Die Vorbereitung dieses Manuskripts wurde über Start-up-Fonds von der University of Colorado Denver (JMRE) unterstützt. AF möchte die Unterstützung von einem Research and Creative Activities Award (RaCAS, CU Denver) anerkennen. Die Finanzierung durch das Amt für Forschungsdienste, Universität von Colorado Denver zur Deckung der Veröffentlichungsgebühren wird anerkannt. Wir danken den Labormitgliedern Frau Cassandra Herbert und Herrn Yannick K. Dzowo für ihre Beiträge im Videobereich.

1. Festphasensynthese von RNA-Oligonukleotiden <ol><li> Herstellung von Lösungen, die jeden Phosphoramidit enthalten (Tabelle 1). <ol><li> Zähle die Anzahl der Nukleotide und passt in die n + 1-Gleichung (wobei n = Anzahl der Nukleotide) jeder Base entspricht und die Tabelle mit den fehlenden Werten ausfüllen. Volumen = 0,15 ml pro Nukleotid bei einer Konzentration von 0,1 M, gelöst in wasserfreiem Acetonitril. </li><li> Wiegen Sie jeden Phosphoramidit in ofengetrocknete 10 ml Bernsteinflaschen (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top) und legen Sie sofort unter Vakuum mit einem Exsikkator, der ein Trockenmittel enthält. </li><li> Füllen Sie den Exsikkator mit trockenem Argon, entfernen Sie die Flasche und verdünnen Sie sofort mit der entsprechenden Menge Acetonitril (wasserfrei), bevor Sie auf dem Instrument sichern. HINWEIS: Achten Sie darauf, gasdichte Spritzen zu verwenden und zu jeder Zeit eine wasserfreie Atmosphäre zu halten. </li><li> Septa aus der Flasche nehmen und auf die m legenAchine, über eine Flaschenwechselfunktion. HINWEIS: Dieses Verfahren erfordert zusätzliche 0,15 ml (also das überschüssige Volumen in der n + 1-Gleichung oben) jeder Lösung, um die Linie vor der Synthese zu prime. </li></ol></li><li> Aufbau der Sequenz- und Festphasensynthese mit der Software ( Abbildung 3 ). <ol><li> Klicken Sie auf das Software-Symbol ( zB OligoNet 1.0.1) und wählen Sie Instrumentname&gt; OK . Erstellen Sie eine neue Synthese nach Datei&gt; Neue Synthese&gt; Bestellung . </li><li> Fill-In: Datum; RunID; Instrument auswählen; Sequenzname; Sequenz (5&#39;-to-3&#39;-Ende). Unter &quot;Zyklus&quot; die zuvor erstellte Methode zuordnen ( Abbildung 3 ). Wählen Sie das Ende Verfahren, ( verlässt Oligonukleotid an das CPG-Harz gebunden)&gt; Handbuch. </li><li> Wählen Sie DMT Off&gt; (TCA-Behandlung im letzten Schritt, um eine 5&#39;-OH-Gruppe am Ende der Synthese zu erhalten) ; Speichern Sie Datei&gt; Speichern unterUnd geben Sie einen Namen für das Experiment. </li><li> Senden Sie die Datei, um die Synthese zu beginnen. Bestellen&gt; Sendung an den Synthesizer senden und die Spalte auswählen 1-4 Öffnen Sie das Synthesizer-Fenster und wählen Sie trityl monitor | select function | trity&gt; überwachen jeden Schritt . </li><li> Wiederholen Sie die notwendigen Schritte, je nach Anzahl der zu synthetisierenden Oligonukleotide (beachten Sie, dass alle Aufträge die gleiche Methode haben müssen, dh die gleichen Kopplungszeiten und die Reihenfolge der Ereignisse). </li><li> Beginne die Synthese Synthesizer&gt; Vorbereitung zu starten . Legen Sie die Säulen mit den gewünschten 3&#39;-Enden auf die am Instrument angegebenen Positionen. Klicken Sie auf dem Instrument auf Start&gt; Nein (für ABI Vorbereitung). </li><li> Sobald die Synthese abgeschlossen ist, entfernen Sie die Säule aus dem Instrument und legen Sie sie in einen Rundkolben, gefolgt von einem Trocknen unter vermindertem Druck für ca. 0,5 h. HINWEIS: Es wird empfohlen, zu überprüfen, ob eine tiefe orange Farbe in rand beobachtet wirdOm-Kupplungen (Schritte 1.2.4 - 1.2.7), um mögliche Fehler aus der Trityl-Monitor-Funktion zu vermeiden. </li></ol></li><li> Entschützung und Reinigung von RNA-Oligonukleotiden. <ol><li> Öffnen Sie die Säule, indem Sie die schwarze Kappe verdrehen und alle (oder die Hälfte je nach Bedarf oder Zweck) des weißen Harzes in ein 1,6 mL Zentrifugenröhrchen überführen. Füge 0,5 ml eines Methylamins (40% in Wasser) / Ammoniak (40% in Wasser) bei 1: 1 zu. </li><li> Sichern Sie die Zentrifugenröhrchenkappe mit Parafilm und erwärmen Sie mit einem Wärmeblock 1,5 h auf 60 ° C. HINWEIS: Ein schweres Objekt kann auf das Rohr gelegt werden, um sicherzustellen, dass die Ammoniakkonzentration im Reaktionsrohr konstant bleibt. </li><li> Vom Heizblock entfernen und langsam auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Die Probe sorgfältig zentrifugieren, um den Inhalt zu spinnen, dann den Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen überführen. </li><li> Einfrieren der Proben durch Eintauchen von Röhrchen in flüssigem Stickstoff (oder Trockeneis / Ethanol-Bad) und konzentrieren sich zur Trockene während SpinnIn einer Zentrifuge unter vermindertem Druck. </li><li> Die Suspensionen in 0,4 ml einer Triethylamin / N-Methylpyrrolidinon / Triethylamin-Trihydrofluoridlösung (2: 2: 3-Verhältnis) erneut suspendieren. Auf 60 ° C für 1,5 h erhitzen, gefolgt von langsamer Abkühlung auf Raumtemperatur. </li><li> Fügen Sie 0,04 ml einer NaOAc-Lösung (3M, pH 5,5 - eingestellt mit HCl) hinzu, gefolgt von sanftem Mischen mit einer Pipettenspitze. Ethanol (1 ml) zugeben und auf ca. -70 ° C (Trockeneis / Ethanol-Bad) für 15 min. </li><li> Zentrifugieren bei 15.000 U / min und 4 ° C für 10 min. Verwenden Sie eine Pipette, um das Aliquot zu extrahieren und das erhaltene Pellet unter vermindertem Druck zu trocknen. </li><li> Den erhaltenen Feststoff im Beladungspuffer (0,2 ml, 90% iges wässriges Formamid, 1 mM EDTA) erneut suspendieren und mischen, bis das Gemisch homogen ist. </li><li> Beladung auf ein zuvor hergestelltes Polyacrylamidgel (20% Denaturierung, Wellungsmaße: 30 cm x 1 mm) 22 . </li><li> Tragen Sie einen Strom durch das Gel, bis der Bromphenol-Blau-Marker zwischen 1 / 2-2 / 3 liegtDas Gel (Gelmaße: ~ 21,5 cm x 30 cm). </li><li> Entfernen Sie das Gel vom Ständer und übertragen Sie den Gelgehalt vom Glas auf die Plastikfolie (beidseitig abgedeckt) und legen Sie eine Dünnschichtchromatographie (TLC) mit Siliciumdioxid (mit Fluoreszenzfarbstoff bei 254 nm) auf, um die Bänder zu visualisieren Mit einer UV-Lampe (λ max = 254 nm). </li><li> Verwenden Sie eine Markierung, um die Position, wo das obere Band befindet, abzugrenzen und schneiden Sie es mit einem neuen Rasierklinge. Legen Sie das Gel, das die RNA (ohne Plastikfolie) enthält, in ein 50-ml-konisches Röhrchen und zerkleinert mit einem Glasstab zu kleinen Stücken. </li><li> Suspendieren der Gelreste in eine NaCl-aq. Lösung (2 mM und 1 mM EDTA) und schüttelte die Suspension bei 37 ° C für 12 h. Das Kegelrohr für 10 min zentrifugieren. </li><li> Mit einer Umkehrphasen-C18-Patrone entsorgen. <ol><li> Vorbereitung der Patrone mit einer 10-ml-Spritze durch Waschen mit: Acetonitril (10 ml) H 2 O (zweimal 10 ml) 5 mM NH4 Cl aq. Lösung (3 ml) Lösung, die RNA enthält, wobei darauf geachtet wird, keine der Gelreste zu gießen. </li><li> Waschen mit H 2 O (dreimal, 10 mL). </li><li> Eluieren Sie aus der Säule mit einem 60% aq. Methanollösung (3 ml) </li></ol></li><li> Unter vermindertem Druck konzentrieren und in RNase-freiem Wasser (0,3 ml) wieder auflösen </li><li> Eine verdünnte Lösung (10 μl) vorbereiten