Wir danken allen Mitgliedern des AI-Labors für ihre hilfreichen Kommentare und Anregungen. Wir danken Prof. Mark Hipp (Max-Planck-Institut für Biochemie) für die Bereitstellung des Shuttle-GFP-Vektors. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien der israelischen Wissenschaftsstiftung (ISF # 124/14), der Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Karriere Integration Grant (CIG # 333794) und dem Nationalen Institut für Psychobiologie in Israel ( NIPI # b133-14 / 15).

1. Zelllinienvorbereitung <ol><li> Tauen Sie etwa 1.000.000 Maus-Neuroblastom-Rückenmarkszellen (NSC-34-Zellen), die in einem flüssigen Stickstoffbehälter aufbewahrt wurden. Verwenden Sie einen 37 ° C Wasserinkubator, bis die Zellen vollständig aufgetaut sind. </li><li> Füge frisches, warmes Medium hinzu (DMEM-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin und 1% Pen-Strep-Antibiotika). </li><li> Zentrifugen aufgetaute Zellen (SL16R) bei 500 xg für 5 min zentrifugieren und ein Zellpellet bilden. Verwerfe das Medium und füge 1 ml neues Medium für die Zellresuspension hinzu. </li><li> Legen Sie die resuspendierten Zellen in einen 15-ml-Kolben und fügen Sie zusätzliche 5 ml Medium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem sterilen Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C. </li><li> Parallel dazu Platz 8 unbeschichtete Deckgläser (Deckglas: 12 mm, 0,13-0,17 mm dick) in einer 60-mm-Kulturschale und sterilisieren mit 70% Ethanol und ca. 30 min UV-Licht bis zum Trocknen. Fügen Sie Medium zu jeder Schale hinzu und entsorgen Sie, um das restliche Ethanol zu waschen.</li><li> Fügen Sie Trypsin-Puffer (2,5 g Trypsin und 0,2 g EDTA in 1 l Hanks &#39;Balanced Salt Solution) zu den Zellen hinzu, nachdem sie etwa 90% Konfluenz erreicht haben (etwa 6 Millionen Zellen pro Kolben), um adhärenten Zellen zu dissoziieren. HINWEIS: NSC-34-Zellen sind empfindlich und benötigen nur 15 s Trypsin-Puffer-Inkubation und 1 zusätzliche Min-Inkubation frei von Trypsin vor der Dissoziation mit dem Medium. </li><li> Die Zellen auf die 60 mm Kulturschalen legen, die bereits die Deckgläser mit 3 ml Medium enthalten, ca. 350.000 pro Schale. Lassen Sie sie in den Inkubator für 24 h, um die Zellbefestigung auf die Deckgläser zu ermöglichen. </li></ol> 2. Zelltransfektion ANMERKUNG: Nach ca. 24 h erreichen die NSC-34-Zellen 40% Konfluenz (ca. 800.000 Zellen) und sind zur Transfektion bereit. <ol><li> Bereiten Sie reines DMEM-Medium (300 &amp; mgr; l DMEM-Medium für jede 60 mm Kulturschale) in einer sterilen Mikrozentrifugenwanne vorEs </li><li> Addieren Sie 2 μg jedes Plasmids, das für die Transfektion benötigt wird, zu jedem DMEM-haltigen Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Das Shuttle-GFP-Plasmid ist bei allen Zelltransfektionen obligatorisch. </li><li> Fügen Sie Transfektionsreagenz zu allen Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, die ihre erforderlichen Plasmide enthalten. Hierbei werden 4 μl des handelsüblichen Transfektionsreagens für jeweils 2 μg DNA zugegeben. </li><li> Vortex die Mikrozentrifugenröhrchen, die DMEM, Plasmide und das Transfektionsreagenz enthalten und diese bei Raumtemperatur für 25 min inkubieren. </li><li> Fügen Sie jedes Mikrozentrifugenröhrchen zu einer Kulturschale hinzu und rühren Sie die Schale vorsichtig zu einer homogenen Lösung. Legen Sie das Gericht für 48 Stunden in den Inkubator. ANMERKUNG: Da Shuttle-GFP in allen Zellen exprimiert werden sollte, kann die Shuttle-GFP-Transfektionseffizienz partiell untersucht und mit einer Fluoreszenzmikroskopie nach der Transfektion über Nacht getestet werden. Eine vollständige Untersuchung von nicht-fluoreszierenden exprimierten Proteinen kann unter Verwendung eines Immunoblot-Analysen durchgeführt werdenIst. </li></ol> 3. Mikroskopie <ol><li> Befestigen Sie die Deckblätter, die transfizierte NSC-34-Zellen