Diese Methoden ermöglichen eine schnelle Beurteilung, ob eine experimentelle Manipulation, ein krankheitserregendes Protein oder eine RNA synaptische Prozesse beeinflussen kann und ob therapeutische Verbindungen die Funktion wiederherstellen können. Diese Techniken liefern eine zuverlässige Auslesung der synaptischen Funktion aus einer Gruppe von Neuronen in einem relativ kurzen Zeitraum im Vergleich zur Elektrophysiologie. Dieses Protokoll kann auf jede Erkrankung der neuronalen Entwicklung oder Degeneration angewendet werden.
Dies funktioniert gut für primäre neuronale Nagetierkulturen und für Neuronen, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen stammen. Optimieren Sie zunächst die Bildaufnahmeeinstellungen mit einer konfokalen Bilderfassungssoftware. Halten Sie die Erregerleistungs-Belichtungszeit, die Detektorverstärkung und die Bildrate über alle Proben hinweg konstant.
Wählen Sie für die Zeitrafferbildgebung ein Seitenverhältnis von 512 x 512 und eine Bildrate von zwei Bildern pro Sekunde, um die Farbstoffbleiche zu minimieren. Wählen Sie dann die Fluoreszenzanregungs-, dichroitischen und Emissionsfilterkombinationen für GCaMP sechs M / GCaMP drei mit Fitzy und Stearoylfarbstoff mit Trixi. Um Z-Drift während der Zeitrafferbildgebung zu vermeiden, verwenden Sie die perfekte Fokussierfunktion der konfokalen Bilderfassungssoftware.
Wählen Sie als Nächstes die Zeitregisterkarte im Bildaufnahmefenster aus. Stellen Sie für Phase eins das Intervall 500 Millisekunden und die Dauer von drei bis fünf Minuten ein. Und für Phase zwei legen Sie das Intervall 500 Millisekunden und die Dauer fünf Minuten fest.
Um dann die Schwerkraftperfusionsapparatur für künstliche Zerebrospinalflüssigkeit oder ACSF zusammenzubauen, laden Sie den ACSF-Puffer mit hohem Kaliumchloridgehalt in eine 50-Milliliter-Spritze an der Oberseite des Geräts und stellen Sie die Durchflussrate auf einen Milliliter pro Minute ein. Laden Sie dann eine 35-Milliliter-Glasschale mit Neuronen auf die konfokale Bildgebungsstufe, wobei das Ende des Perfusionsschlauchs am Tellerrand platziert ist, und wählen Sie das Feld für die Bildgebung aus. Inkubieren Sie 48 Stunden nach der Transfektion die primären kortikalen oder motorischen Neuronen in ACSF-Puffer mit niedrigem Kaliumchloridgehalt für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Entfernen Sie dann den Puffer durch Aspiration und laden Sie mit einer Pipette die Neuronen im Dunkeln auf eine Petrischale mit Glasboden, die mit ACSF gefüllt ist, das 50 Millimolar Kaliumchlorid und 10 Mikromolar Styrylfarbstoff enthält. Entfernen Sie nach fünf Minuten die Ladelösung und baden Sie die Neuronen in einem ACSF-Puffer mit niedrigem Kaliumchloridgehalt bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten, um die unspezifische Farbstoffbelastung zu beseitigen. Legen Sie dann die Schale auf die Bildgebungsstufe des invertierten konfokalen Mikroskops und beobachten Sie die Zellen unter einem 20-fachen Luftobjektiv oder einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv.
Stimulieren Sie den Stahlfarbstoff mit einem 546-Nanometer-Laser und sammeln Sie die Emission mit einem Bandpassfilter von 570 bis 620 Nanometern. Nachdem Sie das Bildfeld ausgewählt und den perfekten Fokus aktiviert haben, nehmen Sie ein einzelnes Standbild mit hellen Feld-, Trixi- und Fluoreszenzmarkerkanälen auf, um neuronale Grenzen zu markieren. Starten Sie dann Run Now in der Erfassungssoftware und führen Sie die Basalaufzeichnung für drei bis fünf Minuten durch, um Schwankungen der Farbstoffintensität auszuschließen.
Lösen Sie direkt am Schalter in Phase zwei die Einschalttaste für das Perfusionssystem aus und perfusionieren Sie ständig 50 Millimolar Kaliumchlorid zu den Neuronen, um das Entladen von Farbstoffen zu erleichtern. Führen Sie die Aufnahmen fünf Minuten lang durch und lösen Sie dann den Ausschalter für das Perfusionssystem aus. Speichern Sie das Experiment für die spätere Datenanalyse mit der konfokalen Software.