und 1 μl auf das UV-Vis-Instrument ( zB Nanodrop) abgeben, um das UV-Vis-Spektrum (200-450 nm) zu messen. </li><li> Verwenden Sie das Bier-Lambert-Gesetz, um die Konzentration der erhaltenen Lösung zu bestimmen: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/56189/56189eq1.jpg" /> Wo A = erhaltene Extinktion; Ε = berechneter molarer Extinktionskoeffizient; C = Konzentration und l = 0,1 für eine Weglänge von 1 mm. </li><li> Berechnen Sie die molaren Extinktionskoeffizienten für die Oligonukleotide; Hier mit einem Online-Rechner berechnetDas verwendet DINAMelt Software (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23 </li></ol></li><li> Konzentrationsbestimmung und Charakterisierung über MALDI-TOF. <ol><li> Legen Sie Proben auf eine MALDI-Platte mit einer Pipettenspitze, die mit einer C18-Spitze beladen ist, um zu entsalzen und jedes Oligonukleotid zu lokalisieren. <ol><li> Die Spitze mit 50% Acetonitril (10 μl x 2) waschen. Die Spitze mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA, 10 μl x 2) äquilibrieren. Lastspitze mit Probe (typischerweise 100-150 pmol). </li><li> Die Spitze mit 0,1% TFA (10 μl x 2) und dann mit Wasser (10 μL x 2) waschen. </li><li> Eluieren Sie die Probe in eine Lösung, die die gewünschte Matrix enthält; Wir verwendeten eine Lösung von: 10 μl 25 mM-2,4,6-Trihydroxyacetophenon-Monohydrat (THAP), 10 mM Ammoniumcitrat und 300 mM Ammoniumfluorid in 50% Acetonitril. </li><li> Spot direkt auf die MALDI-Platte durch Abscheiden von 0,9 μl (gefolgt von Lufttrocknung) und Wiederholen des Verfahrens nach Bedarf. HINWEIS: Alle Spektren wurden auf dem Reflektor-Positiv-Modus erhalten. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. RNA Strukturanalyse über CD <ol><li> Vorbereitung von Lösungen für CD. <ol><li> 0,25 ml, enthaltend die modifizierte RNA [3 μM], NaCl [10 mM], Natriumphosphatpuffer [10 mM, pH 7,2] und MgCl 2 [5 mM]. Die Probe ist bereit für die Analyse, wie es ist, besonders wenn sie einen unimolekularen Übergang darstellt. </li><li> Wenn es darum geht, Duplexstrukturen oder bimolekulare Übergänge zu analysieren, fügen Sie zu diesem Zeitpunkt Komplement (1 Moläquivalent, falls zutreffend) hinzu oder fahren Sie mit dem folgenden Schritt fort. </li><li> Legen Sie die Probe auf einen Hitzeblock, der auf 90 ° C vorgeheizt ist, und schalten Sie die Hitze ab, um die langsame Abkühlung auf Raumtemperatur (typischerweise 2 - 4 h) zu kontrollieren. </li></ol></li><li> Spectra-Akquisition <ol><li> Eine Blindlösung (NaCl 10 mM, Natriumphosphat 10 mM pH 7,3, MgCl 2 5 mM), Transfer tEine Mikroküvette (1 cm Pfadlänge, 250 μl Mindestvolumen) und auf eine Halteposition des Probenwechslers innerhalb des Gerätes stellen. </li><li> Übertragen Sie die Probe, die RNA enthält, in eine andere Mikroküvette und Position in Probenwechsler. Wenn Sie einen thermischen Denaturierungsübergang messen, fügen Sie vorsichtig ein Ölbett hinzu, ohne die wässrige Schicht zu stören und die Kappe der Küvette mit einem Teflonband zu sichern. </li><li> Öffnen Sie den Stickstofftank, um einen Durchfluss zu erzielen, der den an dem Gerät befindlichen Luftschwimmer nach ca. 40. Kühler einschalten. </li><li> Schalten Sie das Instrument ein und öffnen Sie das Software- Spectra Manager- Symbol und öffnen Sie dann das Erfassungsfenster Spectra Measurement . </li><li> Spülen Sie das Instrument mit Stickstoff für 5 Minuten vor dem Erwerb. </li><li> Erfassen Sie die Spektren mit den folgenden Parametern Messen Sie&gt; Parameter und stellen Sie die Parameter wie folgt ein: <ol><li> Wählen Sie unter Allgemein : Scan 200-350 nm; Kanäle CD und HT: DatenTonhöhe bei 0,1 nm; Abtastgeschwindigkeit bei 100 nm / min; Bandbreite bei 1 nm; Anzahl der Akkumulationen bei 5. </li><li> Unter Zelleneinheit wählen Sie 20 ° C. Unter Kontrolle wählen Sie Shutter wird automatisch geöffnet und geschlossen. Unter Information wählen Sie den Namen, die Konzentration, den Betreiber. </li><li> Klicken Sie unter Daten auf den gewünschten Ordner. Klicken Sie auf OK . </li></ol></li><li> Erfassen Sie die Spektren Maßnahme&gt; Probenmessung, identifizieren Sie die Position (en) der Küvetten im Probenwechsler 1-6 entsprechend, klicken Sie auf OK . </li></ol></li><li> Bei einem thermischen Denaturierungsübergang: <ol><li> Schließen Akquisitionssoftware Datei&gt; Beenden und Öffnen eines neuen Programms Variable Temperaturmessung&gt; Messen&gt; Parameter . </li><li> Tragen Sie die folgenden Parameter auf, um einen thermischen Übergang aufzuzeichnen, der wie gewünscht eingestellt werden kann: <ol><li> Unter Temperatur wählen Sie Starttemp .: 4 ° C; Intervall: 0,2; TaRget: 90 ° C; Gradienten: 1 ° C / min; Warten 0 s. Wählen Sie unter Start / Ende die Option Startbedingung &amp; Endbedingung wie gewünscht aus. </li><li> Wählen Sie unter Allgemein 3 Kanäle, CD / HT / Abs; Bandbreite: 1 nm; Wellenlänge: 270 nm (oder nach Wunsch). Wählen Sie unter Steuerung keine. Unter Information wählen Sie Name, Konzentration, Operator. </li><li> Klicken Sie unter Daten auf den gewünschten Ordner. Klicken Sie auf OK . </li></ol></li><li> Kühlen Sie die Proben auf 4 ° C und warten Sie 5 min bei dieser Temperatur, bevor Sie eine Spektralmessung erhalten. </li></ol></li><li> Datenaufarbeitung für Spektren. <ol><li> Verwenden Sie die Funktion auf der Software, subtrahieren Sie das Blindspektrum von der Zielerfassung, um Hintergrundsignale zu berücksichtigen, die sich aus dem verwendeten Puffersystem ergeben: Spectra Analysis&gt; File&gt; Open . </li><li> Sobald eine leere Datei und eine Spektren-Datei geöffnet wurden, ziehen Sie Ansicht 2 unter Ansicht 1 (auf der linken Seite des Bildschirms). </li><li> Klicken Sie auf PrOcessing&gt; subtraktion&gt; OK oder tausche Daten&gt; OK . </li><li> Extrahieren von Daten als ASCII-Datei: Datei&gt; Exportieren und ASCII auswählen. </li><li> Verwenden Sie Software, um das entsprechende Spektrum zu zeichnen. Das Glätten von Daten ist optional, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis niedriger ist als erwartet. Diese Transformation kann durch Anwenden der Glättungsdatenoption angewendet werden. </li></ol></li><li> Datenaufarbeitung für thermische Denaturierungsübergänge. <ol><li> Extrahieren Sie Daten aus der JASCO-Datei als ASCII-Datei. </li><li> Zeichnen Sie die Elliptizität Punkte als Funktion der Temperatur. Typischerweise ist eine Glättung der Daten abhängig von der zu untersuchenden Wellenlänge erforderlich. In einigen Fällen zeigte die Verwendung der Wellenlänge bei 210 nm größere Variationen zwischen den Plots, die eine Glättung erforderten. Je nach Probe und Konzentrationen wurde jedoch eine Anzahl von Berechnungen unter Verwendung der Rohdaten durchgeführt. </li><li> Zur Berechnung der thermischen HöhleAturationsübergänge (T m ), erhalten eine erste Ableitung der Kurve. Die Maxima oder Minima waren ein Hinweis auf diesen Parameter. Wie im vorherigen Schritt, einige Fälle erforderten Glättung der Daten, um den genauesten Wert zu erhalten. HINWEIS: Experimente wurden typischerweise dreifach durchgeführt, was zu der entsprechenden Durchschnitts- und Standardabweichung für die Messung führte. </li></ol></li></ol>