enthalten, an einen Deckglashalter und waschen Sie vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um die abgetrennten toten Zellen zu entfernen. </li><li> Identifizieren Sie einen geeigneten Zellflecken mit einem grünen Fluoreszenzfilter mit einem invertierten Mikroskop. HINWEIS: Ein geeigneter Zellfleck ist definiert als ein Mikroskop-Sichtfeld, das eine große Anzahl von Zellen (20-30 Zellen in einem Feld) zeigt und in der die Kerne in den Zellen klar definiert sind. Zellkerne innerhalb des Zellflecks werden zuerst mit dem Auge identifiziert und manuell durch die Imaging-Software markiert. </li><li> Füge 200 μl eines Exportin-1-Inhibitors Leptomycin B (LMB) -Puffer mit 10 ng / mL LMB in PBS zu den Deckgläsern hinzu, indem man den Puffer auf die Deckgläser unter dem Mikroskop tropft. HINWEIS: Dieser Zeitpunkt wird als Intervall Null gesetzt. </li><li> Quantifizierung der Fluoreszenzintensität der markierten Kerne in 3 s Intervallen für ca. 400-500 s. </li><li&gt; Test zwischen 3 und 5 Deckblättern für jede Transfektionsgruppe in jedem einzelnen Experiment. </li></ol> 4. Analyse HINWEIS: Da verschiedene Zellen unterschiedliche Ebenen von fluoreszierendem Shuttle-GFP exprimieren, ist es wichtig, die nukleare Fluoreszenzintensität jeder Zelle auf ihre eigene initiale Fluoreszenzintensität zu normalisieren. <ol><li> Normalisieren Sie die Fluoreszenzintensität der markierten Kerne, indem Sie das 3-s-Fluoreszenzintervall jedes Kerns mit dem Durchschnitt der anfänglichen sechs Intervalle dieses Kerns teilen. </li><li> Nach der Normalisierung jedes Kerns ergibt sich eine Fluoreszenzintensitätskurve, die die Veränderung der Kernfluoreszenz als Funktion der Zeit für jeden Zellflecken darstellt. Um dies zu erreichen, berechnen Sie den Durchschnitt aller Zellen in jedem Zell-Patch (bestehend aus etwa 20-30 Zellen in jedem Patch). HINWEIS: Die Nuklei-Fluoreszenz-Intensitätskurve ähnelt einer Michaelis-Menten-Sättigungskurve, die bei erhöhten Ti besser beobachtet wirdIch Perioden. Dies ist auf eine Verringerung der zytosolischen Mengen an Shuttle-GFP mit der Zeit aufgrund des Atomtransports zurückzuführen. Diese Abnahme verringert statistisch die Wahrscheinlichkeit eines Shuttle-GFP, um in den Zellkern zu transportieren, wodurch die Sättigung in der Kernfluoreszenz erreicht wird. Die von der linearen Anfangsrate der Kurve abgeleitete Steigung ergibt die V max Eintrittsrate in den Kern. </li><li> Analysieren Sie die V max- Pisten jedes Zell-Patches, die von drei bis fünf unabhängigen Experimenten abgeleitet wurden, wobei die Grafik-Software verwendet wird, um eine Steilheit zu erzeugen, die jede experimentelle Gruppe repräsentiert. Führen Sie die Quantifizierung mit einer einseitigen ANOVA statistischen Analyse durch. </li></ol> 5. Protein Expression Validierung <ol><li> Legen Sie 60 mm Kulturschalen mit den restlichen Zellen (nicht in der oben genannten Experiment) aus jeder experimentellen Gruppe auf Eis. </li><li> Das Medium entsorgen und die Zellen zweimal mit PBS waschen, um das verbleibende Medium zu verdünnen und zu waschen. </li><li> Behandle die Zellen mit 200-400ΜL Lysepuffer, enthaltend PBS, 0,5% Triton und Protease-Inhibitor-Cocktail-Tablette (PI). Kratzen mit einem Zellschaber. </li><li> Sammeln Sie die Zellen in Lysepuffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen und homogenisieren Sie mit einem Homogenisator bei 4.000 U / min für 1 min unter Eis. </li><li> Zentrifugieren der homogenisierten Zellen bei 2500 xg für 10 min. Sammeln Sie den Überstand, quantifizieren Sie die Proteinkonzentration unter Verwendung eines Bradford-Assays und lagern bis zur Verwendung bei -20 ° C. </li><li> Sammle zwischen 30 und 70 μg Gesamtprotein (abhängig vom Protein) und lade es in ein SDS-PAGE-Gel, um die Proteinexpression unter Verwendung eines Immunoblot-Assays zu testen. </li></ol>

