פרוטוקול זה יכול לסייע בהבנת המנגנונים המעורבים בוויסות KCC2 על ידי הערכה ישירה של הזרחון המולקולרי של קינאז, ובכך לשפוך אור על תפקודיו ופעילויותיו הפיזיולוגיות. ניתן להשתמש בו כדי לזהות ולאפיין מולקולות כמו חלבונים בעלי עניין מתערובות מורכבות של מולקולות קשורות גם כאשר ביטוי חלבון הוא דק מאוד. הטכניקה היא כלי חיוני לניתוח חלבונים של מערכות מורכבות ולזיהוי מנגנונים פוטנציאליים העומדים בבסיס תפקוד או מחלה של רקמות חריגות.
מי שידגים את הנהלים יהיה ביום ראשון שלמה יאשיהו, דוקטורנט מהמעבדה שלי. התחילו בחימוש מראש של כל הריאגנטים באמבט החרוזים של 37 מעלות צלזיוס והפשרת הכליה העוברית האנושית KCC2b של החולדה היציבה KCC2b 293 תאים לחלוטין באמבט החרוזים. לאחר מכן מעבירים את התאים מצינור בקבוקון הקריו לצינור צנטריפוגה המכיל חמישה מיליליטר של מדיה טרייה וצנטריפוגה של התאים ב-1, 200 גרם למשך שלוש עד חמש דקות.
לאחר שאיפת הסופרנטנט באמצעות פיפטה של השואב המקובעת למשאבת ואקום, יש להשעות את התאים ב-10 מיליליטר של מדיה טרייה. מעבירים את המתלים לצלחת בגודל 10 ס"מ ומאפשרים לה לגדול במשך 48 שעות באינקובטור בעל טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. ברגע שהתאים מגיעים ל-90% מפגש, פיצלו אותם על ידי שאיפת המדיה הישנה ושטיפתם בשני מיליליטרים של PBS.
מוסיפים שני מיליליטר של טריפסין ודוגרים אותם במשך כדקה עד שתיים בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים טריפסיני באמצעות שני מיליליטר של התקשורת המלאה. הוסיפו תשעה מיליליטר של מדיה טרייה למנות החדשות.
לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של תמיסה מהמנה הישנה למנה החדשה. העבירו את הכלים המפוצלים לחממה למשך 48 שעות כדי להגיע ליותר מ-90% מפגש. טפלו בתאים עם דימתיל סולפוקסיד, שמונה מיקרומולר סטאורוספורין, או 0.5 מילימולאר N-אתיל-מאלימיד במשך 15 דקות לפני הקטיף במאגר התזה.
שאפו את התקשורת מצלחת התרבית הטרנסקטיבית, הניחו את כלי התרבית על קרח, ושטפו את התאים ב-PBS קר כקרח. שאפו את ה- PBS והוסיפו 1.0 מיליליטר של חיץ ליזיס קר כקרח לתבשיל. לאחר גירוד התאים מתחתית המנה באמצעות מגרד תאי פלסטיק קר, העבירו את תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה המונח על קרח, ולאחר מכן תסיסה מתמדת במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר צנטריפוגה התא ליזט בצנטריפוגה קרה, מניחים אותו על קרח. אסוף את הסופרנטנט לתוך צינור טרי מקורר מראש, והשלך את הכדור. פיפטה 300 מיקרוליטר של חלבון G Sepharose לתוך צינור microcentrifuge.
לאחר מכן צנטריפוגה את הפתרון ב 500 G במשך שתי דקות. לאחר השלכת supernatant, להוסיף 500 microliters של PBS מערבולת היטב. השליכו את הסופר-נטנט לאחר הצנטריפוגה וחזרו על השלב.
לאחר מכן, יש לערבב מיליגרם אחד של נוגדנים נגד KCC2 threonine 906 ונוגדנים נגד KCC2 threonine 1007 עם 200 מיקרוליטרים של חלבון G חרוזי Sepharose לפני שהם מרכיבים את הנפח ל-500 מיקרוליטר עם PBS. לאחר טלטול על פלטפורמה רוטטת או גלגל מסתובב במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס, חזור על שתי שטיפות עם PBS. בצע כימות חלבונים על התא ליזאט והוסף מיליגרם אחד של התא ליזאט לחרוזים השטופים ודגירה בסיבוב מקצה לקצה לפני הסיבוב.
תן שלוש שטיפות עם PBS המכיל 150 מילימולאר נתרן כלורי, ולאחר מכן שלוש שטיפות עם 200 מיקרוליטר של PBS לפני החייאת הכדור הסופי ב 100 מיקרוליטר של חיץ דגימת LDS. נערו את הצינורות בשייקר רוטור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לדגור אותם בבלוק חימום וצנטריפוגה אותם לפני השימוש supernatant עבור העמסת ג'ל.