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	<li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+of+oligodeoxypyrimidines+on+a+polymer+support.">The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support.</a> Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).</li><li>Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxynucleoside+phosphoramidites-A+new+class+of+key+intermediates+for+deoxypolynucleotides.">Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides.</a> Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).</li><li>Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+synthesis+machines:+DNA+Chemistry+and+its+uses.">Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses.</a> Science. 230 (4723), 281-285 (1985).</li><li>Nguyen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+Thermal+Stability,+Biophysical+Properties,+and+Molecular+Modeling+of+Oligonucleotides+of+RNA+Containing+2'-O-2-Thiophenylmethyl+Groups.">Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups.</a> J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).</li><li>El-Sagheer, A. H., Brown, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+with+DNA.">Click chemistry with DNA.</a> Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).</li><li>Puffer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Fluoro+pyrimidines:+labels+to+probe+DNA+and+RNA+secondary+structures+by+1D+19F+NMR+spectroscopy.">5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).</li><li>Wan, W. B., Seth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medicinal+chemistry+of+therapeutic+oligonucleotides.">The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides.</a> J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).</li><li>Zhou, C., Greenberg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+by+histone+radicals+in+nucleosome+core+particles.">DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles.</a> J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-Induced+proton-coupled+electron+transfer+in+cyclic+DNA+miniduplexes.">UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes.</a> J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).</li><li>Anosova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+diversity+of+artificial+genetic+polymers.">The structural diversity of artificial genetic polymers.</a> Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).</li><li>Riml, C., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+5-Hydroxymethylcytidine-+and+5-Hydroxymethyl-uridine-Modified+RNA.">Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA.</a> Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).</li><li>Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+Two+Strategies+for+Mixed-Sequence+Recognition+of+Double-Stranded+DNA:+Pseudocomplementary+Invader+Probes.">Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes.</a> J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).</li><li>Beaucage, S. L., Iyer, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+oligonucleotides+by+the+phosphoramidite+approach.">Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach.</a> Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).</li><li>Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Sch&#228;rer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+incorporation+of+N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene+(dG-AAF)+into+oligonucleotides+using+modified+'ultra-mild'+DNA+synthesis.">Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis.</a> Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).</li><li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+a+very+long+oligoribonucleotide+with+2-cyanoethoxymethyl+(CEM)+as+the+2'-O.-protecting+group:+structural+identification+and+biological+activity+of+a+synthetic+110mer+precursor-microRNA+candidate.">Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate.</a> Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).</li><li>Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+properties,+thermal+stability+and+functional+impact+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+on+oligonucleotides+of+RNA+-+a+study+of+duplex,+hairpins+and+the+aptamer+for+preQ1+as+models.">Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models.</a> Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).</li><li>Ranjbar, B., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+dichroism+techniques:+Biomolecular+and+nanostructural+analyses+-+A+review.">Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review.</a> Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).</li><li>Mergny, J. -. L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thermal+melting+curves.">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li><li>Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraplex+formation+of+a+guanine-containing+nonameric+DNA+fragment.">Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment.</a> Science. 250 (4980), 543-546 (1990).</li><li>Virgilio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine+residues+in+the+thrombin+binding+aptamer:+Investigating+anticoagulant+activity+by+making+a+tiny+chemical+modification.">5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification.</a> CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).</li><li>Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+properties+and+thermal+stability+of+oligonucleotides+of+RNA+containing+7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine.">Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine.</a> Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).</li><li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. 14, 173-185 (1987).</li><li>Markham, N. R., Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNAFold:+software+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization.">UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization.</a> Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).</li><li>Breslow, R., Huang, D. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+metal+ions+including+Mg2++and+lanthanides+on+the+cleavage+of+ribonucleotides+and+RNA+model+compounds.">Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).</li><li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+a+ribonuclease-free+environment.">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).</li><li>AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-enzymatic+RNA+promoted+by+the+combined+catalytic+activity+of+buffers+and+magnesium+ions.">Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions.</a> Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).</li><li>Farrell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, 45-80 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Absicht dieses Manuskripts dient als Leitfaden für Forscher auf dem Gebiet, Anfänger oder Experte, um die Synthese von Oligonukleotiden von DNA oder RNA erfolgreich zu erreichen oder zu verstärken. Die beschriebene Methodik konzentriert sich auf die Verwendung der Festphasensynthese unter Verwendung eines automatisierten DNA / RNA-Synthesizers über Standard-Phosphoramidit-Chemie. Der Bericht beschreibt eine schrittweise Darstellung der Synthese, Reinigung und Charakterisierung von RNA-Dodecamern. Darüber hinaus wird die Verwendung von CD verwendet, um sekundäre Strukturmotive und thermische Denaturierungsübergänge zu identifizieren. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Arbeit an andere Umstände angepasst werden kann, dh verschiedene Marken von Geräten, Modifikationen, Schutzgruppen und / oder Reagenzien in der Festphasensynthese. Daher kann eine Verbesserung beim Ändern eines oder mehrerer der vielen Parameter, die an diesem Verfahren beteiligt sind, oder durch Anpassungen der Reaktionsbedingungen erreicht werden. ichZusätzlich wird die detaillierte strukturelle Analyse, die hierin (über CD) bereitgestellt wird, voraussichtlich einen alternativen Ansatz für Forscher in diesem Bereich bieten, wobei typischerweise analoge Analysen über UV-vis durchgeführt werden. Die Berechnungen zur Bestimmung der Massen der Phosphoramidite für die Festphasensynthese basierten auf den nachstehend gezeigten Sequenzen, und die vier Oligonukleotide wurden im gleichen Lauf hergestellt und gereinigt (unterstrichene Positionen belegen die Anwesenheit einer 2&#39;- O- Thiophenylmethyl-Modifikation) . Alle Berechnungen und Werte sind in Tabelle 1 enthalten 1 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39; 2 5 &#39;- [CUA CGG A AU CAU] -3&#39; 3 5 &#39;- [CUA CG G A AU CAU] -3&#39; 4 5 &#39;- [AUG AUU CCG UAG] -3&#39; Vielleicht ist der wichtigste Aspekt bei der Handhabung von RNA auf seine Anfälligkeit gegenüber dem Abbau durch Ribonukleasen und deren eUm einer Hydrolyse in wässrigen Lösungen und in Gegenwart von Metallionen 24 zu unterziehen. So müssen die RNase-freien Bedingungen zu jeder Zeit 25 durchgesetzt werden, wie hier gefolgt: 1) alles Wasser wurde in Gegenwart von Diethylpyrocarbonat (0,1% w / v, DEPC) autoklaviert; 2) alle Glaswaren wurden autoklaviert, in einem Ofen (150 ° C über Nacht) gebacken und mit DEPC-behandeltem Wasser gespült; 3) alle Rohre und Pipettenspitzen wurden von Herstellern in ihrer RNase-freien Form gekauft; 4) Handschuhe wurden zu jeder Zeit verwendet und die Arbeit wurde in einer bestimmten Haube durchgeführt; Und 5) wurden alle Oberflächen und Geräte ständig mit RNase-Dekontaminationslösungen abgewischt, die bei verschiedenen Herstellern erhältlich sind. Alle gereinigten RNAs wurden in kleine Portionen aufgeteilt und bei -20 ° C oder -80 ° C gelagert, abhängig von der Häufigkeit der Verwendung, während ungespaltete oder ungereinigte Harze bei 20 ° C gelagert wurden. Wie wir bereits 16 gezeigt haben , OligonukleotiDes in der hier beschriebenen Weise und in Größen zwischen 10-34 Nukleotiden lang eine höhere Stabilität aufweisen als andere Berichte 26 . Daher wird der Leser auf andere Speicherverfahren bezeichnet , wenn mehr 27 RNAs Handhabung. Die schrittweisen Ausbeuten (berechnet über den Detritylierungsschritt) in der automatisierten Synthese betrugen zwischen 97 und 100% und sind ein Hinweis auf gute Kopplungswirkungsgrade, insbesondere von denen, die modifiziert wurden. Nach der Abspaltung aus dem Harz, der Entschützung und der Reinigung ( über die Gelelektrophorese) wurden die Ausbeuten von 30 - 75% erhalten, die ~ 300 - 750 nmol isolierter Oligonukleotide entsprechen. Die Einfügung der Modifikationen beeinflusste die Gesamtausbeute der RNA-Stränge nicht. Obwohl diese Bereiche als akzeptable Mengen betrachtet werden können, ist die Synthese von Oligonukleotiden größer als ~ 50 Nukleotide (vorherige, unveröffentlichte Daten in unserem Labor) Kann durch schrittweise Erträge unter 98% erheblich beeinflusst werden. So müssen gewisse Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wenn Stränge größer als 50 Nukleotide gewünscht werden, z. B. die Acetonitrilquelle auf höhere Qualität umstellen, die Zeit der Exposition der Phosphoramidite in die Atmosphäre minimieren, das Instrument zur Verdünnung der Phosphoramiditen auf einen Satz programmieren Wert bei der Verwendung neuer Flaschen der kanonischen Phosphoramiditen jedes Mal, verwenden HPLC-Reinigung anstelle der elektrophoretischen Analyse, und / oder verwenden milder Entschützung Bedingungen. Massenspektren (MALDI-TOF MS) für alle Oligonukleotide wurden auf einem ABI 4800 Plus MALDI-TOF / TOF Massenspektrometer im positiven Modus durchgeführt. Alle Proben wurden unter Verwendung des hier beschriebenen Verfahrens hergestellt und Beispiele für die Spektren für ON 1 - 3 sind in 5 gezeigt . Alle Experimente werden typischerweise in Tripli durchgeführtCate Alle Spektren und experimentellen Aufbau wurden auf einem Spektropolarimeter mit einem rechteckigen 6-Zellen-Halter durchgeführt. Alle Glaswaren wurden mit einer RNase-Entfernungslösung gewaschen und sorgfältig mit RNase-freiem Wasser gespült. Alle Proben wurden nach jeder Messung verworfen. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass auf die Hochspannungsspannung aufmerksam zu achten ist (HT ist ein Parameter, der vom Gerät gemessen wird). Dies kann ein Hinweis auf die Sättigung im Signal sein und stellt somit eine Bedrohung für die Genauigkeit und Gültigkeit der Daten dar. Dieser Parameter ist sampleabhängig und sollte so gehalten werden, dass das Signal zu keinem Zeitpunkt über 500 mV geht. Beispiele für CD-Spektren, die vor und nach der Hybridisierung von ON 1 - 3 erhalten wurden, sind in 6 gezeigt . Darüber hinaus erhöht man die Konzentration in den Natriumsalzen (und anderen Puffersystemen) oder mit anderen Puffersystemen, Z. B. HEPES oder MOPS, führt zu einem erhöhten Rauschen unter 220 nm. Da die Bande bei 210 nm von besonderer Bedeutung ist, um der Bildung eines A-Form-Duplexes zu folgen, wurde die maximale Konzentration in Natriumionen auf ~ 10 mM gehalten. Wir zeigen auch, dass die Verwendung von CD die gleichen Parameter wie die aus der Ultraviolett-Spektroskopie erhalten hat. Abschließend beschreiben und veranschaulichen wir das Verfahren zur Synthese, Reinigung und Charakterisierung von modifizierten und unmodifizierten RNA-Oligonukleotiden.