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</ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll zeigt einen hochempfindlichen und quantitativen neuen Assay, um winzige Veränderungen im nucleozytoplasmatischen Transport zu bewerten. Mit diesem System ist es möglich, den nucleozytoplasmatischen Transport und seine Dysfunktion in Echtzeit zu beobachten und zu messen, nicht nur große Defekte, die zu dramatischen Veränderungen der Proteinverteilung führen. Dieser Assay hat nicht nur einen Sensitivitätsvorteil, sondern erfordert auch wenig Vorbereitung, ist preiswert und ist ein sehr einfacher und engagierter Assay. Um die Effizienz dieses Systems zu testen, wurden C9orf72-Proteine, Poly (GR) und Poly (PR) -DPRs, Modelle von ALS und FTD, die zuvor gezeigt wurden, dass sie einen nukleocytoplasmatischen Transportmangel verursachen, 5 , 7 , 8 , 10 , 12 verwendet. Mit diesem Assay war es möglich, in Echtzeit eine Abnahme von etwa 50% in derNukleare Importrate in Zellen, die die DPRs exprimieren, im Vergleich zu Zellen, die mit einem Kontrollvektor transfiziert wurden. Daher eröffnet dieses System die Möglichkeit, kleine Veränderungen des nukleozytoplasmatischen Transports, die durch diese und andere ALS- oder FTD-Mutanten oder andere Krankheiten verursacht werden können, in denen potentielle Defekte im nucleozytoplasmatischen Transport auftreten können, leicht zu messen. Obwohl sich das hier beschriebene Protokoll mit motorischen neuronähnlichen Zellen beschäftigt, könnte es leicht an andere Zelltypen angepasst werden. Am wichtigsten ist, mit diesem System ist es nun möglich zu bestimmen, wie unterschiedliche molekulare Faktoren oder Medikamente dazu beitragen können, zu verhindern oder zu retten (sogar teilweise) nukleozytoplasmatische Transportmängel bei ALS, FTD oder anderen Störungen. Eine mögliche Einschränkung bei der Verwendung dieses Assays ist die begrenzte Fähigkeit, die Zellkerne in Zellen zu beobachten und zu markieren, die keinen klaren Kern besitzen oder eine sehr kleine besitzen. Um dies zu überwinden, kann eine mögliche Lösung sein, einfach ein größeres Magnific zu verwenden<html> Ation Dies wird jedoch letztlich die Menge an Zellen in jedem Zellflecken verringern, wodurch die Menge an Experimenten erhöht wird, die benötigt werden, um einen signifikanten Wert zu erreichen. Eine weitere Betrachtung bezieht sich auf das Shuttle-GFP-Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis vor der Zugabe von LMB. Dieses Verhältnis kann in verschiedenen Zelltypen sehr unterschiedlich sein und kann folglich zu klein sein (nahe einem 1: 1-Verhältnis), um einen sichtbaren Kern zu zeigen. Eine mögliche Lösung besteht darin, vorher einen Kernmarker zu verwenden. Dies wirkt sich nicht auf die endgültige Analyse aus, da jede Zelle auf ihre ursprüngliche Kernfluoreszenz normalisiert ist. Darüber hinaus wird empfohlen, die Konzentration von LMB zu kalibrieren, die für die Inhibierung des Exports verwendet wird, bevor dieser Assay durchgeführt wird, um die optimale Zunahme der Kernfluoreszenz effektiv zu beobachten. Der nukleozytoplasmatische Transportmangel wird vorgeschlagen, eine Hauptrolle bei der Degeneration von motorischen Neuronen in ALS 5 zu spielen ,= &quot;Xref&quot;&gt; 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Wenn dies der Fall ist, würden ähnliche nukleozytoplasmatische Transportdefekte, wie sie im Modell C9orf72 beobachtet wurden, voraussichtlich in anderen ALS-Modellen eine Rolle spielen. Wegen der großen Variabilität zwischen den verschiedenen Modellen können jedoch die Endresultate und molekularen Manifestationen, die sich aus der nukleozytoplasmatischen Störung ergeben, in jedem Fall unbemerkt oder phänotypisch verschieden sein. Trotz umfangreicher Recherchen zu verschiedenen FALS-Modellen bleibt eine Verknüpfung mit gängigen Mechanismen eine Herausforderung. Dieser Assay kann nun die Möglichkeit bieten, diese Herausforderung zumindest teilweise zu überwinden.

