisten Transporteure haben Fluktuationsraten von 1-10 sec -1, 2-3 Größenordnungen niedriger als CLC-ec1, während die meisten Kanäle Verhalten Ionen bei 10 6 bis 10 7 s -1, 3-4000 fach schneller als CLC -ec1. Für langsame Transport die Rate der Cl - Leckage aus proteinfreien Liposomen zu begrenzen, da seine relative Gewicht in den Auslaufprozess erhöht sich Transportgeschwindigkeit abnimmt des Proteins. Nach unserer Erfahrung variiert die Leckrate etwas zwischen Zubereitungen und ist normalerweise in der Größenordnung vonwenige Ionen sec -1. Daher wird, wenn die Arbeit mit langsam Transport ist es ratsam, proteinfreien Liposomen nebeneinander auf jede Rekonstitution herzustellen, um das Leck entspricht jede Charge von Vesikeln genau zu messen. Die Auslauf Assay wurde erfolgreich verwendet, um die einheitliche Geschwindigkeit des langsamen Transporter mit Umsatzraten von etwa 1-10 Ionen sec -1, wie einem cyanobakteriellen CLC 27 bestimmen. Die umgekehrte Situation tritt auf, wenn die rekonstituierte Protein hat eine hohe Leitfähigkeit, zum Beispiel ein Ionenkanal. In diesem Fall sind die Ausfluss Kinetik zu schnell sind, als die Mischzeit (~ 1-2 sec) und die intrinsische Reaktionszeit von der Aufzeichnungselektrode werden geschwindigkeitsbegrenzende gelöst werden. In diesem Fall wird die kinetische Information verloren, aber die Masse des aktiven Komplexes noch bestimmt werden 24. Es ist erwähnenswert, dass andere Ansätze, wie planare Lipiddoppelaufzeichnungen oder Patch-Clamp-Liposomen sind besser geeignet, um gereinigtes Ionenkanälen, da diese te studierenchniques direkt liefern Einzelmolekül Informationen mit hoher Zeitauflösung.

In den letzten zwei Jahrzehnten die Fähigkeit, Überexpression und Reinigung von Membrantransportproteine ​​hat sich dramatisch erhöht: Ionenkanäle, primäre und sekundäre Transporter werden nun routinemäßig von heterologen Expressionssystemen sowie natürlichen Quellen gereinigt. Neue Wege in der Ausdrucks überwachen, zu verbessern und die Extraktion und erhöhen die Stabilität dieser Proteine ​​werden ständig weiterentwickelt 1-5. Diese technologischen Durchbrüche haben dazu beigetragen, das Auslösen der Explosion der Atomebene Informationen über die Struktur von Membranproteinen, die wiederum verbessert das Verständnis der strukturellen Grundlagen ihrer Funktion. Im Gegensatz dazu können wir auch die funktionellen Eigenschaften der gereinigten Proteine ​​Sonde nicht mit der gleichen Geschwindigkeit zu erhöhen, so dass in einigen Fällen hochauflösende Strukturinformation durch qualitative Funktionsdaten begleitet, wodurch die Fähigkeit zur quantitativen Test strukturbasierte Prognosen einschränkend. Daher ist die development quantitativer und verallgemeinerbare funktionellen Tests ist ein wichtiger Schritt zur Aufklärung der mechanistischen Grundlagen von Membranproteinfunktion. Hier beschreiben wir eine Auslauf Assay, der verwendet werden kann, wichtige Funktionseigenschaften gereinigt und wiederhergestellt Cl quantitativ zu bestimmen - Kanäle und Transporter. Die Prinzipien des Assays Basiswert kann auf eine Vielzahl von Transportsystemen, sowie auf nichtIonenTransportProteine ​​verallgemeinern. Kanal / Transporter in Gegenwart eines großen Cl - - ​​Liposomen werden mit gereinigtem Cl rekonstituiert Gradienten (1A, B). Cl - Ausfluß wird durch die Zugabe eines Ionophors initiiert, um für Gegenionenfluss zu ermöglichen, in unserem Fall der K + Ionophor Valinomycin, der die Spannung von der etablierten Cl Shunt - Gradienten und den ursprünglichen Membranpotential auf das Gleichgewichtspotential von K + 6,7. Ohne ter Ionophor keine signifikante Netto Cl - Efflux auftritt, wie es durch die Erzeugung eines Transmembranpotentials verhindert. - Efflux und f 0, die Fraktion von Liposomen keine aktive Protein enthaltenden τ die Zeitkonstante von Cl: Die Daten werden quantitativ durch zwei messbare Parameter (Abbildung 1C) beschrieben. Von τ und f 0 die unitäre Cl - Transportgeschwindigkeit kann der Anteil von aktiven Proteinen und die Molekularmasse des aktiven Komplexes 8 abgeleitet werden. Tauscher bekannter Struktur und Funktion - Die Technik wird hier mit Proteo mit CLC-ec1, einem gut charakterisierten CLC-Typ H + / Cl wiederhergestellt dargestellt. Dieser Assay wird leicht um Kanäle oder Transporteure mit unterschiedlicher Ionenselektivität, oder deren Aktivität von der Anwesenheit von Spannung und / oder Liganden verallgemeinert. Darüber hinaus kann dieser Assay verwendet werden, um zu bestimmen, ob kleine Moleküle unmittelbar auf die rekonstituierte Protein,um die Wirkungen dieser Verbindungen und wie die Zusammensetzung der Membran oder Lipidmodifizierungsreagenzien auf die Funktion der rekonstituierten Kanäle und Transporter zu quantifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="995">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:337px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:337px;">&#160;Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>610200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IEC Centra CL2 Benchtop</td>
			<td style="width:337px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>These can be found on Ebay.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Non-functional pH probe</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160; DI-710 Data Logger</td>
			<td style="width:337px;">DATAQ instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WinDAQ acquisition software</td>
			<td style="width:337px;">DATAQ instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml</td>
			<td style="width:337px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td>29922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:337px;">Kimble Chase</td>
			<td>73500-13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extruder Set With Holder/Heating Block</td>
			<td style="width:337px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proteoliposome-based efflux assay to determine single-molecule properties of cl- channels and transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