Die Festphasensynthese zur Gewinnung von Oligonukleotiden von DNA / RNA ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das seit den 1970er Jahren 1 , 2 , 3 mit Hilfe von Phosphoramidit-Bausteinen 4 verschiedene Anwendungen in verschiedenen Bereichen bedient hat. Beispiele für seinen breiten Einfluss sind: ihre Auswirkungen auf die Etikettierung ( über Klick-Chemie-Reaktionen) 5 , strukturelle Sondierung 6 und Antisense-Technologien 7 sowie die Aufklärung der biologischen Mechanismen 8 , 9 , Quelle als genetisches Material 10 und die Untersuchung von Verschiedene natürliche und / oder chemische Modifikationen 11 , 12 , unter vielen anderen. Die Modifikation, die wir hier verwenden, stellt den ersten Schritt in unseren Bemühungen dar, RNA-Oligonukleotide zu erhalten, die enthaltenPhotoaktive Sonden, um die zeitliche Kontrolle der Struktur und Funktion dieses wichtigen Biopolymers zu ermöglichen. Die Synthese von RNA-Dodekameraden mit Sequenzen: 5 &#39;- [CUA CG G A AU CAU] -3&#39; / 5 &#39;- [AUG AUU CCG UAG] -3&#39; (unterstrichene Positionen stellen den Einbau einer C2&#39;- O- Thiophenylmethyl-Modifikation dar ) Steht im Mittelpunkt dieser Studie. Die Sequenzen wurden ausgewählt, um die Quantifizierung und Messung von RNA-Strängen als Einzelstränge oder als entsprechende Duplexstrukturen zu ermöglichen (keine anderen Sekundärstrukturen wurden als thermodynamisch stabil vorausgesagt). CD wurde verwendet, um die strukturellen Parameter, dh Duplexbildung und thermische Denaturierungsübergänge, zu etablieren. Synthese Das Gesamtverfahren zur Gewinnung dieser Oligonukleotide ist in Fig. 1 dargestellt und folgt dem schrittweisen Verfahren: automatisierte Festphasensynthese → DeprOtection → Reinigung → Quantifizierung → Charakterisierung. Abbildung 2 zeigt die monomeren Einheiten, die in diesem Verfahren notwendig sind. Die Festphasen - Synthese von RNA ähnlich ist zu der DNA, dass sie basiert auf dem Phosphoramidit - Chemie (Figur 2, links) und die Verwendung von basenlabilen Schutzgruppen für die nukleophile exocyclischen Amine an G, A und C, beispielsweise Acetyl, Benzoyl, Phenoxyacetyl, t- Butyl oder N , N- Dimethylformamid ( Abbildung 2 , rechts). Ein weiterer Aspekt, der in der RNA zu berücksichtigen ist, ist aufgrund des Vorhandenseins der C2&#39;-OH-Gruppe (fehlt in den Desoxyoligonukleotid-Biopolymeren) der zusätzliche Schritt, der für den Schutz und die anschließende Entschützung dieser nukleophilen Position einbezogen werden muss. In dieser Hinsicht sind Silizium-basierte Schutzgruppen aufgrund ihres Potenzials als biorthogonale Reste zu einer attraktiven Strategie geworden (spezifischY in Gegenwart von Fluorid entschützt), wobei die tert- Butyldimethylsilyl- (TBDMS) und Triisopropylsilyloxymethyl (TOM) -Gruppen als beliebte Entscheidungen ( Abbildung 2 , unten links). In dieser Arbeit wurde die automatisierte Synthese auf einem DNA / RNA-Synthesizer durchgeführt, der die Standardphosphoramidit-Chemie verwendet. Die Herstellereinstellungen auf dem Instrument beinhalten einen automatisierten Verdünnungsschritt bei Verwendung der kommerziellen Versionen der Phosphoramidite für DNA oder die Möglichkeit, die vom Benutzer eingestellten Volumina zu verdünnen. Allerdings haben wir beschlossen, den RNA-Phosphoramidit zu wiegen und manuell zu verdünnen, wobei: 1) der Preis der kanonischen Phosphoramidite der RNA höher ist (bis zu 50-mal teurer in einigen Fällen); 2) die modifizierten Phosphoramidite werden oft in geringen Mengen erhalten; Und 3) die Menge des verschwendeten Materials bei Verwendung eines automatisierten Verdünnungsschrittes (vom Hersteller festgelegt) ist groß. Darüber hinaus verwendeten wir: 1) handelsübliche feste Träger(Z. B. CPG), die eine geschützte Nukleobase enthält, um als das 3&#39;-Ende zu funktionieren; Und 2) kommerzielle Phosphoramidite (kanonische Nukleobasen), die mit einer TBDMS-Gruppe an der C2&#39;- O- Position geschützt sind. Die detaillierte Liste der Syntheseschritte ist in Abbildung 3 und Tabelle 1 zusammen mit einer weiteren Beschreibung und Kommentaren für Schritte, die für die RNA-Synthese angepasst wurden, bereitgestellt. Weiterhin veranschaulicht Fig. 4 die schrittweisen Ausbeuten, die für jeden Schritt nach Auswahl der Option &quot;Trityl-Monitor&quot; beobachtet werden, die das aus jedem Detritylierungsschritt freigesetzte Trityl-Kation quantifiziert. Es ist bemerkenswert, dass typischerweise nach unserer Erfahrung der limitierende Faktor das Phosphoramidit, das die gewünschte Modifikation enthielt, erhielt. Das heißt, die Entwicklung einer synthetischen Methodik, die den Einbau von Modifikationen an ausgewählten Standorten ermöglicht. In diesem Bericht konzentrieren wir uns auf dieEinarbeitung eines modifizierten Nukleotids, für das wir die entsprechende Synthesemethode, die C2&#39;- O- Thiophenylmethylgruppe, etabliert haben. Diese Gruppe ist klein und beeinflusst die Festphasensynthese in keiner Weise. Da der Einbau dieser Gruppe in Oligonukleotide von RNA beschrieben wurde, werden zusammen mit den strukturellen und thermodynamischen Parametern 4 keine Aspekte der organischen Synthese, die zu den modifizierten Phosphoramiditen führt, beschrieben. Entschützung, Reinigung und Charakterisierung Die Entschützung der exocyclischen Amine und ß-Cyanoethylgruppen erfolgt im gleichen Schritt wie die der Spaltung aus dem CPG-Harz. Wir nutzten die üblicherweise verwendeten Bedingungen des Erhitzens des erhaltenen Harzes in Gegenwart einer wäßrigen AMA-Lösung, gefolgt von einer Spaltung der C2&#39;- O- Silylgruppen in Gegenwart von Fluoridionen und anschließender Reinigung über GelElektrophorese Während diese in vielen Fällen zu Standardbedingungen geworden sind, können Modifikationen, die gegenüber basischen Bedingungen oder Fluoridionen labil sind, mildere Bedingungen 13 , 14 , z. B. Methanol / Kaliumcarbonat (MeOH / K 2 CO 3 ) oder Butylamin erfordern. So ist ein anderer Satz von Schutzgruppen an den entsprechenden Phosphoramiditen notwendig. Darüber hinaus wählten wir die Elektrophorese als bevorzugte Alternative zur Reinigung der entschützten Oligomere aufgrund unserer bisherigen Erfahrung mit dieser Methode und dem Mangel an anderen Instrumenten. Jedoch kann HPLC alternativ als eine effektive Methode 15 verwendet werden. Die Charakterisierung der gereinigten Oligonukleotide erfolgte mittels Massenspektrometrie, matrixunterstützter Laserdesorption / Ionisationszeit des Fluges (MALDI-TOF) unter Verwendung eines gemeldeten Verfahrens durch unsere Gruppe 16 . Strukturelle Charakterisierung und ther<html> Die Stabilität der erhaltenen Duplexe erfolgte über CD. Speziell verwenden wir CD, um die thermischen Denaturierungsübergänge von modifizierten und unmodifizierten Oligonukleotiden von RNA zu bestimmen, indem man die Abnahme der Elliptizität des Bandes bei ca. 270 nm sowie das Verschwinden des Bandes (mit negativer Elliptizität) mit einem λ max bei 210 nm. Ein Spektralvergleich vor und nach der Hybridisierung wird zur Veranschaulichung ihrer Unterschiede und zur Validierung der eingesetzten Methodik gegeben. Die Verwendung von CD wird bei der Bestimmung von Strukturmotiven in Nukleinsäuren und Aminosäuren 17 weithin akzeptiert und kann daher als Werkzeug zur Bestimmung verschiedener struktureller und thermodynamischer Parameter verwendet werden 18 ; Allerdings gibt es nicht viele Beispiele, wo die Technik verwendet wird, um thermische Denaturierungsübergänge zu bewerten. In einigen Fällen handelt es sich um die Bestimmung von thermischen Stabilitäten auf DNA, die G-Quadruplexe enthältAss = &quot;xref&quot;&gt; 19 , 20 oder in Duplexen und Haarnadeln der RNA 21 . Dieser Bericht beabsichtigt, den nicht-fachkundigen Leser oder Betrachter mit einer Reihe von Werkzeugen zur Verfügung zu stellen, die einen reibungslosen Start in diese Art von Forschung ermöglichen. Es wird dazu dienen, mit Methoden und Techniken in anderen Forschungslaboratorien, die in diesem spannenden Zweig der Wissenschaft beteiligt sind, zu verbessern und zu vergleichen. Der Inhalt in diesem Bericht ergänzt die vorhandenen Protokolle dieser Technologie aus verschiedenen Quellen und bereichert und erleichtert die Erfahrung mit einer visuellen Hilfe für jeden Schritt.

