Dieses Protokoll beschreibt die RNA-Probenvorbereitung und den NMR-Aufbau für Protonen-R1rho-Relaxationsdispersionsmessungen zur Untersuchung des Bestätigungsaustauschs in RNA-Molekülen. Da Protonen untersucht werden, benötigt die Methode keine Isotopenmarkierung und kann direkt auf strukturelle Merkmale wie verschobene Basenpaarung zugreifen. Die Pipette ist ziemlich modular in dem Sinne, dass die R1rho-Relaxationsdispersion auch dann gemessen werden kann, wenn die Probe mit einem anderen Verfahren hergestellt wird.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Plasmidprobe und dem Aufbau einer In-vitro-Transkriptions- und Spaltungsreaktion, wie im Textmanuskript beschrieben. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Anschließend wird ein Mikroliter der Probe in der Ladelösung verzehnfacht.
Und führen Sie einen Mikroliter auf einem denaturierenden PAGE-Gel aus. Wenn die Spaltungsreaktion erfolgreich ist, skalieren Sie die Reaktion auf das gewünschte Volumen und führen Sie sie über Nacht aus. Führen Sie dann ein weiteres denaturierendes PAGE-Gel aus und beurteilen Sie, ob die Spaltungsreaktion abgeschlossen ist.
Bei unvollständiger Spaltung die Reaktionslösung in einer herkömmlichen Mikrowelle 15 Sekunden lang auf 450 Watt erhitzen. Dann kühlen Sie die Lösung langsam auf 37 Grad Celsius für 40 Minuten ab, um die RNA und den Spaltleiter wieder zuannen. Und beachten Sie die Bildung eines neuen Niederschlags.
Fügen Sie mehr anorganische Pyrophosphatase hinzu und RNase H.Inkubieren Sie die Reaktion für ein bis drei Stunden bei 37 Grad Celsius. Bestätigen Sie dann den Abschluss der Spaltungsreaktion mit der DenaturierungSSEITE. Wenn die RNase H-Spaltungsreaktion abgeschlossen ist, löschen Sie die Reaktion ab, indem Sie EDTA zu einer Endkonzentration von 50 Millimolaren hinzufügen.
Und Wirbel gründlich. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2-Mikron-Spritzenfilter. Und konzentrieren Sie die Lösung auf ein Volumen, das zur Reinigung in ein HPLC-System injiziert werden kann.
Bevor Sie die konzentrierte und gereinigte Probe in das NMR-Röhrchen geben, reinigen Sie das Röhrchen, indem Sie es mit reichlich Wasser spülen. Dann RNase Dekontaminationsreagenz, Wasser und 95% Ethanol. Nach dem abschließenden Spülen mit Wasser trocknen lassen.
Spülen Sie den Kolben mit Wasser ab und reinigen Sie mit RNase-Dekontaminationsreagenz und 95% Ethanol mit einem fusselfreien Tuch. Nach dem Trocknen des Röhrchens und des Kolbens 10% D2O in die NMR-Probe geben. Verwenden Sie eine große Pipettenspitze, um die RNA-Probe in das NMR-Röhrchen zu übertragen und entlang der Seite der Röhrenwand zu fließen.
Setzen Sie den Kolben in das Rohr ein, indem Sie ihn mit einer schnellen Drehbewegung nach unten drücken, um Luftblasen zu entfernen, und ziehen Sie den Kolben dann langsam nach oben, ohne neue Luftblasen zu erzeugen. Und fixieren Sie es mit Paraffinwachsfolie. Erstellen Sie einen neuen Datensatz basierend auf einem aromatischen Protonenkohlenstoff-HSQC-Datensatz, der auf vollständig markierten RNA-Proben für die RNA-Zuweisung verwendet wird.
Legen Sie die allgemeinen Parameter und RD-spezifischen Parameter fest. Stellen Sie dann die Protonen-Spin-Lock-Leistung zum Testen auf 1,2 Kilohertz ein. Generieren Sie eine Test-VD-Liste mit nur einem Eintrag, null Millisekunden, legen Sie TDF1 auf eins fest, und aktualisieren Sie D30, um ein Testspektrum auszuführen.
Nachdem Sie eine Test-vd-Liste eingerichtet haben, aktualisieren Sie D30 und TDF1. Und zeichnen Sie die Intensität des Peaks für verschiedene Spin-Lock-Längen auf. Identifizieren Sie die Spin-Lock-Länge, bei der die Intensität des ursprünglichen Peaks auf ein Drittel abnimmt.
Erstellen Sie aus dem Ergebnis der Testläufe die endgültige vd-Liste, die im Experiment verwendet werden soll. Wählen Sie die Anzahl der Scans aus, sodass der schwächste Peak der Liste ein Signal-Rausch-Verhältnis von mindestens 10 aufweist. Die Ergebnisse mehrerer Spaltreaktionen von Tandem-Transkripten werden hier gezeigt.
In einer erfolgreichen Reaktion wurde eine 20-Nukleotid-Ziel-RNA erzeugt. Erfolglose Reaktionen führten zu einer unvollständigen und fehlgeschlagenen Spaltung der Probe. Die HPLC-Injektion der RNA-Probe zeigte einen Peak für reine Ziel-RNA nach 38 Minuten.
Während längere und kürzere Produkte gut vom Peak of Interest getrennt waren. Die Analyse der RNA-Haarnadel zeigte, dass die Anzahl der beobachteten Imino-Protonen mit der Anzahl der Imino-Protonen übereinstimmte, die aus einer Sekundärstruktursimulation erwartet wurden. Das Protonenkohlenstoff-HSQC-Spektrum der aromatischen Resonanzen der RNA zeigte nach der Faltung vier Signale.
Und nur drei Signale vor dem Falten. In den repräsentativen Resonanzkurven, die für zwei verschiedene H8-Atome und zwei verschiedene synthetische RNA-Haarnadeln erhalten wurden, erfährt die G6H8 einen bestätigungserischen Austausch. Während der A4H8 dies nicht tut.
Für G6H8 wurden die farbigen Spin-Lock-Kräfte ausgewählt und Off-Resonanz-Daten aufgezeichnet. Im CG-Konstrukt, in dem der Austausch langsam ist, zeigten die R1rho-Zeilenwerte im Vergleich zum Offset-Diagramm bereits eine leichte Asymmetrie der Kurve, die das Vorzeichen der chemischen Verschiebungsdifferenz Delta Omega anzeigt. Dies wird im R2 plus REX-Diagramm noch deutlicher, wo der R1-Beitrag entfernt wird.
Auf der anderen Seite erfährt das GC-Konstrukt einen schnelleren Austausch und das R1rho-Werte-Offset-Diagramm stellte eine breitere Kurve dar, in der die Extraktion von Delta-Omega selbst im R2 plus REX-Diagramm weniger offensichtlich wird. Ist die RNA-Dynamik aufgeklärt, können die Zustände charakterisiert und eingefangen werden. Diese gefangenen Zustände können beispielsweise in biologischen Assays getestet werden.
Diese Methode ermöglicht es uns, funktionelle, relevante Basenpaarverschiebungen in einem aktiven microRNA-miRNA-Komplex, Schleifenumlagerungen in ribosomaler RNA und Basenpaarstabilität auf einzelnen Nukleotidwölbungen zu beobachten.
