Dendritische Zellen oder DCs sind wichtige Immunzellen, die das angeborene und adaptive Immunsystem verbinden. Während DCs heterogen sind, hilft uns diese Methode zu verstehen, welche Gene, einschließlich Transkriptionsfaktoren, die DC-Entwicklung regulieren können. Diese Technik bietet eine einfache und schnelle Möglichkeit, ein Gen zu identifizieren, das die DC-Entwicklung von ihrem Vorläufer in vitro steuert.
Halten Sie zunächst die immortalisierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen oder iHSPCs in einem vollständigen RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 100 Nanogramm pro Milliliter des FLT3-Liganden und einem mikromolaren Beta-Östradiol. Für die lentivirale Transduktion werden die iHSPCs in 12 Well-Platten mit einer Dichte von eins mal 10 zu den fünften Zellen pro Vertiefung und einem Milliliter vollständigem Medium, das den FLT3-Liganden, Beta-Östradiol und Polybren enthält, plattiert. Fügen Sie dann das Lentivirus hinzu, das die kurze Haarnadel-RNA in jeder Vertiefung bei einer Vielzahl von Infektionen von 100 trägt.
Als nächstes drehen Sie die Platte bei 1100 mal g und 37 Grad Celsius für 90 Minuten und inkubieren Sie dann die infizierten Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag wird das Polybren entfernt, indem die Zellen in Zentrifugation in 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt werden, nachdem das Medium durch ein frisches vollständiges Medium ersetzt wird, das den FLT3-Liganden und das Beta-Östradiol enthält. Nach weiteren 24 Stunden sechs Mikrogramm pro Milliliter Puromycin in das Medium geben, um die infizierten Zellen auszuwählen.
Ersetzen Sie das Selektionsmedium alle drei Tage und halten Sie die Zellen mindestens eine Woche lang, um die stabil transduzierten iHSPCs zu erweitern. Generieren und pflegen Sie stabile Knockdown-iHSPCs für LacZ, Tcf4 und Id2 in einem vollständigen Medium, das mit dem FLT3-Liganden und Beta-Östradiol ergänzt wird. Um die In-vitro-Differenzierung einzuleiten, werden die undifferenzierten iHSPCs in 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt und die Zellen durch Zentrifugation pelletiert.
Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und die Zellen zweimal mit 10 Milliliter PBS waschen. Nach der zweiten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in einem vollständigen Medium, das nur den FLT3-Liganden enthält, und säen Sie sie dann mit einer Dichte von zweimal 10 bis zum fünften Verkauf pro Milliliter in eine 12-Well-Platte. Nach drei Tagen fügen Sie einen Milliliter frisches komplettes Medium hinzu, das den FLT3-Liganden enthält.
Nach weiteren zwei Tagen fahren Sie mit der Analyse der differenzierten Zellen mittels Durchflusszytometrie fort. Für die durchflusszytometrische Analyse pipettieren Sie die Zellen zwei- bis dreimal in der Platte nach oben und unten und sammeln die Zellen dann in 1,5 Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen in 50 Mikroliter Faxpuffer wiederverwenden.
Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter Anti-CD16 durch 32 Hybridom-Überstand hinzu und inkubieren Sie für fünf bis 10 Minuten auf Eis. Fügen Sie dann fluoreszierende Farbstoff-konjugierte Antikörper direkt zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie für 15 Minuten auf Eis im Dunkeln. Nach der Inkubation die Zellen mit einem Milliliter Faxpuffer waschen und die Probe zentrifugieren.
Nach der Zentrifugation resuspenieren Sie die Zellen in 100 Mikroliter Faxpuffer und analysieren die Proben mittels Durchflusszytometrie. Nach einem kurzen Haarnadel-RNA-vermittelten Knockdown von LacZ, Tcf4 und Id2 in iHSPCS zeigte die Bestätigung der Knockdown-Effizienz durch RTQ-PCR, dass die Expression von Tcf4- und Tcf4-Knockdown-iHSPCs im Vergleich zu der in LacZ-Knockdown-iHSPCs reduziert war. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Id2-Expression in den Id2-Knockdown-iHSPCs beobachtet.
Nach der Kultivierung von LacZ-Knockdown-iHSPCs für fünf Tage lag die Häufigkeit von CD11c-positiven Zellen, die die dendritische Zellpopulation darstellen, bei etwa 95%. Eine weitere Analyse von CD11c-positiven dendritischen Zellen, die aus den LacZ-Knockdown-iHSPCs gewonnen wurden, ergab, dass 70% konventionelle dendritische Zellen waren, während 22% plasmazytoide dendritische Zellen waren. Die Tcf4-Knockdown-iHSPCs erzeugten einen signifikant geringeren Prozentsatz an plasmazytoide dendritischen Zellen, die der LacZ-Knockdown kontrolliert.
Im Gegensatz dazu erzeugten die Id2-Knockdown-iHSPCs einen signifikant geringeren Prozentsatz herkömmlicher dendritischer Zellen als die LacZ-Knockdown-Kontrollen, aber einen höheren Prozentsatz an plasmazytoden dendritischen Zellen. Spin-Infektionen erhöhen die Transduktionseffizienz von Lentivirus-tragender shRNA in die iHSPCs. Diese Technik befasst sich mit der Rolle von Transkriptionsfaktoren und erleichtert die Untersuchung anderer Gene in der Zytokin-Signaltransduktion oder im Metabolismus, die wahrscheinlich an der DC-Entwicklung beteiligt sind.