<table><tbody><tr><td>AbsolveTM</td><td>PerkinElmer</td><td>6NE9711</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing</td><td>Fisher BioReagents</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide, 99+%</td><td>ACROS Organics</td><td>164850025</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride 98+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium citrate, dibasic 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Fluoride&amp;nbsp; 98.0%, ACS grade</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide 28 - 30% in water, ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>1336-21-6</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>ACROS Organics</td><td>1444</td><td></td></tr><tr><td>Argon-ultra high purity</td><td>&amp;nbsp;Airgas</td><td>7440-37-1</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide Ultra pure</td><td>VWR-Amresco</td><td>172</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-1</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate, 97%</td><td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous, histological grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2%</td><td>Fisher Chemical</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Formamide&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid, 36.5 - 38.0%, Certified ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, 99.9%,&amp;nbsp; HPLC Grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Methylamine 40% in water</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74-89-5</td><td></td></tr><tr><td>1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5%</td><td>Aldrich</td><td>872-50-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm)&amp;nbsp;</td><td>MDS SCIEX</td><td>1020157</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0%</td><td>Sigma</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;rsquo;,4&amp;rsquo; Triethylamine, 99+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>121-44-8</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>761</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine trihydrofluoride, 98%</td><td>Aldrich</td><td>73602-61-6</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid, 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>6&amp;rsquo;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-3</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Fisher Scientific</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for the RNA synthesis:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane</td><td>Glen Research</td><td>&amp;nbsp;40-4140-57</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride</td><td>Glen Research</td><td>40-4110-52</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF</td><td>Glen Research</td><td>40-4120-52</td><td></td></tr><tr><td>Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile</td><td>Glen Research</td><td>&amp;nbsp;30-3140-52</td><td></td></tr><tr><td>Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water</td><td>Glen Research</td><td>40-4330-52</td><td></td></tr><tr><td>U-RNA-CPG</td><td>Glen Research</td><td>20-3330-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-RNA-CPG&amp;nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>20-3324-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-CE Phosphoramidite&amp;nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3025-xx</td><td></td></tr><tr><td>U-CE Phosphoramidite</td><td>Glen Research</td><td>10-3030-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-C-CE Phosphoramidite</td><td>Glen Research</td><td>10-3015-xx</td><td></td></tr><tr><td>Bz-A-CE Phosphoramidite&amp;nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3003-xx</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of rna containing a 2'-o-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism

