Dieses Protokoll liefert intakte Herzschrittmacherregionen des Nierenbeckens, des glatten Muskelorgans in der Niere, das Urin in den Harnleiter und in die Blase pumpt. Im Gegensatz zur Isolierung von Zellen aus dem Nierenbecken bietet dieser Ansatz intakte In-situ-Umgebungen von renalen Beckenschrittmacherregionen und eine physiologischere Vorbereitung für die Untersuchung der renalen Beckenschrittmacherei. Eine Person, die diese Technik noch nie durchgeführt hat, kann Schwierigkeiten haben, einheitliche Abschnitte zu schneiden.
Ein Erstbenutzer muss sicherstellen, dass die Niere auf der Vibrationsstufe eben ist und den Schneidprozess nicht beschleunigt. Mit einer internen Gewebepinzette und einer inneren Dissektionsschere den Darm einklemmen und von der Bauchdecke wegheben. Schneiden Sie gleichzeitig die Unterseite des Darms am proximalen Zwölffingerdarm und am distalen Dickdarm vom Körper frei, um Zugang zum retroperitonealen Raum zu erhalten, der die Nieren enthält.
Das distale Ende des Harnleiters mit einer Gewebezette vorsichtig einklemmen und anheben. Schneiden Sie mit der Sezierschere unter dem eingeklemmten Harnleiter in Richtung Niere, bis er sich vom umgebenden Bindegewebe befreit hat. Sobald die Nieren freigelegt sind, extrahieren Sie sie einzeln.
Füllen Sie eine mit Silikonelastomer beschichtete Schale mit eiskalter KRB-Lösung. Übertragen Sie die Niere auf die Sezierschale und stellen Sie sicher, dass sie vollständig untergetaucht ist. Verwenden Sie eine feine Federschere und eine innere Zette, um Fettgewebe von der Basis der Niere zu entfernen, um das distale Nierenbecken oder RP und den proximalen Harnleiter freizulegen.
Entfernen Sie den proximalen Harnleiter und einen Teil des distalen RP mit einer feinen Federschere und einer Zette von der Basis. Stechen Sie die äußere Nierenkapsel mit einer feinen Spitzenzette durch und angeln Sie die Spitzen vom Nierenkörper weg. Mit einer Zette mit jeder Hand die losen Enden der Kapsel zusammendrücken und auseinander schälen, bis die verbleibende Nierenkapselmembran vollständig entfernt ist.
Setzen Sie eine Rasierklinge in den Klingenhalter des Vibratominstruments ein und stellen Sie den Klingenabstandswinkel auf ca. 18 Grad ein. Passen Sie die Klingenparameter wie im Textmanuskript erwähnt an und stellen Sie sicher, dass die Nierenschnittdicke 150 Mikrometer nicht überschreitet, was sich negativ auf Calciumionen-Bildgebungsexperimente auswirken würde. Verwenden Sie eine stumpfe Zette, um die vorbereitete Niere vorsichtig zu greifen und aus der eiskalten KRB-Lösung zu entfernen.
Legen Sie die Niere sofort für etwa zwei bis vier Sekunden auf saugfähiges Papier, um überschüssige äußere Feuchtigkeit zu entfernen. Rollen Sie die Niere vorsichtig über das saugfähige Papier, um sicherzustellen, dass alle Seiten des Parenchyms getrocknet sind, so dass eine optimale Haftung der Niere im Vibrationsstadium besteht. Tragen Sie sofort eine dünne Schicht Cyanacrylatkleber auf die Basis der Vibratomprobenplatte auf und verwenden Sie eine stumpfe Zinnen, um den Nierenleiter mit der Seite nach unten auf den mit Klebstoff bedeckten Bereich zu legen.
Mit dem flachen Rand der Zette etwa 10 bis 20 Sekunden lang vorsichtig Druck auf die Oberseite der Niere ausüben, um den Kleber zu trocknen. Befestige die Probenplatte fest an der Unterseite der Pufferschale und stelle den Füllstand der KRB-Lösung so ein, dass die Oberseite der Niere vollständig eingetaucht ist. Für die automatische Vibratomschnitte wählen Sie die Start- und Endpositionen des Vibratomblattschneidzyklus 0,5 bis 1 Zentimeter von der Niere entfernt, um sicherzustellen, dass die gesamte Nierenebene geschnitten wird.