48 Stunden nach der Transfektion mit GCaMP sechs M, inkubieren Sie die primären kortikalen Neuronen von Nagetieren mit niedrigem Kaliumchlorid-ACSF für 15 Minuten. Montieren Sie dann die Schüssel auf der Bildgebungsplattform und visualisieren Sie die GCaMP-Sechs-M-Fluoreszenz mit einem Fitzy-Filter und einem 20- oder 40-fachen Objektiv. Nachdem Sie das Bildfeld ausgewählt und den perfekten Fokus aktiviert haben, nehmen Sie ein einzelnes Standbild mit Hellfeld-, Fitzy- und Fluoreszenzmarkerkanälen auf, um neuronale Grenzen zu markieren.
Als nächstes initiieren Sie Run Now in der Erfassungssoftware und führen die Basalaufzeichnung für drei bis fünf Minuten durch. Perfundieren Sie dann ACSF mit 50 Millimolar Kaliumchlorid zu den Neuronen, wie zuvor gezeigt, und zeichnen Sie fünf Minuten lang auf. Wenn die Bildaufnahme beendet ist, speichern Sie das Experiment und fahren Sie mit der Datenanalyse mit der konfokalen Software fort.
Öffnen Sie für die Bildanalyse die Zeitrafferbilder in der konfokalen Software und richten Sie die Bilder aus, indem Sie auf Bild klicken, gefolgt von der Verarbeitung, gefolgt von der Ausrichtung des aktuellen Dokuments, und wählen Sie dann Am ersten Frame ausrichten. Wählen Sie mit dem ROI-Auswahltool interessante Regionen entlang der Neuriten aus und markieren Sie auch einen ROI, der die Hintergrundfluoreszenzintensität darstellt. Starten Sie als Nächstes die Messfunktion aus dem Zeitmessfeld, um die Rohfluoreszenz im Laufe der Zeit für die ausgewählten ROIs zu messen.
Nach der Messung exportieren Sie die rohen Fluoreszenzintensitäten in die Tabellenkalkulationssoftware. Kultivierte primäre kortikale Neuronen von Ratten, die mit Styrylfarbstoff beladen sind, sind hier dargestellt. Die Spezifität der Farbstoffbelastung wurde durch Co-Markierung mit synaptischen Vesikelmarker Synaptophysin bestimmt, und die Mehrheit der sterilen farbstoffpositiven Puncta ist für diesen Marker co-positiv.
Die Analyse der rohen Intensitätswerte über den gesamten Bildgebungszeitraum zeigt, dass Synaptophysin und Intensität konstant bleiben, während die Intensität des Styrylfarbstoffs nach der Stimulation abnimmt. Für grün fluoreszierende Proteintransfizierungs-Kontrollneuronen führte eine erfolgreiche synaptische Vesikelfreisetzung zu einem auffallenden Verlust der Farbstofffluoreszenz bei hoher Kaliumchlorid-Depolarisation. Dieses repräsentative Video zeigt ein Neuron, das nach der Stimulation selektiv Styrylfarbstoff in einer neuen rechten Region entlädt.
Im Gegensatz dazu wird in Neuronen, die mit einem C neun ORF 72 transfiziert sind, das mit dem Farbstoffpeptid-Wiederholungskonstrukt zu GA 50 verknüpft ist, eine gestörte synaptische Übertragung durch eine zurückgehaltene Farbstofffluoreszenz auch nach hoher Kaliumchlorid-Depolarisation dargestellt. Repräsentative Fluoreszenzbilder von kortikalen Neuronen, die mit GCaMP sechs M vor und nach der Kaliumchlorid-Depolarisation transfiziert wurden, sind hier gezeigt. Erhöhte Fluoreszenzwerte und kortikale Neuronen, die mit GCaMP six M transfiziert wurden, deuten auf einen Kalziumeintritt in Neuriten nach Kaliumchlorid-induktiver Depolarisation hin.
Am Ende der Baseline-Aufnahmeperiode exprimierten die Neuronen GCaMP sechs M mit einer niedrigen Fluoreszenz. Ein dramatischer Fluoreszenzanstieg wird dann zu Beginn der Stimulation beobachtet. Stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenz-Basisaufnahmen für Styrylfarbstoff und GCaMP stabil sind.
Verwenden Sie immer den perfekten Fokus, um Bilddrift zu vermeiden, was die Datenverarbeitung nach dem Bild zu einer Herausforderung machen würde. Eine weitere Kultivierung von Neuronen wird nicht empfohlen, da die Gerichte im Überfluss der Luft ausgesetzt sind. Die Immunfärbung oder Extraktion von Protein oder RNA kann jedoch mögliche Ursachen für synaptische Veränderungen bewerten.