Die Festphasensynthese wurde verwendet, um kanonische und modifizierte Polymere von Nukleinsäuren, insbesondere von DNA oder RNA, zu erhalten, die es zu einer populären Methodik für Anwendungen in verschiedenen Bereichen und für verschiedene Forschungszwecke gemacht hat. Das hier beschriebene Verfahren konzentriert sich auf die Synthese, Reinigung und Charakterisierung von Dodecamern von RNA 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39; mit null, einer oder zwei Modifikationen, die sich an der C2&#39;- O- Position befinden. Die Sonden basieren auf 2-Thiophenylmethylgruppen, die über Standard-organische Synthese in RNA-Nukleotide eingebaut und über ihre jeweiligen Phosphoramidite in die entsprechenden Oligonukleotide eingeführt werden. Dieser Bericht nutzt die Phosphoramidit-Chemie über die vier kanonischen Nukleobasen (Uridin (U), Cytosin (C), Guanosin (G), Adenosin (A)) sowie 2-Thiophenylmethyl-funktionalisierte Nukleotide, modifiziert am 2&#39;- O- Position; Allerdings ist die Methodik für eine große varDie im Laufe der Jahre entwickelt wurden. Die Oligonukleotide wurden auf einem kontrollierten Porenglas (CPG) -Träger, gefolgt von einer Spaltung aus dem Harz und einer Entschützung unter Standardbedingungen, dh einem Gemisch aus Ammoniak und Methylamin (AMA), gefolgt von Fluorwasserstoff / Triethylamin / N-Methylpyrrolidinon, synthetisiert. Die entsprechenden Oligonukleotide wurden über Polyacrylamid-Elektrophorese (20% Denaturierung) gereinigt, gefolgt von Elution, Entsalzung und Isolierung über Umkehrphasenchromatographie (Sep-pak, C 18- Säule). Quantifizierungs- und Strukturparameter wurden mittels Ultraviolett-sichtbare (UV-vis) bzw. zirkuläre Dichroismus (CD) photometrische Analyse beurteilt. Dieser Bericht zielt darauf ab, als Ressource und Führer für Anfänger und Experten Forscher interessiert, um in diesem Bereich zu dienen dienen. Es wird erwartet, dass es als ein work-in-progress dienen, wie neue Technologien und Methoden entwickelt werden. Die Beschreibung der Methoden und Techniken innerhalb von ThiS Dokument entspricht einem DNA / RNA Synthesizer (renoviert und im Jahr 2013 gekauft), der Phosphoramidit Chemie verwendet.