Der nukleare Porenkomplex (NPC) kontrolliert den Import und Export von großen Molekülen in und aus dem Zellkern. Im Gegensatz zu kleinen Molekülen, die ohne Regulation 1 in den Kern eindringen können, wird der Transport größerer Moleküle stark vom NPC kontrolliert. Diese großen Moleküle, wie Proteine ​​und RNA, assoziieren mit Transportfaktoren, einschließlich Importins und Exportins, importiert und exportiert aus dem Kern 2 . Um importiert zu werden, müssen Proteine ​​ein kleines Peptidmotiv enthalten, das im Allgemeinen als nukleares Lokalisierungssignal (NLS) bezeichnet wird, das durch Importine 2 gebunden ist. Diese Sequenzen von Aminosäuren wirken als Tag und sind in der Zusammensetzung 3 , 4 verschieden. Proteine ​​können aus dem Kern in das Zytoplasma aufgrund ihrer Assoziation mit Exportin exportiert werdenS, die eine Signalsequenz binden, die allgemein als nukleares Exportsignal (NES) bezeichnet wird 2 . Sowohl Importins als auch Exportins sind in der Lage, ihre Ladung aufgrund der Regulierung des kleinen Ras-verwandten Nuklearproteins GTPase (Ran) 2 zu transportieren. Es wurde gezeigt, dass Ran in verschiedenen Konformationszuständen existiert, je nachdem, ob es an GTP oder BIP gebunden ist. Wenn an GTP gebunden, kann Ran an importins oder exportins binden. Nach der Bindung an RanGTP veröffentlichen die Importine ihre Fracht, während die Exportine RanGTP binden müssen, um einen Komplex mit ihrer Exportfracht zu bilden. Der dominante Nukleotidbindungszustand von Ran hängt von seinem Standort im Kern (RanGTP) oder dem Cytoplasma (RanGDP) ab. In jüngster Zeit haben eine Reihe von Studien eine Verbindung zwischen Beeinträchtigungen im nukleozytoplasmatischen Weg und sowohl der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) als auch der frontotemporalen Demenz (FTD) 5 , 6 gezeigt </sup&gt; , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS ist eine fortschreitende und tödliche neurodegenerative Erkrankung, die sowohl die oberen als auch die unteren motorischen Neuronen (MNs) 13 beeinflusst und zu einer Lähmung und letztlich zum Tode führt, innerhalb von 2-5 Jahren im Durchschnitt. Die meisten Fälle von ALS werden als sporadische (SALS) eingestuft, ohne jede offensichtliche genetische Verknüpfung, aber 10% werden dominant vererbt (familiäres ALS, FALS). Kürzlich wurden Hexanukleotid-Wiederholungserweiterungen (HREs) im Chromosom 9 offenen Leserahmen 72 (C9orf72) Gen 14 , 15 als genetische Ursache von ALS und FTD identifiziert. Diese Mutanten machen 30-40% der FALS-Fälle aus, und verschiedene Studien haben behauptetDass sie eine Toxizität durch Beeinträchtigung des nucleozytoplasmatischen Transports verursachen 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Diese Studien haben zumeist die endgültigen Ergebnisse und Manifestationen von HREs auf den nucleozytoplasmatischen Transport gezeigt, aber sie zeigen keine nukleocytoplasmatische Störung in Echtzeit. Infolgedessen wurde nur ein schwerer nukleozytoplasmatischer Transportmangel 11 , 17 , 18 untersucht. Dieses Protokoll beschreibt eine neue und veRy-sensitiven Assay zur Bewertung und Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdysfunktion in Echtzeit. Die Importrate eines NLS-NES-GFP-Proteins (Shuttle-GFP) kann in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden. Dies geschieht unter Verwendung eines Exportin-Inhibitors, wie zuvor beschrieben, so daß der Shuttle-GFP nur in den Kern gelangen kann. Mit der Fluoreszenzmikroskopie und einer Software, die in der Lage ist, Fluoreszenzveränderungen in Echtzeit zu quantifizieren, ist es möglich, allmähliche Änderungen der Fluoreszenzintensität des im Zellkern befindlichen Shuttle-GFP zu quantifizieren. Als Ergebnis kann eine Michaelis-Menten-ähnliche Sättigungskurve der Fluoreszenz-zu-Zeit-Achse, die die Menge an nuklearem Shuttle-GFP zu irgendeiner gegebenen Zeit darstellt, hergestellt werden. Durch die Verwendung der anfänglichen linearen Geschwindigkeit der Kurven ist es möglich, eine Steigung zu erzeugen, die die Eintrittsrate in den Kern vor der Fluoreszenzsättigung darstellt. Um den Test zu validieren, das übersetzenD C9orf72 Dipeptidwiederholungen, Poly (GR) und Poly (PR), die bisher berichtet wurden, um den nucleozytoplasmatischen Transport zu stören, wurden 5 , 7 , 8 , 10 , 12 verwendet. Unter Verwendung dieses Assays wurde eine 50% ige Abnahme der nuklearen Einfuhrrate im Vergleich zur Kontrolle beobachtet. Mit diesem System können winzige Veränderungen im nucleozytoplasmatischen Transport untersucht werden. Darüber hinaus kann die Fähigkeit verschiedener Faktoren, einen nukleozytoplasmatischen Transportdefekt zu retten, bestimmt werden.