Wir beschreiben eine detaillierte und robuste Protokoll zu messen Cl - Transport von gereinigtem CLC-ec1, einem prokaryontischen CLC-Typ H + / Cl vermittelt - Tauscher, in Liposomen rekonstituiert. Eine schematische Darstellung des Experiments ist in Abbildung 3 dargestellt Proteoliposomen mit gereinigtem CLC-EC1 und mit hohen internen Cl rekonstituiert. - In einer Badlösung, die geringe Cl taucht -. Unter diesen Bedingungen net Cl - Ausfluß wird durch den Aufbau der positiven Ladung im Liposom (3A) verhindert. Die Zugabe von Valinomycin erlaubt K + durch die Membran so Rangieren das elektrische Potential und die Einleitung Cl bewegen - Efflux (3B). Das Flusszeitverlauf wird mit einem Cl überwacht - -selektiven Elektrode und der Gesamtbetrag der Cl - in den Vesikeln enthalten ist direkt durch das Lösen Sie diese mit Reinigungsmittel gemessen. Aus diesenLösungsexperimenten ist es möglich, Eigenschaften der Einzel rekonstituierten Proteine ​​wie Umsatzrate Stöchiometrie des aktiven Komplexes und Fraktion des aktiven Proteins zu bestimmen. Unter Verwendung der Gleichungen 7-9 die Auslaufzeit natürlich anzubringen und zu schätzen die einheitliche Transportgeschwindigkeit von CLC-ec1 finden wir, dass τ (0,2 ug / mg) = 41 s und f 0 (0,2 ug / mg) = 0,31, was darauf hinweist, dass ~ 1 / 3 der Liposomen enthält 0 aktive Proteine. Aus diesen Werten berechnen wir, dass die einheitliche Transportrate γ ~ 2500 Cl - sec -1, in guter Übereinstimmung mit veröffentlichten Werten 8,14. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52369/52369fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die Cl - Efflux-Assay (A - B) Schematische Darstellung des Cl - -efflux Assay für proteinfreie Liposomen (A) oder CLC-ec1.rekonstituiert Vesikel (B). (C) Simulierte Zeitverlauf der Ionophor initiierte Cl - Ausstrom von Proteo (schwarz) oder proteinfreien Liposomen (grau gestrichelte Linie). Efflux wird durch Zugabe von Ionophor (*) initiiert und durch die Zugabe von Waschmittel beendet wird, um Liposomen zu lösen (^). Red gestrichelte Linie ist eine exponentielle Anpassung zu bestimmen, wird die Zeitkonstante, τ, der Cl -. Efflux von Liposomen, die mindestens 1 aktive Kopie der CLC-ec1 und f 0 ist der Anteil der Liposomen, die 0 aktive Proteine <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52369/52369fig1large.jpg" target="_blank">​​Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Abbildung.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52369/52369fig2.jpg" /> Abbildung 2: Aufzeichnung einzurichten (A) Die Aufnahme einrichten.. (B), Close-up der Kammern. &lt;a href = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52369/52369fig3.jpg" /> Abbildung 3: Beispiel-Trace und Analyse (A) Typische V (t) Spuren von Ausfluss Experimente von Proteo mit WT CLC-ec1 Rekonstitution mit 0,2 g / mg P / L.. Die Pfeile zeigen die Zeitpunkte der Zugabe der KCl Kalibrierungspuls, Liposomen, Valinomycin und β-OG. Gestrichelte Linien zeigen die &amp; Dgr; V-Werte in verschiedenen Stadien. (B) Die V (t) Spur wird unter Verwendung von Gleichung 5, normalisiert mit Gleichung 6 und die Auslaufzeit ist natürlich fit zu Gleichung 7 (rot gestrichelte Linie) in Cl (t) umgewandelt. (C) normalisierte Auslaufzeit Kurse von Proteo mit WT CLC-ec1 Rekonstitution mit 0,2 g / mg P / L (schwarz) oder bei 5 ug / mg P / L (grau). Gestrichelte Linies sind am besten passt der Auslaufzeit Kurse auf Gleichung 7.

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A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Ein Proteoliposom Basierte Efflux-Assay auf Einzelmoleküleigenschaften von Cl Bestimmen<sup&gt; -</sup&gt; Kanäle und Transporter

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

9.7K Aufrufe.  Weill Cornell Medical College. Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Serie: A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Single Molecule Methoden zur Überwachung von Veränderungen in Bilayer Elastic Properties

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Forschung

Biologie

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Ein fluoreszierendes Screening Assay zur Identifizierung von Modulatoren der GIRK Kanäle

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Studieren von DNA-Looping von Einzelmolekül-FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...