Die Synthese von RNA-Dodekameraden, die null, ein oder zwei 2-Thiophenylmethyl-Modifikationen an der C2&#39;- O- Position enthalten, wird zusammen mit ihrer entsprechenden Reinigung und Charakterisierung beschrieben. Weiterhin ist eine detaillierte Beschreibung der Strukturanalyse, die über CD durchgeführt wurde, enthalten. Die vier Stränge der RNA (einschließlich eines Strangs mit einer komplementären Sequenz) wurden durch Festphasensynthese erhalten, worauf eine Reinigungsausbeute zwischen 300 - 700 nmol jedes Oligonukleotids folgte. Die Massenspektrometrie wurde durch Entsalzung von ~ 150 pmol jeder Probe und anschließendes Abscheiden auf einer Platte für die MALDI-TOF-Analyse durchgeführt ( Fig. 5 ). Die Quantifizierung erfolgte mittels Ultraviolett-Photometrieanalyse jeder Lösung, während CD verwendet wurde, um die Bildung von Duplexstrukturen zu identifizieren und ihre entsprechenden T m aufzuzeichnen. Es wird kein klarer Unterschied zwischen kanonischen und modifizierten Oligonukleotiden durch UV-Vis-Spektroskopie beobachtet, ob man einzelsträngige Proben oder Duplexstrukturen vergleicht. Bei der Messung ihrer CD-Spektren werden jedoch geringfügige Veränderungen beobachtet ( Abbildung 6 ). Darüber hinaus zeigten die T m -Messungen der drei Duplexstrukturen einen deutlichen Wert, der auf die durch den Einbau der 2&#39;-O-Thiophenylmethyl-Modifikation induzierte Destabilisierung auf einen der Stränge hindeutet. <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig1.jpg" /> Abbildung 1 : Vorgehensweise, um RNA-Stränge zu erhalten. Festphasen-Zyklus unter Verwendung von CPG als fester Träger und 5-Ethylthiotetrazol als Aktivator: ( i ) Detritylierung; ( Ii ) Kupplung; ( Iii ) Oxidation; ( Iv ) Kappen und neue Zyklen; Um die Korrespondenz zu gebenDing-Oligonukleotid ( v ), das auf dem CPG-Harz getragen wird und alle Schutzgruppen enthält; Und seine anschließende Entschützung in Gegenwart von Base und Fluorid ( vi ), um das endgültige RNA-Oligonukleotid zur weiteren Analyse zu ergeben. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig2.jpg" /> Abbildung 2 : Strukturen von Phosphoramiditen und Schutzgruppen. Die chemische Struktur der Phosphoramidit-haltigen Silicium-basierten C2&#39;- O- Gruppen und basenlabilen Gruppen an den exocyclischen Aminen von A, G und C. Die O- TBDMS-Gruppe wurde in dieser Studie verwendet. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen</a>N dieser Figur. <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig3.jpg" /> Abbildung 3 : Stufenweise Synthese der entsprechenden Oligonukleotide. Der Zyklus wurde wie gezeigt bearbeitet und ein Schlüssel für die verwendeten Codes und Durchflussraten ist rechts dargestellt. Die schrittweise Synthese wurde von der bereitgestellten Software eingefügt. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig4.jpg" /> Abbildung 4 : Darstellung der Ertragsgewinne und Verfolgung von Einzelkupplungen. Das dargestellte Beispiel wurde von der Synthese des Komplements angepasst, um eine typische Oligonukleotidsynthese zu zeigenIst. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig5.jpg" /> Fig. 5 : MS von Oligonukleotiden (ON) 1-3. MALDI-TOF von ON 1 - 3 (von oben nach unten). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig6.jpg" /> Abbildung 6 : CD-Spektren von ein- und doppelsträngiger RNA, kanonisch und modifiziert. CD-Spektren von Proben, die null ( 1 , A), eine ( 2 , B) oder zwei ( <stroNg&gt; 3, C) Modifikationen vor (blau) und nach (roter) Hybridisierung. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/56189/56189table1.jpg" /> Tabelle 1: Berechnung der Phosphoramiditlösungen.

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Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Dieser Artikel liefert ein detailliertes Verfahren zur Festphasensynthese, -reinigung und -charakterisierung von an der C2&#39;- O- Position modifizierten Dodecamern von RNA. UV-vis- und zirkuläre Dichroismus-photometrische Analysen dienen zur Quantifizierung und Charakterisierung von Strukturaspekten, dh Einzelsträngen oder Doppelsträngen.

Protokoll für die Festphasensynthese von Oligomeren der RNA mit einem 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethyl-Modifikation und Charakterisierung über Kreisdichroismus

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

18.9K Aufrufe.  University of Colorado Denver.  Dieser Artikel liefert ein detailliertes Verfahren zur Festphasensynthese, -reinigung und -charakterisierung von an der C2'- O- Position modifizierten Dodecamern von RNA. UV-vis- und zirkuläre Dichroismus-photometrische Analysen dienen zur Quantifizierung und Charakterisierung von Strukturaspekten, dh Einzelsträngen oder Doppelsträngen. 

Serie: Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Forschung

Chemie

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Genetik

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to control gene expression. These regulatory proteins control gene expression either at the level of DNA (transcription) or at the level of RNA (pre-mRNA splicing, polyadenylation, mRNA transport, decay, and translation). Identification of regulatory sequences helps understand not only how a gene is switched on or off, but also which downstream genes are regulated by a particular regulatory protein. Here, we describe a one-step approach that allows saturation mutagenesis of a protein binding site in RNA. It involves doping DNA template with non-wild-type nucleotides within the binding site, synthesis of separate RNAs with each phosphorothioate nucleotide, and isolation of the bound fraction following incubation with protein. Interference from non-wild-type nucleotides results in their preferential exclusion from the protein-bound fraction. This is monitored by gel electrophoresis following selective chemical cleavage with iodine of phosphodiester bonds containing phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis or PTM). This single-step saturation mutagenesis approach is applicable to the characterization of any protein binding site in RNA.

Proteins that bind specific RNA sequences play critical roles in gene expression. Detailed characterization of these binding sites is crucial for our understanding of gene regulation. Here, a single-step approach for saturation mutagenesis of protein-binding sites in RNA is described. This approach is relevant for all protein-binding sites in RNA.