<table><tbody><tr><td>Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)</td><td>tebu-bio</td><td>CLU140-A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L L-glucose</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS European Grade</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick</td><td>Bar Naor LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFect Transfection Reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531&quot;&gt;R0531&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Workbench 2</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptomycin B</td><td>Sigma</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp</td><td>Glas-Col</td><td>099C K5424CE</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002455</td><td></td></tr></tbody></table>

assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells

Der nukleozytoplasmatische Transport bezieht sich auf den Import und Export von großen Molekülen aus dem Zellkern. In jüngster Zeit haben eine Reihe von Studien eine Verbindung zwischen der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) und den Beeinträchtigungen im nukleocytoplasmatischen Weg gezeigt. ALS ist eine neurodegenerative Erkrankung, die die motorischen Neuronen beeinflusst und zu einer Lähmung und letztlich im Tode führt, innerhalb von 2-5 Jahren im Durchschnitt. Die meisten Fälle von ALS sind sporadisch, ohne irgendeine offensichtliche genetische Verknüpfung, aber 10% werden in einer dominanten Weise vererbt. Kürzlich wurden Hexanucleotid-Repeat-Expansionen (HREs) im Chromosom 9 offenen Leserahmen 72 (C9orf72) Gen als genetische Ursache von ALS und frontotemporaler Demenz (FTD) identifiziert. Wichtig ist, dass verschiedene Gruppen vor kurzem vorgeschlagen haben, dass diese Mutanten den nucleozytoplasmatischen Transport beeinflussen. Diese Studien haben zumeist das endgültige Ergebnis und die Manifestationen, die durch HREs auf den nucleozytoplasmatischen Transport verursacht wurden, gezeigt, aber sie zeigen keine nukleare Transportdysfunktion inEchtzeit. Als Ergebnis kann nur ein schwerer nukleozytoplasmatischer Transportmangel bestimmt werden, was hauptsächlich auf eine hohe Überexpression oder exogene Proteineinfügung zurückzuführen ist. Dieses Protokoll beschreibt einen neuen und sehr empfindlichen Assay zur Bewertung und Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdysfunktion in Echtzeit. Die Importrate eines NLS-NES-GFP-Proteins (Shuttle-GFP) kann in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden. Dies wird durch die Verwendung eines Exportin-Inhibitors durchgeführt, so dass der Shuttle-GFP nur in den Kern eindringen kann. Zur Validierung des Assays wurden die C9orf72 HRE translatierten Dipeptidwiederholungen, Poly (GR) und Poly (PR), die bisher gezeigt wurden, um den nucleozytoplasmatischen Transport zu stören, verwendet. Unter Verwendung des beschriebenen Assays wurde im Vergleich zur Kontrolle eine 50% ige Abnahme der nuklearen Importrate beobachtet. Mit diesem System können winzige Veränderungen des nucleozytoplasmatischen Transports untersucht und die Fähigkeit verschiedener Faktoren zur Rettung (auch nur teilweise) einer nukleozytoplasmatischen trAnsport-Defekt kann bestimmt werden.