Starten Sie den automatischen Schneidevorgang und stellen Sie sicher, dass die Klinge Kontakt mit der Niere hat. Sammeln Sie mit einer Zette Abschnitte, die von der Niere befreit sind, und übertragen Sie sie sofort auf einzelne Vertiefungen. Setzen Sie das Schnittprotokoll fort und verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um PKJ-Regionen in den Nierenscheiben zu identifizieren, bis die PKJ-Regionen sichtbarer werden.
Füllen Sie eine mit Silikonelastomer beschichtete Bildgebungsschale mit eiskalter KRB-Lösung. Übertragen Sie eine einzelne Nierenscheibe auf die Schüssel. Setzen Sie Minutien-Stifte um die Peripherie einer Nierenscheibe ein, um den Abschnitt an der Basis der Bildgebungsschale zu befestigen.
Stellen Sie die Bildgebungsschale auf die Bühne eines aufrechten Konfokalmikroskops und beginnen Sie sofort mit dem Durchschnässen mit KRB-Lösung. Verwenden Sie ein Wasserimmersionsobjektiv mit geringer Vergrößerung, um die Nierenscheibe zu lokalisieren. Zentrieren Sie das Bildfeld auf Bereichen des Slices, in denen der PKJ vorhanden ist, mithilfe von Landmarken.
Sobald der PKJ lokalisiert ist, verwenden Sie ein Wasserimmersionsobjektiv mit höherer Vergrößerung, um den interessierende Bereich zu vergrößern. Unterscheiden Sie verschiedene Zellen von Interesse in verschiedenen Arten von Kalziumionen-Transientendauern in der PKJ-Wand. Sobald die interessierenden Zellen identifiziert wurden, passen Sie die Laserintensität an, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen, und zeichnen Sie Bilder mit einer zeitlichen Abtastfrequenz zwischen 16 und 32 Hertz auf.
Lichtmikroskopische Aufnahmen ganzer Nierenschnitte zeigen kommentierte Landmarken einer einzelnen PKJ-Region. Mehrere PKJ-Regionen liegen in der Nähe der inneren Medulla und der distalen Niere vor. Die Standorte der PKJ-Nierenarterien und PKJ-Grenzen sind hier dargestellt.
Ein PKJ-Abschnitt einer Maus, die GCaMP in ALPHA-positiven PDGFR-Zellen exprimieren, ist hier dargestellt. Die dünne PKJ-Wand, die zwischen Parenchymgewebe hängt, kann anhand von Landmarken wie der Nierenarteriole unterschieden werden. Die Expression von GCaMP6f in diesem spezifischen transgenen Gewebe ist über die gesamte Breite des PKJ sowohl über die Muskel- als auch über die Adventitialschichten verteilt.
In den PDGFR alpha GCaMP6f positiven Nierenscheiben ist ein Netzwerk von Zellen, das sich typischerweise über die Breite der PKJ-Wand erstreckt, fluoreszierend und zeigt oszillierende Kalziumionentransienten unterschiedlicher Dauer und Frequenz. In SMC GCaMP3-positiven Nierenscheiben ist eine Schicht von GCaMP3-positiven Zellen in der Muskelschicht vorhanden. Eine raumzeitliche Karte zeigt, dass PDGFR-alpha-positive Zellen, die sich in der PKJ adventitia befinden, langzeitige niederfrequente Calciumionentransienten hervorrufen, während SMCs häufiger kalziumionentransienten Transienten mit kürzerer Dauer abfeuerten.
In ähnlicher Weise wurde auch eine Reihe von fluoreszierenden Calciumionensignalen innerhalb und um die herum sammelnden Kanäle und oszillierenden Calciumionentransienten in den SMCs beobachtet. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, dass die Niere während der Vibrationsschnitte so eben wie möglich ist, um sicherzustellen, dass gleichmäßige Nierenscheiben aus dem Block befreit werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Einzelzellisolierung, Immunhistochemie und molekulare Studien durchgeführt werden, um unser Verständnis der Herzschrittmachermechanismen im Nierenbecken zu verbessern.