Ein neuartiger Sättigung Mutagenese Ansatz: Einzelschritt Charakterisierung der regulatorischen Protein Bindungsstellen im RNA mit Phosphorthioate

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA polymerase II and co-transcriptional capping and splicing of the precursor RNA to form the mature mRNA. During mRNA synthesis, the RNA polymerase II elongation complex is a target for regulation by a large collection of transcription factors that control its catalytic activity, as well as the capping, splicing, and 3&#8217;-processing enzymes that create the mature mRNA. Because of the inherent complexity of mRNA synthesis, simpler experimental systems enabling isolation and investigation of its various co-transcriptional stages have great utility.
In this article, we describe one such simple experimental system suitable for investigating co-transcriptional RNA capping. This system relies on defined RNA polymerase II elongation complexes assembled from purified polymerase and artificial transcription bubbles. When immobilized via biotinylated DNA, these RNA polymerase II elongation complexes provide an easily manipulable tool for dissecting co-transcriptional RNA capping and mechanisms by which the elongation complex recruits and regulates capping enzyme during co-transcriptional RNA capping. We anticipate this system could be adapted for studying recruitment and/or assembly of proteins or protein complexes with roles in other stages of mRNA maturation coupled to the RNA polymerase II elongation complex.

Here, we describe the assembly of RNA polymerase II (Pol II) elongation complexes requiring only short synthetic DNA and RNA oligonucleotides and purified Pol II. These complexes are useful for studying mechanisms underlying co-transcriptional processing of transcripts associated with the Pol II elongation complex.

Künstliche RNA-Polymerase II-Dehnungskomplexe zur Sezieren von co-transkriptionellen RNA-Verarbeitungsereignissen

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

2D-HELS MS Seq: A General LC-MS-Based Method for Direct and de novo Sequencing of RNA Mixtures with Different Nucleotide Modifications

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a complementary DNA (cDNA) intermediate. However, such approaches are rarely applied as a de novo RNA sequencing method, but used mainly as a tool that can assist in quality assurance for confirming known sequences of purified single-stranded RNA samples. Recently, we developed&#160;a direct RNA sequencing method by integrating a 2-dimensional mass-retention time hydrophobic end-labeling strategy into MS-based sequencing (2D-HELS MS Seq). This method is capable of accurately sequencing single RNA sequences as well as mixtures containing up to 12 distinct RNA sequences. In addition to the four canonical ribonucleotides (A, C, G, and U), the method has the capacity to sequence RNA oligonucleotides containing modified nucleotides. This is possible because the modified nucleobase either has an intrinsically unique mass that can help in its identification and its location in the RNA sequence, or can be converted into a product with a unique mass. In this study, we have used RNA, incorporating two representative modified nucleotides&#160;(pseudouridine (&#936;) and 5-methylcytosine (m5C)), to illustrate the application of the method for the de novo sequencing of a single RNA oligonucleotide&#160;as well as a mixture of RNA oligonucleotides, each with a different sequence and/or modified nucleotides. The procedures and protocols described here to sequence these model RNAs will be applicable to other short RNA samples (&#60;35 nt) when using a standard high-resolution LC-MS system, and can also be used for&#160;sequence verification of modified therapeutic RNA oligonucleotides.&#160;In the future, with the development of more robust algorithms and with better instruments, this method could allow sequencing of more complex biological samples.&#160;

<meta charset="utf8"></head><body>2D-HELS MS Seq: Eine allgemeine LC-MS-basierte Methode zur direkten und de novo Sequenzierung von RNA-Gemischen mit unterschiedlichen Nukleotidmodifikationen

Here, we describe a detailed protocol for an LC-MS-based sequencing method that can be used as a direct method to sequence short RNA (&#60;35 nt per run) without a cDNA intermediate, and as a general method to sequence different nucleotide modifications in a single study at single-base precision.

2D-HELS MS Seq: Eine allgemeine LC-MS-basierte Methode zur direkten und de novo Sequenzierung von RNA-Gemischen mit unterschiedlichen Nukleotidmodifikationen

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a ...

DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2&#8217;-O-Methylation

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in higher eukaryotes may promiscuously recognize other RNA species and 2&#8217;-O-methylate multiple targets. Here, we provide step-by-step guide for the fast and non-expensive analysis of the site-specific 2&#8217;-O-methylation using a well-established method employing short DNA oligonucleotides called DNAzymes. These DNA fragments contain catalytic sequences which cleave RNA at specific consensus positions, as well as variable homology arms directing DNAzyme to its RNA targets. DNAzyme activity is inhibited by 2-&#8217;O-methylation of the nucleotide adjacent to the cleavage site in the RNA. Thus, DNAzymes, limited only by the consensus of the cleaved sequence, are perfect tools for the quick analysis of snoRNA-mediated RNA 2&#8217;-O-methylation. We analyzed snoRNA snR13- and snR47-guided 2&#8217;-O-methylation of 25S ribosomal RNA in Saccharomyces cerevisiae to demonstrate the simplicity of the technique and to provide a detailed protocol for the DNAzyme-dependent assay.

Here we present a protocol for DNAzyme-dependent cleavage of RNA. This enables fast and site-dependent analysis of RNA 2&#8217;-O-methylation. This approach can be used for the preliminary or major assessment of snoRNA activity.

DNAzyme-abhängige Analyse der rRNA 2'-O-Methylierung

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in ...

Entwicklungsbiologie

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers and modulators. While these dynamic states remain hidden to most structural methods, R1&#961; relaxation dispersion (RD) spectroscopy allows the study of conformational dynamics in the micro- to millisecond regime at atomic resolution. The use of 1H as the observed nucleus further expands the time regime covered and gives direct access to hydrogen bonds and base pairing.
The challenging steps in such a study are high-purity and high-yield sample preparation, potentially 13C- and 15N-labeled, as well as setup of experiments and fitting of data to extract population, exchange rate, and secondary structure of the previously invisible state. This protocol provides crucial hands-on steps in sample preparation to ensure the preparation of a suitable RNA sample and setup of 1H R1&#961; experiments with both isotopically labeled and unlabeled RNA samples.

We present a protocol to measure micro- to millisecond dynamics on 13C/15N-labeled and unlabeled RNA with 1H R1&#961; relaxation dispersion nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. The focus of this protocol lies in high-purity sample preparation and setup of NMR experiments.

Praktische Aspekte der Probenvorbereitung und des Aufbaus von 1H R1ρ Relaxationsdispersionsexperimenten von RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Biochemie

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Protokoll für die Festphasensynthese von Oligomeren der RNA mit einem 2'-

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Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung

Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren

Ein neuartiger Sättigung Mutagenese Ansatz: Einzelschritt Charakterisierung der regulatorischen Protein Bindungsstellen im RNA mit Phosphorthioate

Künstliche RNA-Polymerase II-Dehnungskomplexe zur Sezieren von co-transkriptionellen RNA-Verarbeitungsereignissen

Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs

2D-HELS MS Seq: Eine allgemeine LC-MS-basierte Methode zur direkten und de novo Sequenzierung von RNA-Gemischen mit unterschiedlichen Nukleotidmodifikationen

2D-HELS MS Seq: Eine allgemeine LC-MS-basierte Methode zur direkten und de novo Sequenzierung von RNA-Gemischen mit unterschiedlichen Nukleotidmodifikationen

DNAzyme-abhängige Analyse der rRNA 2'-O-Methylierung

Praktische Aspekte der Probenvorbereitung und des Aufbaus von ¹H R_1ρ Relaxationsdispersionsexperimenten von RNA

Generierung von RNA / DNA-Hybride in genomischer DNA durch Transformation mit RNA-haltigen Oligonukleotiden