Unter Verwendung des hier vorgestellten Verfahrens wurden motorneuronartige NSC-34-Zellen mit einem NLS-NES-GFP (Shuttle-GFP) -Protein transfiziert. Dieses Protein, das NLS- und NES-Signalsequenzen aufweist (Abbildung 1 ), kann zwischen dem Zellkern und dem Cytoplasma pendeln. Generisches GFP kann den Kern in Abwesenheit eines Lokalisierungssignal-Tags nur durch Diffusion eintreten oder verlassen und ist daher gleichmäßig zwischen dem Kern und dem Cytoplasma verteilt (Abbildung 2A ). Im Gegensatz dazu ist das Shuttle-GFP-Protein meist im Cytoplasma aufgrund des NES- und NLS-Signals, das seine Dispersion beeinflusst ( Abb. 2B ), gefunden. So ermöglicht nur die Zugabe des Extinin-Inhibitors Leptomycin B (LMB), der den Protein-Export hemmt, die Akkumulation des Shuttle-GFP in den Zellkern und schließlich für die Messung der Shuttle-GFP-Importrate (Abbildung 2C ). Mit einem Leuchtstoffmikroskop und so<html> Um die Fluoreszenzveränderungen in Echtzeit zu quantifizieren, können allmähliche Veränderungen der Kernfluoreszenzintensität des Shuttle-GFP quantifiziert werden. Als Ergebnis kann eine Michaelis-Menten-ähnliche Sättigungskurve der Fluoreszenz-zu-Zeit-Achse ( Fig. 3 ), die die Menge an nuklearem Shuttle-GFP zu irgendeiner gegebenen Zeit darstellt, hergestellt werden. Durch Verwendung der anfänglichen linearen Geschwindigkeit der Kurven (wie durch den Kreis in Fig. 3 angedeutet) kann eine Steigung erzeugt werden, die die Eintrittsrate in den Kern vor der Fluoreszenzsättigung darstellt. Mehrere Studien zeigen, dass verschiedene C9orf72-Proteine ​​in Drosophila-Melanogaster- Modellen und / oder kultivierten Zellen toxisch sind 6 , 11 . Die aus HREs im mutierten C9orf72-Gen hergestellten Di-Peptid-Wiederholungen (DPRs), Poly (PR) und Poly (GR) wurden gefunden, um die nukleolische Belastung zu induzieren 8 ,Lass = &quot;xref&quot;&gt; 19 , 20 und wurden mit einem beeinträchtigten nukleozytoplasmatischen Transport verwickelt, wodurch sie besonders schädlich erscheinen. Um die Nützlichkeit des beschriebenen Assays zu überprüfen, wurden motorneuronartige NSC-34-Zellen mit diesen beiden DPR-Plasmiden, Poly (PR) und Poly (GR) transfiziert. Da Poly (PR) und Poly (GR) -DPRs auch an GFP konjugiert sind, war es wichtig zu bestätigen, dass die DPRs auch nicht von Leptomycin-B betroffen waren, was zu einem falsch-positiven Ergebnis führen würde. Poly (PR) -Expression wurde im Kern vollständig als Einschlüsse beobachtet; So konnte es kein falsch-positives nukleares Import-Signal geben ( Abbildung 4A ). Die Poly (GR) -Expression wurde hingegen homogen im Cytosol und auch als Einschlüsse im Zellkern beobachtet (Abbildung 4B ). Bei der Transfektion von NSC-34-Zellen mit Poly (GR) nur und Zugabe von Leptomycin-B wurde keine Shuttle-Bewegung des exprimierten Poly (GR) beobachtet (Abbildung 5 ). <p class=Bei der Analyse der nukleocytoplasmatischen Transportrate des Shuttle-GFP wurden NSC-34-Zellen gefunden, um entweder Poly (PR) oder Poly (GR) -DPRs zu exprimieren. Deutsch: bio-pro.de/de/region/freiburg/magaz...1/index.html , Was eine Verringerung der nuklearen Einfuhrrate von etwa 50% im Vergleich zu Zellen, die mit einem leeren Plasmid als Kontrolle transfiziert wurden, zeigt (Abbildung 5 ). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung des NLS-NES-GFP (Shuttle-GFP) -Konstrukts. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55676/55676fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig2.jpg" /> Abbildung 2: Leptomycin B hemmt den Export von Shuttle-GFP aus den Kernen von NSC-34-Zellen. Repräsentative Bilder von NSC-34 Zellen exp( A ) oder Shuttle-GFP-Protein vor ( B ) und 20 min nach Zugabe von 10 ng / ml Leptomycin B (LMB) ( C ). Nach LMB-Hinzufügung importiert Shuttle-GFP in den Kern, aber der Export zurück zum Zytoplasma ist blockiert. So sammelt sich Shuttle-GFP in den Kernen an. Maßstab = 15 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55676/55676fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig3.jpg" /> Abbildung 3: Michaelis-Menten-ähnliches Diagramm zeigt eine Zunahme der Kernfluoreszenz. Repräsentative Michaelis-Menten-ähnliche Kurven, die eine Zunahme der Kernfluoreszenz von zwei Gruppen, betroffenen und nicht betroffenen nukleozytoplasmatischen Transportzellen, innerhalb von 25 min darstellen. Die anfänglichen 5 min zeigen einen hohen Unterschied in der Zunahme Rate, die de istIm Laufe der Zeit gefaltet. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55676/55676fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig4.jpg" /> Abbildung 4: C9orf72 DPRs Poly (PR) und Poly (GR) Expression in NSC-34 Zellen. Repräsentative Bilder von NSC-34-Zellen, die mit den C9orf72-DPRs, Poly (GR) ( A ) und Poly (PR) ( B ) transfiziert wurden. Poly (GR) wird in den Zellkernen exprimiert, ist aber auch homogen im Cytosol verteilt. Poly (PR) wird hauptsächlich in den Kernen exprimiert. Maßstab = 30 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55676/55676fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig5.jpg" /><br/&gt; Abbildung 5: Die C9orf72 DPRs, Poly (PR) und Poly (GR) hemmen die nukleare Importrate in NSC-34-Zellen stark. Motor-neuronähnliche NSC-34-Zellen wurden mit Shuttle-GFP zusammen mit einem leeren Plasmid, Poly (PR) oder Poly (GR) co-transfiziert. Die nukleare Importrate wurde als die Steigung der anfänglichen linearen Rate der Kurve bei V max definiert . Die mit dem leeren Plasmid erhaltene Transportrate war als 100% definiert. Die Co-Transfektion mit Poly (PR) und Poly (GR) hemmte die Transportrate im Vergleich zur Kontrolle um etwa 50%. Die quantitative Analyse wurde an drei bis fünf unabhängigen Experimenten mit einem Weg ANOVA durchgeführt. **** p &lt;0,0001; P &lt;0,001. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55676/55676fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur sensitiven Messung der nukleozytoplasmatischen Transportrate in motorischen neuronähnlichen NSC-34-Zellen durch Quantifizierung der Echtzeitveränderung des nuklearen Importes eines NLS-NES-GFP-Proteins.

Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Aufrufe.  Ben-Gurion University of the Negev.  Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur sensitiven Messung der nukleozytoplasmatischen Transportrate in motorischen neuronähnlichen NSC-34-Zellen durch Quantifizierung der Echtzeitveränderung des nuklearen Importes eines NLS-NES-GFP-Proteins. 

Serie: Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative analysis of motor/cargo associations at the single vesicle level. The goal of this protocol is to use quantitative fluorescence microscopy to correlate (&#8220;map&#8221;) the position and directionality of movement of live cargo to the composition and relative amounts of motors associated with the same cargo. &#8220;Cargo mapping&#8221; consists of live imaging of fluorescently labeled cargoes moving in axons cultured on microfluidic devices, followed by chemical fixation during recording of live movement, and subsequent immunofluorescence (IF) staining of the exact same axonal regions with antibodies against motors. Colocalization between cargoes and their associated motors is assessed by assigning sub-pixel position coordinates to motor and cargo channels, by fitting Gaussian functions to the diffraction-limited point spread functions representing individual fluorescent point sources. Fixed cargo and motor images are subsequently superimposed to plots of cargo movement, to &#8220;map&#8221; them to their tracked trajectories. The strength of this protocol is the combination of live and IF data to record both the transport of vesicular cargoes in live cells and to determine the motors associated to these exact same vesicles. This technique overcomes previous challenges that use biochemical methods to determine the average motor composition of purified heterogeneous bulk vesicle populations, as these methods do not reveal compositions on single moving cargoes. Furthermore, this protocol can be adapted for the analysis of other transport and/or trafficking pathways in other cell types to correlate the movement of individual intracellular structures with their protein composition. Limitations of this protocol are the relatively low throughput due to low transfection efficiencies of cultured primary neurons and a limited field of view available for high-resolution imaging. Future applications could include methods to increase the number of neurons expressing fluorescently labeled cargoes.

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Charakterisierung der Zusammensetzung der molekulare Motoren auf Umzug Axonal Fracht Mit &quot;Fracht Mapping&quot; Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Neurowissenschaften

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Biologie

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

Ein High-Content-Assay für die Überwachung der AMPA Rezeptor Menschenhandel

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Nuclear Transport Assays in Permeabilized Mouse Cortical Neurons

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing recognition of cell-specific differences in nuclear pore complex structure, prompting a need to adapt nuclear transport methods for use in neurons. Permeabilized cell assays, in which the plasma membrane is selectively perforated by digitonin, are widely used to study passive and active nuclear transport in immortalized cell lines but have not been applied to neuronal cultures. In our initial attempts, we observed the rapid loss of nuclear membrane integrity in primary mouse cortical neurons exposed to even low concentrations of digitonin. We hypothesized that neuronal nuclear membranes may be uniquely vulnerable to the loss of cytoplasmic support. After testing multiple approaches to improve nuclear stability, we observed optimal nuclear integrity following hypotonic lysis in the presence of a concentrated bovine serum albumin cushion. Neuronal nuclei prepared by this approach reliably import recombinant fluorescent cargo in an energy-dependent manner, facilitating analysis of nuclear import by high content microscopy with automated analysis. We anticipate that this method will be broadly applicable to studies of passive and active nuclear transport in primary neurons.

<meta charset="utf8"></head><body>Kerntransport-Assays in permeabilisierten kortikalen Neuronen der Maus

We have developed a reliable method of selective plasma membrane permeabilization of primary mouse cortical neurons for high content automated analysis of neuronal nucleocytoplasmic transport.

Kerntransport-Assays in permeabilisierten kortikalen Neuronen der Maus

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen

Zusammenfassung

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Kerntransport-Assays in permeabilisierten kortikalen Neuronen der Maus

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Erweiterung des Toolkits für die In-vivo-Bildgebung des axonalen Transports