הרכיבו את מנגנון יציקת הכתם המערבי ומזגו ג'ל הפרדה טרי של 8% כדי ליצוק את הג'ל, מה שמאפשר כשני סנטימטרים של מקום מראש זכוכית היציקה. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של איזופרופנול מוחלט להתקנה ואפשרו לו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות. הסר את isopropanol באמצעות פיפטה בזהירות לשטוף את הג'ל עם כ 200 microliters של מים מזוקקים.
לאחר הוספת ג'ל ערימה טרי של 6% למערך היציקה, יש להכניס בעדינות למסרק הבאר ולאפשר לו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. ואז לתקן את ג'ל יצוק לתוך מיכל אלקטרופורזה. לאחר שפיכת חיץ הריצה לתוך המיכל, טען חמישה מיקרוליטרים של סמן משקל מולקולרי לתוך הבאר הראשונה כמות שווה של חלבון לתוך כל באר של ג'ל SDS-PAGE.
מלאו את הבארות הריקות ב-LDS והפעילו את הג'ל במשך כ-90 עד 120 דקות ב-120 וולט. ייבשו מחדש את קרום הניטרוצלולוז עם חיץ העברה המכיל 20% מתנול. שטפו את הג'ל והממברנה עם חיץ ההעברה ופזרו אותם בעדינות על ערימת ההכנה.
סדרו את הכריך להעברה בסדר זה: אלקטרודה שלילית, קצף סנדוויץ', ג'ל SDS-PAGE שטוף נייר סינון, קרום ניטרוצלולוז שטוף, נייר סינון, קצף סנדוויץ', אלקטרודה חיובית. לאחר שתסיים, ערמו את הכריך המורכב במיכל ההעברה ופעלו ב 90 וולט במשך 90 דקות או 30 וולט במשך 360 דקות. יש לחסום את הממברנה היבשה למשך שעה בטמפרטורת החדר באמצעות חיץ חוסם.
לדגום את הממברנות עם דילולים מתאימים של נוגדן ראשוני ובטא-אקטין בחסימת חיץ למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. ואז לתת שלוש שטיפות של TBST במשך חמש דקות כל אחד. לדגום את הקרום השטוף עם נוגדן משני מדולל במאגר חוסם במשך 60 דקות ולחזור על שלוש שטיפות של TBST.
לאחר שתסיים, הנח את הקרום השטוף על לוח ההדמיה. כדי לפתח את האותות, פזרו את התמיסה שהוכנה על ידי ערבוב נפחים שווים של כל מגיב כימילומינסנציה משופר על הממברנה לפני העברת לוח ההדמיה למערכת ההדמיה להדמיה. הטיפול בתאי HEK293 עם סטאורוספורין ו-N-אתיל-מאלימיד או NEM גרם לירידה בזרחון באתרי המטרה של SPAK, תראונין 233 הממוקם בתחום T-loop kinase, ובאתר הזרחון S-loop serine 373 של SPAK המבוטא באופן אנדוגני.
Staurosporine הפחית את הזרחון של סרין 940 בתאי HEK294 המבטאים ביציבות KCC2b, אך NEM הגדיל באופן משמעותי את הזרחון שלו. יתר על כן, staurosporine מפחית זרחון באתר threonine 505, בעוד NEM גרם לעלייה קלה אך לא משמעותית בזרחון באותו אתר. ההשפעות הדיפרנציאליות של שתי התרכובות על זרחון של חלבון קינאז C באתר תראונין 505 ו- KCC2b באתר סרין 940 מתואמות היטב.
התוצאה המייצגת הראתה גם כי NEM גרם לעלייה משמעותית בביטוי של כמות KCC2 הכוללת, בעוד שהביטוי של סך NKCC1 ו- SPAK לא השתנה באופן משמעותי כאשר טופלו בשתי התרכובות. יתר על כן, שתי התרכובות גרמו לירידה בזרחון של SPAK באתרי תראונין 233 וסרין 373, וזה היה בקורלציה עם הזרחון המקוצר של תראונין 906/1007 ותראונין 203/207/212 והתבטא באופן אנדוגני NKCC1 בהתאמה. בנוסף, staurosporine ו- NEM הפחיתו והגדילו את הזרחון של חלבון קינאז C באתר סרין 940 וביטאו ביציבות KCC2b בהתאמה, אשר תאם עם הפחתה ותוספת בזרחון של חלבון קינאז C דלתא באתר threonine 505 עם טיפול staurosporine ו NEM בהתאמה.
אם נעשה שימוש בנוגדן ראשוני או משני לא תקין, הרצועה לא תיראה במהלך ההדמיה. כמו כן, ייתכן שהאות לא יהיה גלוי אם נעשה שימוש בריכוז נמוך מדי של נוגדן. הטכניקה היא כלי רלוונטי בניתוח כמותי של חלבון ואפשרה את השימוש בו למטרות מדעיות ומשאבים רבים, כולל ככלי יעיל לאבחון מוקדם.
